本发明涉及减毒类脂a的制备与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
脂多糖(lps)，俗称内毒素，位于革兰氏阴性菌的外膜外侧，并且是该部位的主要组成成分。由类脂a，核心多糖和o抗原三部分组成,，类脂a是脂多糖的活性中心，是引起免疫反应的主要结构。lps可以激发宿主的非特异性免疫。lpsbindingprotein(lbp)将lps运送到细胞表面，在cd14和md-2的帮助下，被细胞表面的受体tolllikereceptor4(tlr4)识别，随后发生了一系列信号传递，最终导致一系列炎症因子的释放。这其中主要有mal-myd88和tram-trif两条信号通路组成，能分别产生不同生物细胞因子，mal-myd88主要诱导产生tnf-α，il-6和il-8，tram主要产生rantes和mcp-1等。
疫苗佐剂就是免疫增强剂，可以在疫苗接种作用过程中起到辅助作用，有助于更好更全面的激发非特异性免疫，使疫苗更好的发挥作用。lps可以引发一系列的炎症因子的释放，而类脂a又是lps的活性中心，所以将类脂a作为疫苗佐剂成为新型疫苗佐剂的重要研究方向。目前被广泛应用的类脂a疫苗佐剂是来自沙门氏菌的单磷酸、六条脂肪酸链类脂a(mpl)，这种由自沙门氏菌突变株产生的mpl，结构与野生型e.coli的类脂a结构有所不同，c1磷酸基团和c3位十四烷基缺失，在c2位脂肪酸链多出十六烷次级脂肪酸链。mpl对通路tlr4-mal-myd88的刺激程度低，对tlr4-tram-trif有有效的刺激，从而mpl可以有效的刺激非特异性免疫，又不会产生过量的炎症因子伤害机体。但是mpl在工业生产和临床应用也有不足之处，如mpl的生产沙门氏菌属于条件致病菌，在进行工业大规模生产有一定风险和应用到兽类疫苗，其次mpl的生产工艺复杂，在生产纯化中对其结构造成破坏等问题。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一类新型的类脂a，其结构如下式ⅰ所示：
本发明第二个目的是提供所述类脂a的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建表达lpxd1基因片段或lpxd2基因片段的重组大肠杆菌；
(2)培养重组大肠杆菌，提取收集类脂a。具体地，利用bligh-dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)悬浮菌体，离心收集下相；下相加入醋酸钠(ph4.5)溶液，沸水浴裂解糖链；然后加入氯仿和甲醇形成bligh-dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，离心，取下相旋蒸，加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)洗出类脂a。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述大肠杆菌是e.colirl25、w3110或hw002。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)，将来自于弗朗西斯菌的lpxd1基因片段或lpxd2基因片段酶切连接质粒puc18，然后转入宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的lpxd1基因片段的核苷酸序列是seqidno:1的序列，lpxd2基因片段的核苷酸序列是seqidno:2的序列。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)收集培养到对数后期的重组大肠杆菌菌体，ddh2o洗涤菌体后用bligh-dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌一段时间、分相，使用bligh-dyer一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入醋酸钠(ph4.5)溶液，超声震荡，沸水浴裂解糖链；冷至室温后加入氯仿和甲醇形成bligh-dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，离心，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发，加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将类脂a洗出。
本发明的第三个目的是提供一种降低大肠杆菌菌体对tlr4通路刺激强度或细胞免疫活性的方法，是在大肠杆菌中通过puc质粒表达了lpxd1基因片段，所述大肠杆菌是w3110或hw002。
本发明的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌及类脂a在疫苗佐剂方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用了非致病菌e.colirl25、w3110和hw002为宿主制备类脂a，拓宽了佐剂临床应用范围。在宿主中分别表达了lpxd1基因片段或lpxd2基因片段对类脂a进行分子改造，然后采用氯仿/甲醇/h2o溶液混合相萃取法，可以有效快速的提取类脂a，相对减少了生产流程和对类脂a结构的破坏。
(2)通过gc-ms和碱水解质谱分析的方法对本发明制备得到的类脂a进行分析，相比未表达lpxd1基因片段或lpxd2基因片段，表达lpxd1基因片段或lpxd2基因片段后菌体类脂a的结构发生改变，e.colirl25/puc-lpxd1的结构改变表现在2和2’位置上的脂肪酸链由单一的c14:3-oh脂肪酸链变成了c14:3-oh、c16:3-oh和c18:3-oh混合存在。e.colirl25/puc-lpxd2的结构改变表现在2和2’位置上的脂肪酸链由单一的c14:3-oh脂肪酸链变成了c14:3-oh和c16:3-oh混合存在。这两种菌株在42℃的培养条件下，对tlr4的信号通路刺激能力降低，对细胞的毒性降低。
(3)在大肠杆菌w3110和hw002中通过puc质粒分别表达了lpxd1基因片段，能够降低w3110和hw002菌体对tlr4通路刺激强度或细胞免疫活性。
总的来说，本发明提供的新型类脂a作为疫苗佐剂，具有更安全性、易于提取制备的优点。
附图说明
图1.菌体e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2类脂a结构质谱分析。
图2.菌体e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2类脂a碱水解后结构质谱分析，a为25％氢氧化铵水解结果，b为0.3m的氢氧化钠的水解图。
图3.菌体e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2类脂a中脂肪酸链的gc-ms分析。
图4.菌体e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2自凝集能力的比较。
图5.菌体e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2对tlr4通路刺激程度的分析。
图6.rl25/puc，rl25/puc-lpxd1和rl25/puc-lpxd2对细胞免疫活性的比较。a为不同菌体不同浓度lps刺激小鼠raw267.4细胞产生的细胞因子的情况，b为不同菌体不同浓度lps刺激人thp-1细胞产生的细胞因子的情况。
图7.lpxd1表达菌株的类脂a结构鉴定。a为w3110/puc和w3110/puc-lpxd1的类脂a的esi/ms分析，b为hw002/puc和hw002/puc-lpxd1的类脂a的esi/ms分析。
图8.lpxd1表达菌株与对照菌株对细胞tlr4通路刺激程度的比较。
图9.lpxd1表达菌株的lps对细胞免疫活性的比较。
具体实施方式
实施例1基因工程菌的构建
查找出lpxd1和lpxd2基因序列。根据lpxd1、lpxd2和puc质粒的核苷酸序列选取酶切位点。设计引物，进行pcr，回收lpxd1和lpxd2基因表达片段。分别酶切表达基因片段和puc18质粒。连接酶切之后的表达基因片段和puc18质粒。通过化学转化的方法将连接好的质粒导入到e.colirl25(e.colirl25的构建方法参见文献：bartlingcm,raetzcr.crystalstructureandacylchainselectivityofescherichiacolilpxd,then-acyltransferaseoflipidabiosynthesis.biochemistry,2009,48(36):8672-8683)、w3110和hw002(e.colihw002的构建方法参见文献：wangx,zhangc,shif,hux.purificationandcharacterizationoflipopolysaccharides.subcellularbiochemistry.2010,53:27–51)菌株中。验证筛选得到含有正确质粒的菌株e.colirl25/puc-lpxd1、e.colirl25/puc-lpxd2、w3110/puc-lpxd1和hw002/puc-lpxd1。
实施例2基因工程菌e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2类脂a的结构分析
1.类脂a的提取方法
类脂a的提取方法采用氯仿/甲醇/h2o溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始od600＝0.02转接到200mllb液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，4000rpm离心30min收集菌体，ddh2o洗涤菌体一次后用bligh-dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)76ml悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27ml12.5mm的醋酸钠(ph4.5)溶液，超声震荡2min，100℃水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30ml氯仿和30ml甲醇配成bligh-dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将lipida洗出。
2.lps的提取方法
lps的提取采用热酚法。将过夜培养的菌液按初始od600＝0.02转接到800mllb液体培养基中，37℃培养12小时后8000rpm离心10min收集菌体，ddh2o洗涤菌体一次后称量菌体湿重，每3g湿菌体溶于10mlddh2o中，68℃预热。加入等体积预热的90％苯酚，68℃剧烈振荡1小时。低温冷却后，4℃，4000rpm离心20分钟，上清液用ddh2o透析三天以去除苯酚，真空冷冻干燥得到lps。
3.类脂a的质谱分析方法
将类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在waterssynaptq-tofmassspectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用esi离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。
质谱结果显示，e.colirl25的m/z的值主要是1796，当在e.colirl25中表达lpxd1时，m/z的值出现了1796、1824、1852、1880、1908一系列的值，当在e.colirl25中表达lpxd2时，m/z的值出现了1796、1824、1852一系列的值。说明了lpxd1和lpxd2的表达使e.colirl25的类脂a结构发生了改变。
4.lps的gc-ms分析
将200μg的lps样品中加入50μl0.2mg/ml的c15(内标)和200μl2m无水酸化甲醇，盖好盖子，置于90℃的加热砖中作用18个小时。冷却到室温，加入200μl饱和氯化钠。加入400μl己烷，涡旋震荡30秒。将经过己烷萃取的上清液转移到gc的进样瓶中，进样，gc分析。
gc-ms分析结果显示，在e.colirl25类脂a中，只存在c14:3-oh一种羟基脂肪酸链，而在e.colirl25/puc-lpxd1类脂a中，存在c14:3-oh、c16:3-oh、c18:3-oh三种羟基脂肪酸链，在e.colirl25/puc-lpxd2类脂a中，存在c14:3-oh和c16:3-oh两种脂肪酸链。gc-ms结果可以得出，lpxd1的表达为类脂a结构中2和2’位置上引入了c14:3-oh、c16:3-oh、c18:3-oh三种羟基脂肪酸链，lpxd2的表达为类脂a结构中2和2’位置上引入了c14:3-oh和c16:3-oh两种羟基脂肪酸链。
5.碱水解分析
将类脂a溶于180μl0.3m的氢氧化钠(25％的氢氧化铵)中，室温降解16个小时，随后加入200μl的氯仿和200μl的甲醇，3000rpm，离心10分钟，取下相，进maldi-tof-ms分析。
当类脂a被完全水解时，类脂a的脂肪酸链只剩下2和2’位置上的两条脂肪酸链，e.colirl25的m/z的值为951，而e.colirl25/puc-lpxd1的m/z的值为主要为979、1007、1035，确定出类脂a结构改变发生在2和2’位置上，所以证明lpxd1的表达使得e.colirl25的类脂a结构在2和2’位置上发生了变化，结合ms分析和gc-ms分析得出，e.colirl25/puc-lpxd1在2和2’位置上存在c14:3-oh、c16:3-oh、c18:3-oh三种羟基脂肪酸链。e.colirl25/puc-lpxd2的m/z的值为主要为979和1007，确定出类脂a结构改变发生在2和2’位置上。所以证明lpxd2的表达使得e.colirl25的类脂a结构在2和2’位置上发生了变化，结合ms分析和gc-ms分析得出，e.colirl25/puc-lpxd1在2和2’位置上存在c14:3-oh和c16:3-oh两种羟基脂肪酸链。
实施例3基因工程菌e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2自凝集能力的变化分析
将过夜培养的菌液按初始od600＝0.02转接到50mllb液体培养基中，37℃，200r/min培养至od600＝2；离心收集菌体，用ph7.4的磷酸缓冲液(pbs)洗涤一次并重悬，重悬控制od600＝2；取10ml到15ml离心管里，静置在4℃环境中，24小时后，取最上方菌液测量od，并通过计算方法(2-菌液上方od600)/2计算出菌体的自凝集能力。
结果如图4所示，比较得出，e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2的自凝集能力比e.colirl25高出2倍左右。
实施例4基因工程菌e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2对tlr4信号通路的刺激强弱分析
hek-bluehtlr4细胞因转染表达了人类tlr4及nf-kb诱导分泌的seap报告基因，能够特异性地识别培养体系中活细菌体表面的lps而分泌蓝色的seap激酶，实时监测lps诱导的tlr4免疫通路的强弱，通过seap显色的深浅指示出菌体对tlr4的刺激能力和对细胞的毒性。吸光值越大，对细胞毒性越大。
结果如图5所示，e.colirl25、e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2在650nm下的吸光值情况为：e.colirl25＞e.colirl25/puc-lpxd2＞e.colirl25/puc-lpxd1，当菌体的浓度为104cfu/ml时，对于hek-bluehtlr4细胞的tlr4的刺激程度相差最大。
上述结果分析说明：e.colirl25/puc-lpxd1和e.colirl25/puc-lpxd2类脂a结构发生变化后，对于细胞的tlr4通路的刺激能力变小，对细胞的毒性降低，而且2和2’位置上的脂肪酸链越长，菌体对于细胞的tlr4通路的刺激能力越小。
实施例5rl25/puc，rl25/puc-lpxd1和rl25/puc-lpxd2对细胞免疫活性的比较
lps的免疫活性主要是通过刺激tlr4通路来发挥作用的，在tlr4后，有mal-myd88和tram-trif两条通路，这两条通路分别对应着不同的细胞因子的产生。由前面的研究发现类脂a在2和2’位置上的脂肪酸链长度的变化，导致了免疫活性的不同，影响对tlr4通路的刺激能力，为了更深入的研究链长对于lps的免疫活性的影响，通过elisa实验，对不同通路的不同种抗生素进行了测定。用纯化后的lps对细胞进行刺激，然后测定细胞因子的量，lps的浓度为：0.1ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。除此之外，同种类脂a对于人和动物的免疫活性也不会完全一致，所以分别用了小鼠细胞raw267.4和人的细胞thp-1进行了测定。
1、rl25/puc，rl25/puc-lpxd1和rl25/puc-lpxd2对raw264.7免疫活性的比较
分别对tlr4下的两条通路对应的不同的细胞因子进行了测定，mal-myd88通路下的il-6和tnf-α，tram-trif通路下的rantes。
测定的结果如图6a所示，从图可以看出，不同菌体不同浓度的lps刺激raw264.7细胞产生不同细胞因子的量的结果，可以发现，总体而言，lps的浓度越高，刺激细胞产生的细胞因子的量越大，但是细胞因子的量并不是一直随着lps的浓度的增加而增加的，当lps的浓度由100ng/ml升至1000ng/ml时，tnf-α的量上升趋势已经不再明显。三种菌体刺激细胞产生的三种细胞因子的量整体上趋势一致，rl25/puc＞rl25/puc-lpxd2＞rl25/puc-lpxd1。而且，rl25/puc与rl25/puc-lpxd2和rl25/puc-lpxd1之间的差异比rl25/puc-lpxd2与rl25/puc-lpxd1之间的差异更加明显。
所以，当类脂a的2和2’位置脂肪酸链的长度发生变化时，类脂a对于raw264.7细胞的免疫活性发生变化，对mal-myd88和tram-trif两条通路都有明显影响，当脂肪酸链变长时，对细胞的免疫活性降低，刺激产生的两条通路对应的细胞因子都明显降低。三株菌刺激raw264.7细胞的免疫活性检测揭示了2和2’位置上脂肪酸链长度对lps的免疫活性的影响，为新型疫苗佐剂的开发提供重要的依据。
2、rl25/puc，rl25/puc-lpxd1和rl25/puc-lpxd2对thp-1细胞免疫活性的比较
三种菌体的lps分别刺激thp-1细胞，然后分别比较tlr4通路下的mal-myd88和tram-trif两条通路产生的细胞因子的量来深入研究三种菌对于thp-1细胞的免疫活性的不同，从而反应类脂a的2和2’位置上的脂肪酸链长度对于其免疫活性的影响。所以测定了mal-myd88通路下的il-8和tnf-α两种细胞因子，tram-trif通路下的rantes细胞因子(图6b)。
图中lps对thp-1细胞的刺激结果发现，类脂a的结构的变化，影响了lps对thp-1细胞的免疫活性。但是不同菌体的lps刺激thp-1细胞产生的不同的细胞因子的差异是不同的，三种菌体的lps刺激thp-1细胞产生的il-8的量的差异最小，刺激thp-1细胞产生的tnf-α的量的差异随着lps的浓度的增大而变大，刺激thp-1细胞产生的rantes的量的差异在lps各个浓度基本一致。所以，类脂a的2和2’位置上的脂肪酸链的长度越长，lps对thp-1细胞的免疫活性越低，对tlr4通路下的mal-myd88和tram-trif两条通路的免疫活性都降低。
实施例6lpxd1在w3110和hw002中的应用探究
1、w3110/puc和w3110/puc-lpxd1类脂a结构鉴定
两种菌体的类脂a的质谱图如图7a所示，w3110/puc的类脂a质谱图中出现了m/z1716和m/z1796两个峰，其中m/z1796所对应的类脂a的结构如图中的结构图所示，m/z1796所对应的类脂a的结构为图中所示的类脂a的结构在提取过程中脱落一个磷酸基；w3110/puc-lpxd1类脂a的质谱图中存在m/z1716，m/z1744，m/z1772，m/z1796，m/z1824，m/z1852，m/z1880，分别对应着在w3110类脂a基础上加长了2和2’脂肪酸链长度的类脂a结构，w3110/puc-lpxd1类脂a结构的2和2’位置上的脂肪酸链种类包括3-oh-c14，3-oh-c16和3-oh-c18。
2、hw002/puc和hw002/puc-lpxd1类脂a结构鉴定
hw002/puc和hw002/puc-lpxd1类脂a的质谱图如图7b所示，hw002/puc出现了m/z1506峰，峰m/z1506对应的结构如图所示，类脂a的结构是在hw001/puc结构的基础上去掉了3’位置上的刺激脂肪酸链；而hw002/puc-lpxd1类脂a的质谱图中出现了m/z1506，m/z1534，m/z1562，m/z1590，m/z1618，各个峰对应的类脂a结构相当于在hw002/puc类脂a结构的基础上加长了2和2’位置处的脂肪酸链，在原有的3-oh-c14的基础上添加了3-oh-c16和3-oh-c18两种脂肪酸链。
3、lpxd1表达菌株与对照菌株对细胞tlr4通路刺激程度的比较
w3110/puc-lpxd1和hw002/puc-lpxd1的类脂a结构在w3110/puc和hw002/puc的基础上加长了2和2’位置上的脂肪酸链的长度，而且对照菌已经是在w3110的基础上进行了改造，这样可以进一步探究脂肪酸链的长度和其他结构特点组合对类脂a的免疫活性的影响，首先我们比较了菌体对于tlr4的刺激能力。
表达菌株和对照菌株对于tlr4通路的刺激能力如图8所示，整体上而言，随着菌体的浓度的提高，菌体对于细胞的tlr4通路的刺激能力是增加的，但是并不是一直增加的，当菌体浓度达到105cfu/ml的时候继续增加菌体的浓度时，菌体对tlr4通路的刺激强度上升的并不是很明显，原因是在细胞量一定的情况下，菌体的浓度达到饱和后对细胞tlr4的刺激能力就不再上升。各个表达菌株对于细胞tlr4通路的刺激能力基本上都低于对应的对照组菌株对于细胞tlr4通路的刺激能力，而且这种差异随着菌体浓度的提高而逐渐明显，到达最大差异后，随着菌体浓度的提高这种差异再逐渐缩小。
w3110/puc与w3110/puc-lpxd1相比较发现，整体来看，w3110/puc对细胞的tlr4通路的刺激能力是高于w3110/puc-lpxd1的，hw002/puc与hw002/puc-lpxd1相比较发现，两种菌对tlr4通路的整体刺激水平都偏低，当菌体浓度为102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml时，刺激液在650nm下的吸光度都低于0.1。当菌体浓度为106cfu/ml时，菌体对细胞tlr4的刺激水平上升，此时，hw002/puc对tlr4的刺激水平和hw002/puc-lpxd1对tlr4的刺激水平有差异，hw002/puc-lpxd1对tlr4的刺激水平大概为hw002/puc对tlr4的刺激水平的70％。当菌体浓度为107cfu/ml时，菌体对细胞tlr4的刺激水平继续上升，此时，hw002/puc对tlr4的刺激水平和hw002/puc-lpxd1对tlr4的刺激水平仍有差异，hw002/puc-lpxd1对tlr4的刺激水平大概为hw002/puc对tlr4的刺激水平的84％。两株菌对细胞tlr4通路刺激程度揭示了2和2’位置上脂肪酸链长度对lps的免疫活性的影响，为新型疫苗佐剂的开发提供重要的依据。
4、lpxd1表达菌株的lps对细胞免疫活性的比较
lps主要通过刺激tlr4通路引发免疫反应，而tlr4下面又存在mal-myd88和tram-trif两条通路，所以为了进一步研究类脂a位置上的2和2’脂肪酸链的长度对于lps免疫活性的影响分别测定了不同菌体lps刺激不同细胞产生的对应不同通路的细胞因子，分别测定了lps刺激下raw264.7细胞和thp-1细胞的tram-trif通路下的rantes和mal-myd88通路下的tnf-α两种细胞因子。
结果如图9所示，整体而言，lpxd1的表达菌株的lps刺激thp-1细胞和raw264.7细胞产生的细胞因子低于对照菌株。
w3110/puc和w3110/puc-lpxd1的lps刺激不同细胞产生的不同细胞因子的量如图所示。对thp-1细胞的刺激结果显示，两种菌的lps刺激细胞产生的tnf-α差异明显，当lps浓度为1ng/ml时，tnf-α的量很低，并没有明显的差异，当lps浓度上升到10ng/ml时，刺激细胞产生的tnf-α量出现明显差异，此时w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的tnf-α量仅为w3110/puc的lps刺激细胞产生的tnf-α量的25％。当lps浓度上升到100ng/ml时，刺激细胞产生的tnf-α量出现的差异依然明显，此时w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的tnf-α量仅为w3110/puc的lps刺激细胞产生的tnf-α量的50％。当lps浓度上升到1000ng/ml时，刺激细胞产生的tnf-α量出现的差异不再明显，此时w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的tnf-α量略高于w3110/puc的lps刺激细胞产生的tnf-α量。而两种菌体刺激thp-1细胞产生的rantes的量却没有这么明显的区别，两种菌的lps为10ng/ml的时候刺激产生的rantes的量差别最大，此时w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的rantes的量为w3110/puc的lps刺激细胞产生的rantes量的66％，在lps的其他浓度下，两种菌刺激细胞产生的rantes并没有明显的差异。所以在w3110的类脂a结构基础上，表达lpxd1，增长2和2’位置上的脂肪酸链，降低了lps低于tlr4通路的刺激能力，整体降低了lps对于thp-1细胞的免疫活性，使得tnf-α和rantes的生成量降低。而tnf-α的量下降的更加明显，证明脂肪酸链长度的增长对于mal-myd88通路的影响更加明显。对raw267.4细胞的刺激结果显示，w3110/puc-lpxd1刺激细胞产生的细胞因子的量整体低于w3110/puc刺激细胞产生的细胞因子的量。两种菌体刺激细胞产生的tnf-α的量在lps的浓度为10ng/ml下显示出的差异最大，w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的tnf-α的量为w3110/puc的lps刺激细胞产生的tnf-α的量的65％。而两种菌的lps刺激细胞差生的rantes的量在lps浓度为10ng/ml下显示出的差异最大，w3110/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的rantes的量为w3110/puc的lps刺激细胞产生的rantes的量的36％。但是在其他的lps浓度下，两种菌体的lps刺激细胞产生的rantes的量并没有明显的差异。
hw002/puc和hw002/puc-lpxd1的lps刺激不同细胞产生的不同细胞因子的量如图所示。对thp-1细胞的刺激结果显示，产生的tnf-α和rantes的量都是比较低的水平，所以并没有表现出明显的差异。对raw264.7细胞的刺激结果显示，对于细胞因子tnf-α，两种菌体的lps刺激细胞产生的量在lps浓度为10ng/ml时差距最大，此时hw002/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的量为hw002/puc的lps刺激细胞产生的量的33％。对于细胞因子rantes，两种菌体的lps刺激细胞产生的量在lps浓度为10ng/ml时差距最大，此时hw002/puc-lpxd1的lps刺激细胞产生的量为hw002/puc的lps刺激细胞产生的量的27％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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