本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae,mp)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae,cp)和嗜肺军团菌(legionellapneumoniae,lp)感染是全球重要的感染性疾病，可在各年龄组儿童发病，以呼吸道感染最为常见，感染部位可贯穿整个呼吸道，且具有一定的传染性。mp、cp、lp是儿童急性上呼吸道感染常见的致病菌，也是引起社区获得性肺炎的主要病原菌。三种病原菌引起的肺炎支原体肺炎、肺炎衣原体肺炎和嗜肺军团菌肺炎为非典型肺炎，在症状、体征及辅助检查方面无特异性，病原体检测有局限性，易于误诊，利用分子技术可以快速、准确地进行诊断，从而配合正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。由这三种病原体引起的呼吸道感染所占比重较高，且三者的混合感染也日渐增多，同时检测、快速检测三种病原体的产品越来越有需求。
肺炎支原体是无细胞壁，介于病毒和细菌之间能自我复制进行独立生活的最小微生物，革兰氏染色阴性。mp可以引起支原体肺炎、上呼吸道感染、支气管炎、肺脓疡、免疫性溶血性贫血、脑膜脑炎、心肌炎、心包炎、肾炎、社区获得性肺炎等疾病。mp有很强的传染性，主要由口、鼻分泌物以气溶胶微粒的形式通过呼吸道传播，其潜伏期较长，存在全年散发、秋冬季高发的特点，会小范围内流行，引起集体感染，如幼儿园、学校、家庭成员交叉感染等。文献报道的阳性检出率达到15％～35％，另外，15％～20％社区获得性肺炎是由肺炎支原体引起的，在儿童社区获得性肺炎中更是占到20％左右。
肺炎衣原体是介于病毒与细菌之间的专属细胞内寄生的病原体，在宿主细胞内生长、繁殖和形成包涵体。传染途径与mp一样是通过呼吸道分泌物在人-人之间传播，在半封闭环境可存在小范围流行。根据遗传学和生物学分为twar、考拉和马3个生物变种，代表株为tw-183t(atccvr2282t)，是一种常见的人类呼吸道致病菌。cp可以引起急性呼吸道感染如咽炎、喉炎、鼻窦炎中耳炎、支气管炎及肺炎等，以肺炎最常见，支气管炎次之；还可以引起心肌炎、心内膜炎、动脉硬化和冠心病、虹膜炎、肝炎、脑膜炎和关节炎等疾病。潜伏期约为10天，一年四季均可感染，其流行可呈散发性或爆发性传播，尤其在空间相对封闭、人群聚集较多、空气不太流通的公共场所，文献报道的阳性检出率5％～20％。目前的诊断主要靠病原体的分离和血清学抗体的检测，但时间长、操作复杂，而荧光pcr检测可用于急性感染诊断及特殊人群流行病学研究。
嗜肺军团菌是引起军团病的病原菌，是人类单核细胞和巨噬细胞的兼性胞内寄生菌，系革兰氏阴性杆菌，是一类水源微生物，通过嗜肺军团菌有15个血清型，都有致病性。其中i型在人军团菌肺炎中最常常见，估计70％～90％的军团菌病是由i型嗜肺军团菌引起的。初期症状为轻微的咳嗽、不舒服、肌肉酸痛、低热或者还有些消化道症状，与普通感冒和流感症状类似，所以在临床上很难诊断；后期症状是高热、下呼吸道感染和肺炎的表现，x线可以看到明显的肺部病变，部分患者可出现并发症，如心包炎、心肌炎、心内膜炎、急性肾功能衰竭、休克等。潜伏期2～10天，嗜肺军团菌从饮用水系统、空调冷却水、淋浴喷头水等与人群密切接触水体以气溶胶的形式经呼吸道传播给人，引起严重的肺部炎症-军团菌病，使用中央空调的公共场所是传播嗜肺军团菌感染的重要高危场所。流行高峰为夏秋季，散发病例全年均有发生，男女发病比例2：1。本病主要发生于细胞免疫功能低下，如糖尿病、恶性肿瘤、器官移植、肝肾衰竭者。文献报道的阳性率3％～9％，暴露人群行业中10％～25％。
目前市场上针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的检测方法主要有培养法、免疫法和荧光pcr法，其中培养法占一半以上，其次是免疫法，分子检测法所占比重最少。荧光pcr法是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时监测，定性或定量检测目的基因；免疫法是通过抗原抗体发生特异性结合来检测目的蛋白；培养法是把病原体在特定培养基上进行培养，再对产生的结果进行观察分析。市面上已注册的有单项/两项的检测试剂盒，但没有同时检测三种病原菌的产品。
目前市面上暂无利用荧光定量pcr法检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的同类试剂盒，但有这三种病原体单项或者包含这三种病原体的多项检测荧光定量pcr法试剂盒的技术方案公开，可以作为参照进行比对，其组成一般包括盐离子缓冲液、酶、引物、探针、质控品，以液态形式分管保存在-20℃下，使用时需要将多管试剂融化，按照一定的比例进行混合，配制成检测反应液，然后加入样本核酸，放入荧光定量pcr仪中进行检测，最后根据扩增曲线分析检测结果。
免疫法检测试剂针对的是样本中的抗原或者病原体引起机体产生的特异性抗体，且抗体检测有窗口期，在发病初期容易漏诊；免疫法检测灵敏度、特异性较低，样本易污染且干扰物质较多，浓度过高或者过低时都容易造成结果错判，需要重复检测、复查才能确诊，检测的可信度较差；采用培养法检测耗时较长，培养效果差，很多病原体无法培养，延误最佳治疗时机。
普通的荧光pcr检测试剂虽然具有较好的灵敏度和特异性，但是试剂盒一般为多管液态试剂构成，平时需要保存在-20℃环境中，在操作时需要将各管试剂按照比例混合使用，对于运输和保存条件、操作方法等方面有较高的要求，容易因保存不当和操作失误引起检测结果不可信。另外，肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的混合感染日渐增多，但市面上产品主要是检测单项病原体，无法满足快速检测三种病原体的需求。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，提供一种可同时快速检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌三种病原体的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒包括含有检测试剂的检测管、阳性质控品和和无rnase水组成；其中，检测试剂单管分装，为干粉形态，包括有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；
所述特异性保守序列的引物序列为：
所述特异性保守序列的引物序列为：
肺炎支原体，seqidno.1和seqidno.2；
肺炎衣原体，seqidno.4和seqidno.5；
嗜肺军团菌，seqidno.7和seqidno.8；
所述特异性保守序列的taqman探针序列为：
肺炎支原体，seqidno.3；
肺炎衣原体，seqidno.6；
嗜肺军团菌，seqidno.9。
上述技术方案可对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行快速准确检测，且能在各种环境中简便易用，保证了检测的时效性、特异性和灵敏度；针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌各自的保守序列上设计特异性引物探针，并在探针上标记不同的荧光信号，可以同时检测并区分出肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌；解决了低温保存和使用操作繁琐的问题，本发明的试剂盒中检测试剂为单管干粉，可在4℃低温或常温下保存，使用时仅需加入提取好的核酸样本即可上机检测；试剂盒内检测管试剂配方经过优化调整，处理为干粉形态，能够在4℃低温或常温下保存一年以上，不影响检测效果，使用时仅需加入样本即可上机检测，方便易用；试剂盒采用taqman探针荧光pcr技术，针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌进行检测，设计引物和探针的序列在肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μl。
其中，seqidno.1：cagctcagtcgaatcgca；
seqidno.2：cacatcaatcgactcgcag；
seqidno.3：gtctgtagagaggctctacggc；
seqidno.4：gacttgagctagcaca；
seqidno.5：ctgatgcctgtctacga；
seqidno.6：ctgtctgactgatcatcgtcctcatc；
seqidno.7：cagcgctagctgcaatcc；
seqidno.8：gctagctggctactgagc；
seqidno.9：cgtcctagactagcgttcaatacag。
优选的，所述检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp、mgcl2、hotstarttaq酶和ung酶。
采用了ung酶/dutp防污染体系，能减少前次pcr反应产物带来的污染干扰；同时检测遗传物质都为脱氧核糖核酸的三种病原体，无需逆转录过程，直接添加hotstarttaq酶进行pcr扩增，过程一步完成；所使用的探针为5’端荧光标记的taqman探针，探针两端分别标记荧光报告基团(r)和荧光淬灭基团(q)的寡核苷酸，在探针完整时，即随机状态和无pcr产物杂交状态时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收；在荧光pcr扩增过程中，当特异的pcr产物与taqman探针发生杂交反应时hotstarttaq酶的5’端外切酶活性同时也把探针裂解，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到；pcr每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板dna的拷贝数的多少；因此，本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。
优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为100～1000nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50～500nm；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.1％～5％w/v；所述hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均为0.5u～5u；所述datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均为0.1mm～2mm；所述mgcl2在扩增体系中的终浓度为1.5mm～10mm。
其中，m＝mol/l，是浓度单位；w/v为质量体积比；此外，酶的浓度是在一个反应体系里1u。
优选的，所述阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒。
优选的，所述检测试剂的制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10pa；
-10℃，2h，＜10pa；
0℃，2h，＜10pa；
30℃，5h，＜10pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种前述试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)将样品的dna模板、无rnase水、阳性质控品各25μl分别加入不同的检测管中，盖好管盖，进行荧光pcr检测；
(2)pcr扩增反应的条件为：50℃逆转录15～30min；92～97℃预变性1～10min；92～97℃变性10～15s；58～62℃退火35～50s；40～45个循环；
(3)有效性判定：
无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤35，否则实验视为无效；
(4)结果判读：
样本检测管ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本rna提取失败、待测样本中不含rna或含量低于检测限；
样本检测管ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；
样本检测管ct值为38～40，需要复检一次，如果ct值仍为38～40，则判断为阴性；
按照以上判读方法，结合样本检测管检出的肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌对应荧光通道的ct值来判断三种病原体的检测结果。
本发明与普通荧光pcr法、免疫法和细菌培养法等相比，具有以下优势：
1.特异性强：本发明的引物探针针对肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守区域序列设计，特异性强。
2.敏感性高：本发明能检测到10copies/μl浓度的目的基因序列。
3.易于保存：本发明的检测管内预装单管的干粉试剂，保存方便。
4.单管分型：在一个检测管内根据荧光信号的不同来区分三种病原体。
5.检测过程为闭管反应，且遗传物质都为脱氧核糖核酸，无需逆转录过程，可直接进行pcr扩增过程，并大大降低了污染及结果偏差的可能性。
7.操作简单快速：无需配制检测试剂，仅需加样一次，即可上机检测，从标本送检到得出结果可在3个小时以内完成。
6.结果判读明确、客观；若需要亦可对结果进行定量分析。
7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，无需pcr产物的后处理，对操作员和环境都无危害。
附图说明
图1是本发明实施例1的pcr扩增曲线图；
图2是本发明实施例2的pcr扩增曲线图。
具体实施方式
实施例1：本实施例的用于检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的试剂盒，含有检测试剂的检测管、阳性质控品和和无rnase水组成；其中，检测试剂单管分装，为干粉形态，包括有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的特异性保守序列的引物及taqman荧光探针；
所述特异性保守序列的引物序列为：
所述特异性保守序列的引物序列为：
肺炎支原体，seqidno.1和seqidno.2；
肺炎衣原体，seqidno.4和seqidno.5；
嗜肺军团菌，seqidno.7和seqidno.8；
所述特异性保守序列的taqman探针序列为：
肺炎支原体，seqidno.3；
肺炎衣原体，seqidno.6；
嗜肺军团菌，seqidno.9。
检测试剂还包括有pcr缓冲液、海藻糖、牛血清白蛋白、datp、dutp、dctp、dgtp、mgcl2、hotstarttaq酶和ung酶。
引物在扩增体系中的终浓度为100nm；所述探针在扩增体系中的终浓度为50nm；所述海藻糖在扩增体系中的终浓度为1％w/v；所述牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度为0.2％w/v；所述hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均为1u；所述datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均为0.5mm；所述mgcl2在扩增体系中的终浓度为5.5mm；阳性质控品中含有肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌的扩增基因序列的质粒。
检测试剂的干粉形态制备方法为：
(1)将配制好的检测试剂溶液以单人份分装到pcr管中，放入-80℃条件下冻存8h以上；
(2)将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，设定冻干机程序为：
-50℃，1h，1大气压；
-40℃，5h，＜10pa；
-10℃，2h，＜10pa；
0℃，2h，＜10pa；
30℃，5h，＜10pa；
(3)干燥完成后，取出试剂，即为干粉形态。
该试剂盒的反应体系为25μl，直接将提取的25μl样本核酸添加到单个检测管中。
试剂盒的操作和结果判定：
(1)将样品的dna模板(从人的痰液、咽拭子等中提取)、无rnase水、阳性质控品各25μl分别加入不同的pcr反应管中，配成反应体系，盖好管盖混匀离心，放入荧光定量pcr仪中进行荧光pcr检测；
(2)设置仪器中的pcr扩增反应的条件为：50℃逆转录30min；92℃预变性10min；94℃变性15s；58℃退火40s；40个循环；
(3)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和ct值对检测结果进行分析；
(4)有效性判定：
无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤35，否则实验视为无效；
(5)结果判读：
样本检测孔ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本rna提取失败、待测样本中不含rna或含量低于检测限；
样本检测孔ct值≤35，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；
样本检测孔ct值为35-40，需要复检一次，如果ct值仍为35-40，则判断为阴性。
结合样本检测管检出的肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌对应荧光通道的ct值来判断三种病原体的检测结果。
图1为本发明的pcr扩增曲线图，其中1为基线，2为阴性对照，3为阳性质控品，4为肺炎支原体阳性结果的样本，5为肺炎衣原体阳性结果的样本，6为嗜肺军团菌阳性结果的样本。阳性质控品3检出扩增曲线，且ct值＜35，阴性对照2无扩增曲线，表明结果有效；样本4和6均有扩增曲线，且ct值＜35，判定为阳性结果；样本5扩增曲线的ct值＞35，建议重新检测。
实施例2：
用本发明的试剂盒分别检测肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌对应的质粒样本，以及三者混合质粒样本，浓度分别为105copies/μl。按照与实施例1相同的方法进行检测。
检测结果表明本发明试剂盒可以在一个检测管内同时检测三种病原体，且三个荧光信号通道互不干扰，结果见图2。其中1为基线，2为阴性对照，3为三者混合质粒，4为肺炎支原体样本，5为肺炎衣原体样本，6为嗜肺军团菌样本。阴性对照2无扩增曲线，混合质粒样本3检出三条扩增曲线，分别为三个通道，且ct值＜35，表明结果有效；样本4～6都只有一个通道有扩增曲线，且ct值结果与浓度相同的混合质粒无明显差异。
试验结果表明本试剂盒可以同时检出肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌，也可以检出单项且不干扰其他两项病原体的荧光信号通道。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，例如引物在扩增体系中的终浓度在100～1000nm范围内进行选择，探针在扩增体系中的终浓度在50～500nm范围内进行选择，海藻糖在扩增体系中的终浓度在1％～10％范围内进行选择，牛血清白蛋白在扩增体系中的终浓度在0.1％～5％范围内进行选择，hotstarttaq酶、逆转录酶、ung酶在扩增体系中的终浓度均在0.5u～5u范围内进行选择，datp、dutp、dctp、dgtp在扩增体系中的终浓度均在0.1mm～2mm范围内进行选择，mgcl2在扩增体系中的终浓度在1.5mm～10mm范围内进行选择，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110>南京岚煜生物科技有限公司
<120>用于检测多种病原体的试剂盒及其使用方法
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)
<400>1
cagctcagtcgaatcgca18
<210>2
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<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)
<400>2
cacatcaatcgactcgcag19
<210>3
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<212>dna
<213>特异性taqman探针序列为：肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)
<400>3
gtctgtagagaggctctacggc22
<210>4
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<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)
<400>4
gacttgagctagcaca16
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<211>17
<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)
<400>5
ctgatgcctgtctacga17
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>特异性taqman探针序列为：肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)
<400>6
ctgtctgactgatcatcgtcctcatc26
<210>7
<211>18
<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)
<400>7
cagcgctagctgcaatcc18
<210>8
<211>18
<212>dna
<213>特异性保守序列的引物序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)
<400>8
gctagctggctactgagc18
<210>9
<211>25
<212>dna
<213>特异性taqman探针序列为：嗜肺军团菌(legionellapneumophila)
<400>9
cgtcctagactagcgttcaatacag25