本发明属于生物技术领域的一种上皮干细胞分化为黑色素细胞培养基及其方法，具体涉及的是人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。
背景技术：
皮肤色素沉着对人类的健康和皮肤美观起着至关重要的作用，尤其是面部等暴露部位皮肤更为重要。由于黑色素细胞合成的色素可以保护机体免受环境的攻击和各种危险细胞的侵袭，所以皮肤色素的缺失不仅可以导致白癜风等免疫性疾病，而且影响患者的心理健康。
白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病。由于皮肤的黑色素细胞功能消失引起，全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。但机制还不清楚。除药物治疗、脱色疗法、物理疗法、对皮损稳定无进展的患者可行自体表皮移植手术外，还有一项发明专利将自体脂肪间充质干细胞定向分化为黑色素细胞的方法(专利号cn201710169785.9)等自体黑色素细胞移植治疗方法。不仅脂肪间充质干细胞来源于中胚层，且由于取患者自体正常皮肤进行诱导黑色素细胞时，取材形成创面局部宜形成新的白癜风。人羊膜上皮干细胞和黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，更易分化为黑色素细胞。因此，异体黑色素细胞移植治疗已成为最优选的治疗方案之一。
干细胞是未分化细胞且具有多向分化潜能，可以分化形成各种特定类型的目标细胞。在众多的干细胞中，人羊膜上皮干细胞不仅与黑色素细胞均来源于外胚层神经嵴，而且具有免疫源性低、取材方便等优点，必将成为异体黑色素细胞移植治疗白癜风的优先选择目标细胞。
技术实现要素：
本发明针对现有白癜风治疗方法的自体黑色素细胞来源困难及异体黑色素细胞来源免疫源性限制等问题，而提供同种异体来源广泛，无或低免疫源性问题的一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法。
本发明技术方案如下：
人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：
人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，包括如下步骤：
(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
采用机械法剥离羊膜组织，用生理盐水反复冲洗，除尽表面血迹，取人羊膜5×5cm2，剪碎，置于15×15cm2平皿中，加入0.25克/升胰蛋白酶，37℃消化20-35分钟后，用10-20％胎牛血清中止消化，收集上清液，再用同样方法消化7-12分钟后中止消化，将上述2次收集上清液混合，过200目细胞筛后，将滤液在800-1200转/分钟条件下，离心8-12分钟，弃上清，得到细胞悬液；将细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；
(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增
将第(1)步所得到细胞接种于含10％胎牛血清的dmem/f12培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的co2培养箱中进行培养，并通过换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；
在上述第(2)步中，将第(1)步所得到细胞以2×106l-1-2×107l-1密度接种于培养基中培养；
(3)人羊膜上皮干细胞的诱导分化
取第2-3代人羊膜上皮干细胞接种于含10-20％胎牛血清的dmem/12培养基的12孔板中培养，至细胞80％以上融合后，更换黑色素细胞诱导分化培养基，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％co2培养箱中培养，每2-3天换液1次，连续培养80-120天；
所述黑色素细胞诱导分化培养基采用α-mem液体培养基500ml，其中含内皮素3100nm,地塞米松50nm，干细胞因子50nm，碱性成纤维细胞生长因子4nm，胰岛素铁硒传递蛋白1×和10％胎牛血清；
在上述第(3)步中，将第(2)步所得到细胞以2×106l-1-2×107l-1密度接种于培养基中培养。
本发明人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，还包括人羊膜上皮干细胞与黑色素细胞均来源于外胚层。
本发明的优点在于人羊膜上皮细胞与人黑色素细胞均来源于外胚层，诱导分化方法简便易行，而且人羊膜上皮干细胞来源于人羊膜。人羊膜为胎儿出生后的废弃物，取材方便，具有来源广泛，经济效益显著；低免疫原性，不受伦理限制等优越性。诱导后获得的黑色素细胞不仅可用于异体白癜风疾病的治疗，而且治疗效果非常显著。
附图说明
图1为原代分离培养24小时后羊膜上皮干细胞形态观察(×40)图。
图2为第2代羊膜上皮干细胞形态观察(×40)图。
图3为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导前细胞形态倒置显微镜观察(×40)图。
图4为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导60天后细胞形态倒置显微镜观察(×40)图。
图5为人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导100天后胞形态倒置显微镜观察可见明显色素颗粒(×40)图。
图6为western-blot鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天黑色素细胞标记基因trp1表达(p＜0.05)图。
图7为western-blot鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天黑色素细胞标记基因trp2表达(p＜0.05)图。
图8为real-timepcr鉴定人羊膜上皮干细胞未诱导、诱导分化60天和诱导分化100天，黑色素细胞标记基因trp1、trp2、mitf、dtc表达(p＜0.05)图。
图9为免疫荧光法鉴定人羊膜上皮干细胞诱导分化后黑色素细胞标记基因trp1免疫荧光染色表达(×100)图。
图10为免疫荧光法鉴定人羊膜上皮干细胞诱导分化后黑色素细胞标记基因trp2免疫荧光染色表达(×100)图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明：
实施例1
本发明一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：
制成为水溶液。
实施例2
本发明一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：
制成为水溶液。
实施例3
本发明一种人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基，包括：
制成为水溶液。
实施例4
本发明人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化方法，包括如下步骤：
(1)人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
在无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿(男性)的人胎盘；检测甲型肝炎抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗体、乙型肝炎病毒e抗原、乙型肝炎病毒e抗体、乙型肝炎核心抗体igm、丙型肝炎抗体、戊型肝炎抗体、艾滋病病毒抗体、梅毒螺旋体抗体等其他相关传染性指标均呈阴性；在无菌超净台上钝性分离胎盘脐带面的羊膜，用生理盐水反复冲洗，除尽表面血迹，取人羊膜5×5cm2，剪碎，置于15×15cm2平皿中，加入0.25g/l胰蛋白酶，37℃消化20-35分钟后，用10-20％胎牛血清中止消化，收集上清液，再用同样方法消化7-12分钟后中止消化，将上述2次收集上清液混合，用200目细胞筛过滤后，将滤液在800-1200转/分钟条件下，离心8-12分钟，弃上清，制成单细胞悬液；
(2)人羊膜上皮干细胞的培养及扩增
将第(1)步所得到细胞接种于含10％fbs的dmem/f12培养基中，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％的co2培养箱中进行培养，培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁细胞，根据细胞生长情况，每2-4天全量换液一次，待细胞达到80％-90％融合时，按1:2或1:3比例进行传代，并记为p1代。再重复上述操作进行传代，此传代培养记为p2代；再次重复上述操作进行传代，此传代培养记为p3代。通过上述换液及扩增，获得第2-3代人羊膜上皮干细胞；
在上述第(2)步中，将第(1)步所得到细胞以2×106l-1-2×107l-1密度接种于培养基中培养。
(3)人羊膜上皮干细胞的诱导分化
取第2-3代人羊膜上皮干细胞接种于含10-20％fbs的dmem/12培养基的12孔板中培养，至细胞80％-90％融合后，更换黑色素细胞诱导分化培养基，置于37℃，饱和湿度，体积分数为5％co2培养箱中培养，每2-3天换液1次，连续培养80-120天。
所述黑色素细胞诱导分化培养基，包括α-mem液体培养基400ml，其中含内皮素370nm,地塞米松30nm，干细胞因子30nm，胰岛素铁硒传递蛋白1×，碱性成纤维细胞生长因子3nm和10％胎牛血清。
在上述第(3)步中，将第(2)步所得到细胞以2×106l-1-2×107l-1密度接种于培养基中培养。
实施例5
本发明采用western-blot鉴定黑色素细胞标记基因trp1、trp2的表达，如下：
分别对未诱导组和黑色素细胞诱导分化培养基诱导60天组、诱导100天组细胞，采用western-blot方法对上述细胞进行黑色素细胞标记基因trp1、trp2进行检测。
1.将未诱导组和黑色素细胞诱导分化培养基诱导60天组、诱导100天组分别按照3×106个细胞/孔的密度种入6孔板中，待贴壁后，每3天更换1次。诱导周期为14天。
2.诱导形成的黑色素细胞的鉴定：用ripa提取蛋白，bca法进行蛋白定量。配置10％分离胶和4％浓缩胶，上样后进行电泳，经过转膜100v，1小时，分别将trp1、trp2和gapdh一抗4℃过夜杂交，然后与相对应二抗孵育1小时，ecl显色。观察未诱导组和诱导组trp1、trp2表达。
实施例6
本发明采用real-timepcr鉴定黑色素细胞标记基因trp1、trp2、mitf、dtc基因的表达，如下：
分别对未诱导组和黑色素细胞诱导分化培养基诱导60天组、诱导100天组细胞，采用real-timepcr方法对上述细胞进行黑色素细胞标记基因trp1、trp2、mitf、dtc检测。
1.将未诱导组和黑色素细胞诱导分化培养基诱导60天组、诱导100天组分别按照3×106个细胞/孔的密度种入6孔板中，待贴壁后，每3天更换1次。诱导周期为14天。
2.诱导形成的黑色素细胞的鉴定用trizol法分别提取细胞的rna。对提取到的rna进行反转录合成cdna第一链。反应条件：在95℃20秒解链后，95℃5秒，60℃20秒，进行45个循环。荧光定量pcr仪上，以所获得的cdna为模板，进行real-timepcr检测trp1、trp2、mitf、dtc及gapdh基因表达水平。以gapdh表达作为内参标定各实验指标表达量，计算方法为2–δδct相对定量法。
实施例7
本发明采用免疫荧光法鉴定黑色素细胞标记基因trp1、trp2的表达，如下：
未诱导组和诱导组细胞分别用4％多聚甲醛固定后，用trp1、trp2基因的一抗4℃孵育过夜，然后用fitc标记的对应的二抗孵育1小时，pbs清洗后用荧光显微镜进行观察。
1、细胞接种：分别将未诱导组和用黑色素细胞诱导分化培养基培养60天和100天组细胞以3×105密度接种到六孔板内，置于37℃体积分数为5％的co2饱和湿度培养箱中培养；
2、固定：待细胞生长70-80％融合时，弃去培养液，用1×pbs洗两遍，加入4％多聚甲醛溶液，室温固定20分钟；
3、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×pbs，50rpm/min洗涤5分钟，重复三次；
4、封闭：加入封闭液(含1％小牛血清白蛋白(bsa)的pbs中)，室温封闭30分钟；
5、一抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×pbs，1％bsa)1∶100稀释一抗trp1、trp2，4℃，过夜；
6、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×pbs1ml，摇床上摇晃洗涤5分钟，重复三次；
7、二抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×pbs，1％bsa)1∶500稀释二抗fitc偶联的驴抗小鼠、四甲基异硫酸罗丹明(tritc)偶联的驴抗山羊，室温孵育1小时；
8、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×pbs1ml，50rpm/min，洗涤5分钟，重复三次；
9、核染色：用去离子水(ddh2o)按1∶1000的比例稀释二脒苯基吲哚(dapi)储存液，工作液浓度为1μg/ml，染色1分钟，使用ddh2o洗三次，每次5分钟；
10、观察：置于荧光显微镜下观察。
实施例8
人羊膜上皮干细胞定向诱导分化为黑色素细胞的鉴定结果，如下：
1、人羊膜上皮干细胞生长及形态观察如图1、2、3、4、5所示，诱导期间人羊膜上皮干细胞在诱导分化过程中，其细胞形态在诱导60天后发生变化，细胞逐渐变细长呈长梭形，且透明度下降；细胞诱导100天后，细胞呈现黑色素细胞的树突状多极化形态。
2、western-blot检测如图6，7所示黑色素细胞标记trp1、trp2的表达：结果显示与对照组相比，诱导后trp1、trp2的表达随时间延长而增高，p＜0.05。
3、real-timepcr检测如图8所示黑色素细胞标记基因trp1、trp2、mitf、dtc表达结果与对照组相比，诱导后的trp1、trp2、mitf、dtc基因的表达随时间延长而增高，p＜0.05。
4、免疫荧光检测如图9，10所示黑色素细胞标记基因trp1、trp2的表达结果诱导组trp1、trp2均呈阳性表达，未诱导组则呈阴性表达。
以上实验鉴定结果可以证明，上述培养基能够使人羊膜上皮干细胞定向诱导分化为黑色素细胞。
实施例9
人羊膜上皮干细胞定向诱导分化为黑色素细胞与脂肪间充质干细胞定向诱导分化为黑色素细胞(专利号cn201710169785.9))比对，见下表：