本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品系的检测方法，具体涉及lamp检测转基因水稻g6h1品系特异性的引物和方法，尤其涉及一种转基因水稻g6h1品系特异性lamp检测方法。
背景技术：
自从1994年第一种商业化转基因植物(flavrsavrtomato)被批准上市以来，转基因植物在全球范围内得到了快速的发展。根据国际农业生物技术应用服务组织(isaaa)统计，转基因作物在二十多年的商业化进程中，种植面积从1996年的170万公顷迅速上升到2016年的1.851亿公顷，实现了110倍的增长，而且全球范围内大面积商业化种植的植物依然主要是大豆、棉花、玉米、油菜。除此之外，报告中还强调了转基因作物为发展中国家和发达国家的农民带来的长期收益，以及近期获得批准并被商业化的新品种为消费者带来的诸多好处。然而国际社会对转基因食品的安全性仍有很大的争议，因此包括我国在内的许多国家都出台了转基因产品管理法规，要求对转基因产品进行检测、标识和管理。
我国政府高度重视转基因生物的安全管理，颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及其配套规章，对农业转基因生物及其产品实行安全评价、产品标识、生产许可、经营许可、进口许可、加工许可等制度，且采用强制性标识方法，只要含有转基因成分就必须标识。因此建立高效、准确的转基因检测方法的是这些规章制度得以顺利实施的关键。
转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1品种，是将密码子经过优化的杀虫基因hjc-1和抗草甘膦基因g6导入到栽培水稻品种“秀水110”中得到的，hjc-1是一个cry1ab和vip3ii的融合基因，这两个基因的融合具有对鳞翅目害虫有更广谱的杀虫能力。g6是一个新的5-烯醇式丙酮酸3-磷酸合成酶基因(epsps)。2014年，徐俊锋等人报道了转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1外源插入全序列以及定性pcr方法(专利公开号为cn103923999a，公开日为2014年07年16)；同时他们揭示了该水稻品系转化体外源插入片段的5’端旁侧序列和3’端旁侧序列，并基于此序列信息建立了pcr定性检测方法(专利公开号为cn103923999a，公开日为2014年07年16)。此外，2017年汪小福等人公开了一种转基因水稻多重数字pcr定量检测方法(专利公开号为cn106868137a，公开日2017年06月20日)，该发明首先公开了用于转基因水稻kf2、kf6、kf8、kmd1、m12、tt51-1、g6h1的多重数字pcr定量检测引物和探针，建立的方法能够同时对这些转基因水稻样品进行定量检测。
常规的转基因水稻成分的检测主要采用普通pcr方法和taqman实时荧光定量pcr方法。普通pcr方法由于操作繁琐、耗时长、易污染环境等缺点已逐渐被taqman实时荧光定量pcr取代。taqman实时荧光定量pcr灵敏度高、特异性好，但需昂贵的荧光pcr仪和配套的试剂，不能普遍适用于检验检疫一线的基层实验室和现场检测。
近年来，环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，简称lamp)发展迅速。lamp方法具有快速简便、操作方便、容易普及、安全可靠等优点，不需要特殊的试剂及设备，成本低廉，适用于在基层实验室和现场检测。在转基因植物检测领域中，环介导等温扩增技术(lamp)在转基因筛选元件(如p-camv35s、t-nos、p-nos、p-fmv35s)、特异性基因(如cry1ab、cry2ab、cry3a、phytasegene)、转基因事件特异性(tt51-1、bt176、bt11、mon863、mon89788、ms8)等方面都有所应用。
但是，目前依然尚无关于lamp方法检测转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1的报道或者专利。因此有必要建立对转基因水稻g6h1品系特异性的lamp检测技术。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种转基因水稻g6h1品系特异性lamp检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种转基因水稻g6h1品系特异性的lamp检测方法，包括以下步骤：
a、设计合成引物；
b、配置pcr反应体系；
c、将待检测转基因水稻g6h1的dna稀释液加入pcr反应体系中，进行lamp反应，所得扩增产物进行凝胶电泳或加入荧光染料着色即可。
优选地，步骤a中，所述引物包括内引物fip、内引物bip、外引物f3和外引物b3；所述引物的碱基序列如seqidno：1～4所示。
优选地，步骤b中，所述pcr反应体系以23μl总体积计，包括以下体积含量的各组分(其中fip/bip和f3/b3引物的浓度是核酸扩增常用的引物浓度，它们在反应体系里的体积是最优化的选择，体积过多或过低均影响lamp扩增结果)：
优选地，步骤c中，所述待检测转基因水稻g6h1的dna稀释液与pcr反应体系的体积比为2:23。
优选地，步骤c中，所述待检测转基因水稻g6h1的dna稀释液的浓度为10-20ng/μl。
优选地，步骤c中，所述lamp反应的条件为：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。
优选地，步骤c中，所述凝胶电泳具体采用2％琼脂糖凝胶电泳，200v下进行25min。
优选地，所述荧光染料选自sybrgreeni。
本发明还提供了一种用于检测转基因水稻g6h1品系的lamp引物组合物，包括内引物fip、内引物bip、外引物f3和外引物b3；所述引物的碱基序列如seqidno：1～4所示。
本发明还提供了一种前述的lamp引物组合物在检测转基因水稻g6h1品系中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明建立的lamp方法具有良好的特异性，适于转基因水稻g6h1品系特异性检测，其灵敏度极高，达到了10拷贝，且具有快速、高效、准确等优点，在转基因水稻g6h1及其产品的监管和检测工作中有实际应用价值，尤其适用于基层实验室和现场检测的推广和应用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是转基因水稻g6h1品系lamp特异性检测的跑胶结果图；图中，泳道m，dl2000dnamarker；泳道1，转基因水稻g6h1；泳道2，转基因玉米bt176；泳道3，转基因玉米双抗12-5；泳道4，转基因玉米mon810；泳道5，转基因玉米tc1507；泳道6，转基因棉花mon88913；泳道7，转基因棉花mon1445；泳道8，转基因大豆rrs；泳道9，转基因大豆mon89788；泳道10，转基因油菜rf2；泳道11，转基因水稻tt51-1；泳道12，转基因水稻科丰6；泳道13，阴性对照；泳道14，空白对照；
图2是转基因水稻g6h1品系lamp特异性检测的sybrgreeni染料结果图；图中，管1，转基因水稻g6h1；管2，转基因玉米bt176；管3，转基因玉米双抗12-5；管4，转基因玉米mon810；管5，转基因玉米tc1507；管6，转基因棉花mon88913；管7，转基因棉花mon1445；管8，转基因大豆rrs；管9，转基因大豆mon89788；管10，转基因油菜rf2；管11，转基因水稻tt51-1；管12，转基因水稻科丰6；管13，阴性对照；管14，空白对照；
图3是转基因水稻g6h1品系lamp的灵敏度跑胶结果；图中，泳道m，dl2000dnamarker；泳道1，2000拷贝；泳道2，200拷贝；泳道3，20拷贝；泳道4，10拷贝；泳道5，2拷贝；泳道6，空白对照；
图4是转基因水稻g6h1品系lamp的灵敏度sybrgreeni染料结果；图中，管1，2000拷贝；管2，200拷贝；管3，20拷贝；管4，10拷贝；管5，2拷贝；管6，空白对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用仪器或者试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：lamp方法的特异性检测
1、合成具有以下核苷酸序列的引物，本实施例引物及荧光探针的浓度都为10μm/l。
以上引物的核苷酸序列是基于转基因抗虫耐除草剂水稻g6h1品系特异性序列即3’端旁侧序列，即3’端外源基因与水稻基因组的整合位点设计，通过该设计就可以精确检测转基因水稻g6h1的品系特异性；
2、提取11种不同的作物的dna，即2种转基因水稻(科丰6和tt51)、4种转基因玉米(bt176、双抗12-5、mon810、tc1507)、2种转基因棉花(mon88913和mon1445)、2种转基因大豆(rrs、mon9788)、1种转基因油菜(rf2)。采用常规的dna提取手段，并将其稀释至20ng/μl。
3、配制反应体系：即将2μl的dna稀释液加入到23μl反应体系中，所述23μl的反应体系包括以下组分：
反应体系中mgso4、thermolbuffer缓冲液和bstdna聚合酶均购自美国纽英伦生物技术公司；dntps购自上海申能博彩公司。
4、lamp特异性检测
根据上述pcr反应体系，将11种不同的作物，即2种转基因水稻(科丰6和tt51)、4种转基因玉米(bt176、双抗12-5、mon810、tc1507)、2种转基因棉花(mon88913和mon1445)、2种转基因大豆(rrs、mon9788)、1种转基因油菜(rf2)，在上述lamp反应的条件下对产物进行扩增。用ddh2o设置阴性对照。
lamp反应条件：65℃扩增反应1h，1个循环；80℃使酶失活5min、4℃降温5min，1个循环。本实施例中采用的是abiveriti96well定性pcr扩增仪(美国应用生物系统公司)。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddh2o设置阴性对照。
5、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200v，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带的为转基因水稻g6h1的样品，无条带的为其他样品或空白对照。本实例中采用的是dy-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司)，uvpbiodoc-it220凝胶成像一体机(美国spring公司)；此外反应结束后用荧光染料sybrgreeni显色，产物变绿则为阳性即检出转基因水稻品系g6h1；颜色不变则为阴性。
从图1可知，只有转基因水稻g6h1的泳道出现梯状条带或加sybrgreeni染料呈现绿色，其他物种以及空白对照均无条带或无变色；从图2可知，只有转基因水稻g6h1的产物加sybrgreeni染料呈现绿色，其他物种以及空白对照均无变色，而三个协同实验的验证结果均与本实验一致，说明建立的lamp方法具有良好的特异性，可用于转基因水稻g6h1品系特异性检测。
实施例2：lamp方法的灵敏度检测
1、引物合成、转基因水稻g6h1的dna提取见实例1。
2、制备转基因水稻g6h1模板稀释梯度
先通过网站http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html根据基因组大小将dna浓度(ng/μl)转化成拷贝数，再将转基因水稻g6h1的dna模板用ddh2o依次稀释至2000拷贝、200拷贝、20拷贝、10拷贝和2拷贝。
3、将上述5个浓度梯度进行lamp扩增，并用ddh2o设置阴性对照。配置lamp反应条件见实例1。
在本实施例中，邀请3位人员参与协同实验验证。每位人员均重复三次实验，每个实验设置三个重复。并要求他们均用ddh2o设置阴性对照。
4、观察实验结果
将扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，200v，25min。2％琼脂糖凝胶电泳出梯状条带对应的最低拷贝数就是lod值；此外反应结束后用荧光染料sybrgreeni显色，产物变绿对应的拷贝数则为阳性，即该转基因水稻品系g6h1的检测限；颜色不变则为阴性。
图3显示，除了2拷贝样品(第5泳道)和空白对照(第6泳道)没有条带外，其他泳道均出现梯状条带；图4显示，除了2拷贝样品(第5管)和空白对照(第6管)没有变色外，其他产物均呈现绿色；而协同实验的结果与本实验均一致。说明本实验建立的lamp方法的灵敏度极高，达到了10拷贝。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110>上海交通大学
<120>转基因水稻g6h1品系特异性lamp检测方法
<130>dag35750
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
actcgatctgctgcagcttggaaaaagatgatggatcgatgg42
<210>2
<211>43
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ttaacgcaaggaaagactgttgaagaaaagtgatgttgccctt43
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cgtcaatttgtttacaccacaa22
<210>4
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ataataaaaggtgtctttccctt23