本发明涉及药物检测技术领域，特别涉及一种结核分枝杆菌药敏检测显色剂及其药敏检测方法。
背景技术：
结核病是全球范围内的重大传染病之一，由于不正规用药等原因，耐多药结核病和广泛耐药结核病的比例快速上升，而结核分枝杆菌的耐药机理复杂，基于耐药突变基因的分子生物学方法并不能完全满足临床要求，因此，细菌学药敏检测和最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)的测定成为抗结核新药筛选和个体化精准治疗的重要手段，其中，在细菌学药敏检测过程中，需要使用培养基对结核杆菌进行培养，而基于现有培养基的结核分枝杆菌药敏检测一般至少需耗时1周，检测周期较长，不利于结核分枝杆菌药敏检测的快速进行。
技术实现要素：
本发明的主要目的是提出一种结核分枝杆菌药敏检测显色剂及其药敏检测方法，旨在缩短结核分枝杆菌药敏检测的检测周期。
为实现上述目的，本发明提出一种结核分枝杆菌药敏检测显色剂，包括：
3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠、以及1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯。
优选地，所述3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠和1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯的浓度对应为0.2mM和0.04mM。
本发明还提出一种结核分枝杆菌药敏检测方法，所述结核分枝杆菌药敏检测方法使用如上所述的结核分枝杆菌药敏检测显色剂进行，包括以下步骤：
用液体培养基培养结核分枝杆菌，得到结核分枝杆菌菌液；
将待测药物用液体培养基配制成药物溶液；
将药物溶液和结核分枝杆菌菌液混合后进行恒温培养，并于恒温培养第5天加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，根据结核分枝杆菌药敏检测显色剂的颜色变化来判断结核分枝杆菌对待测药物的敏感性。
优选地，用液体培养基培养结核分枝杆菌，得到结核分枝杆菌菌液的步骤，具体包括：
将结核分枝杆菌菌株活化后，挑取单菌落转移至7H9液体培养基中培养至结核分枝杆菌生长至对数期时，吸取菌液，用2～4mm的玻璃珠旋涡振荡2～5min，取上层悬浊液用7H9液体培养基比浊至0.5麦氏浊度，得到结核分枝杆菌菌液，其中，所述7H9液体培养基中含有0.05％的吐温80和10％的OADC。
优选地，所述结核分枝杆菌菌液的浓度为2.4×107～7.5×108CFU/mL。
优选地，将待测药物用液体培养基配制成药物溶液的步骤，具体包括：
以7H9液体培养基为溶剂，将待测药物配制成不同浓度梯度的药物溶液，其中，所述7H9液体培养基中含有0.05％的吐温80和10％的OADC增菌液。
优选地，将药物溶液和结核分枝杆菌菌液混合后进行恒温培养，然后加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，继续培养，根据结核分枝杆菌药敏检测显色剂的颜色变化来判断结核分枝杆菌对待测药物的敏感性的步骤中：
所述药物溶液、结核分枝杆菌菌液以及结核分枝杆菌药敏检测显色剂的体积比为5：5：1。
优选地，将药物溶液和结核分枝杆菌菌液混合后进行恒温培养，并于恒温培养第5天加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，根据结核分枝杆菌药敏检测显色剂的颜色变化来判断结核分枝杆菌对待测药物的敏感性的步骤，包括：
将药物溶液置于孔板的试验孔中，然后向含有药物溶液的试验孔中加入结核分枝杆菌菌液，于37℃温度下进行恒温培养；
于恒温培养第5天，向试验孔中加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，继续恒温培养4～24h后，观察结核分枝杆菌药敏检测显色剂是否出现颜色变化，若结核分枝杆菌药敏检测显色剂出现颜色变化，判定为所述结核分枝杆菌对所述待测药物具有耐药性，若结核分枝杆菌药敏检测显色剂无颜色变化，判定为所述结核分枝杆菌对所述待测药物敏感。
本发明提供的技术方案中，以3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)和1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(mPMS)的组合物作为结核分枝杆菌药敏检测显色剂，其中，XTT与菌体的氧化还原代谢产物反应产生可溶性甲臢，然后以mPMS为中间电子受体，经过中间电子受体mPMS介导快速透过细胞膜，从而实现结核分枝杆菌的快速药敏检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的结核分枝杆菌药敏检测方法的一实施例的流程示意图；
图2为本发明提供的结核分枝杆菌药敏检测方法的另一实施例的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种结核分枝杆菌药敏检测显色剂，所述结核分枝杆菌药敏检测显色剂包括3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)、以及1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(mPMS)。
本发明提供的技术方案中，以XTT和mPMS的组合物作为结核分枝杆菌药敏检测显色剂，其中，XTT与菌体的氧化还原代谢产物反应产生可溶性甲臢，然后以mPMS为中间电子受体，经过中间电子受体mPMS介导快速透过细胞膜，从而实现结核分枝杆菌的快速药敏检测。
其中，在所述结核分枝杆菌药敏检测显色剂中，XTT和mPMS的适用浓度对应为0.2mM和0.04mM。
本发明还提出一种结核分枝杆菌药敏检测方法，所述结核分枝杆菌药敏检测方法使用如上所述的结核分枝杆菌药敏检测显色剂进行，图1为本发明提供的结核分枝杆菌药敏检测方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述结核分枝杆菌药敏检测方法包括以下步骤：
步骤S10、用液体培养基培养结核分枝杆菌，得到结核分枝杆菌菌液；
在本实施例中，步骤S10具体包括：将结核分枝杆菌菌株活化后，挑取单菌落转移至7H9液体培养基中培养至结核分枝杆菌生长至对数期时，吸取菌液，用直径为2～4mm的玻璃珠旋涡振荡2～5min，取上层悬浊液用7H9液体培养基比浊至0.5麦氏浊度，得到结核分枝杆菌菌液，其中，所述7H9液体培养基中含有0.05％的吐温80和10％的OADC增菌液(米氏OADC增菌液)。
其中，所述结核杆菌(包括结核结核分枝杆菌H37Ra)菌液的浓度为2.4×107～7.5×108CFU/mL，也即，所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂对结核结核分枝杆菌的适用浓度分别为2.4×107～7.5×108CFU/mL。此外，所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂对耻垢分枝杆菌也具有线性，其适用浓度为2.4×107～3.7×108CFU/mL。
步骤S20、将待测药物用液体培养基配制成药物溶液；
在本实施例中，步骤S20具体包括：以7H9液体培养基(可通过市售购买)为溶剂，将待测药物配制成不同浓度梯度的药物溶液(可以通过二倍稀释法或其他方法实现)，其中，所述7H9液体培养基中含有0.05％的吐温80和10％的OADC。
步骤S30、将药物溶液和结核分枝杆菌菌液混合后进行恒温培养，并于恒温培养第5天加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，根据结核分枝杆菌药敏检测显色剂的颜色变化来判断结核分枝杆菌对待测药物的敏感性。
将步骤S20配制的不同浓度梯度的药物溶液对应置于孔板中的试验孔中，然后在含有药物溶液的试验孔和不含有药物溶液的对照孔中，均加入步骤S10配制的结核分枝杆菌菌液，然后进行恒温培养，待恒温培养至第5天时，同时向试验孔和对照孔中加入本发明提供的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂，继续恒温培养，观察XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂是否出现颜色变化，并根据其颜色变化判定所述结核分枝杆菌对所述待测药物的敏感性。
需要说明的是，在所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂出现颜色变化后，对于结核结核分枝杆菌而言，应在420min之内读取其颜色变化结果，而对于耻垢结核分枝杆菌而言，应在90min之内读取其颜色变化结果，在此时间范围内，所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂具有线性，超出此时间范围则可能导致判定结果出现较大误差。在其他实施例中，也可以通过检测加入所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂后的培养液的吸光度OD值(450nm)，根据OD值来判定所述结核分枝杆菌对所述待测药物的敏感性。
其中，所述药物溶液、结核分枝杆菌菌液以及结核分枝杆菌药敏检测显色剂的体积比为5：5：1。
图2为本发明提供的结核分枝杆菌药敏检测方法的另一实施例，请参阅图2，在本实施例中，步骤S30包括：
步骤S31、将不同浓度梯度的药物溶液对应置于孔板的试验孔中，然后向含有药物溶液的试验孔中加入结核分枝杆菌菌液，将孔板置于37℃温度下进行恒温培养；
步骤S32、于恒温培养第5天，向试验孔中加入结核分枝杆菌药敏检测显色剂，继续恒温培养4～24h后，观察结核分枝杆菌药敏检测显色剂是否出现颜色变化，若结核分枝杆菌药敏检测显色剂出现颜色变化，判定为所述结核分枝杆菌对所述待测药物具有耐药性，若结核分枝杆菌药敏检测显色剂无颜色变化，判定为所述结核分枝杆菌对所述待测药物敏感。
需要说明的是，一般情况下，在加入所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂后继续培养4h，即可观察出所述结核分枝杆菌药敏检测显色剂的颜色变化，如果此时的颜色变化不明显，可适当延长恒温培养时间，然后再进行判定，其中，最多延长恒温培养时间至24h，即可观察出所述XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂是否出现颜色变化。此外，本发明提供的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂，在与7H9培养基共孵育时，其稳定性至少可以保持7天，在4℃储存条件下，其显色性能至少能持续30天，而在25℃储存条件下，其显色性能可以保持10天。
综上，本发明提供的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂在用作结核分枝杆菌药敏性检测的指示剂时，检测方法简单且反应迅速，能够快速出现肉眼可见的颜色变化，得到稳定可靠的检测结果，从而缩短结核分枝杆菌药敏检测的检测周期，实现结核分枝杆菌的快速药敏检测，同时还具有性能稳定、对细胞毒性低的优点。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
以40株药敏结果明确(采用固体培养法培养)的结核结核分枝杆菌临床分离株(包括敏感株、耐药株、耐多药株和广泛耐药株各10株)为试验菌株，以本发明提供的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂为显色剂，以抗结核药物利福平(RFP)和异烟肼(INH)为试验药物，对结核结核分枝杆菌菌株耐RFP、耐INH以及同时耐RFP和INH的情况进行评估，具体操作方法如下：
(1)结核分枝杆菌菌液的配制：
以含有0.05％的吐温80和10％的OADC的7H9液体培养基为培养基，将结核结核分枝杆菌菌株活化后，挑取单菌落转移至7H9液体培养基中培养至结核结核分枝杆菌生长至对数期时，吸取菌液，用直径为4mm的玻璃珠旋涡振荡5min，取上层悬浊液用7H9液体培养基比浊至0.5麦氏浊度，得到结核结核分枝杆菌菌液。
(2)药物溶液的配制：
以含有0.05％的吐温80和10％的OADC的7H9液体培养基为溶剂，分别配制RFP溶液、INH溶液和RFP+INH溶液，其中，RFP溶液中RFP的终浓度分别为0.012μg/mL、0.006μg/mL、0.003μg/mL、0.0015μg/mL和0.00075μg/mL；INH溶液中INH的终浓度分别为1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.0625μg/mL和0.03125μg/mL；RFP+INH溶液中，RFP和INH的终浓度分别为0.00075μg/mL和0.03125μg/mL(RFP和INH的药敏折点值对应设置为2μg/mL和0.25μg/mL)。
(3)药敏检测：
将孔板中的所有孔对应分为试验组(包括RFP组、INH组、RFP+INH组)和对照组(包括RFP组、INH组、RFP+INH组)，向试验组和对照组的孔中对应加入100μL不同浓度梯度的RFP溶液、INH溶液和RFP+INH溶液，然后向所有孔中同时加入100μL的结核结核分枝杆菌菌液，于37℃温度下进行恒温培养；
于恒温培养的第5天，向试验组的孔中加入20μL的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显色剂，再继续恒温培养4h，观察试验组的XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显示剂的颜色是否需由无色或淡黄色变化为深黄色或棕色，如果变色则判定该结核结核分枝杆菌为耐药菌株，如果不变色则判定为该结核结核分枝杆菌为敏感菌株(如果变色不明显，最长可继续培养至24h再进行判定)；同时，于恒温培养的第5天，向对照组的孔中加入20μL的刃天青显色剂(浓度为0.1g/L)，再继续恒温培养24h，观察对照组的刃天青显色剂是否由蓝色变为紫红色，如果变色则判定该结核结核分枝杆菌为耐药菌株，如果不变色则判定该结核结核分枝杆菌为敏感菌株(如果变色不明显，可再继续培养24h再进行判定)。
以固体培养法作为标准，评价XTT/mPMS结核分枝杆菌药敏检测显示剂和刃天青显色剂对结核结核分枝杆菌的药敏检测结果，如表1所示。
表1实施例1中结核结核分枝杆菌的药敏检测结果
由表1中的检测结果可知，在RFP和INH两种药物的检测中，XTT/mPMS结核结核分枝杆菌药敏检测显色剂的敏感度(耐药株)和特异性(敏感株)都达到90％以上，阳性预测值和阴性预测值也都比较高。在临床实验中，试验组(即XTT/mPMS结核结核分枝杆菌药敏检测显色剂组)多在5至6天即可获得药敏检测结果，而刃天青显色剂组多在6至7天才能获得药敏检测结果，因此，相比于以刃天青显色剂进行的结核结核分枝杆菌药敏检测，使用本发明提供的XTT/mPMS结核结核分枝杆菌药敏检测显色剂能够缩短结核结核分枝杆菌的药敏检测周期，提高检测效率，还具有在临床检测中不受临床药物浓度干扰的优点。
综上所述，使用本发明提供的结核分枝杆菌药敏检测显色剂进行结核结核分枝杆菌的药敏检测，其操作方法简单且反应迅速，检测结果直观可靠，同时还具有性能稳定、对细胞毒性低、不受临床药物浓度干扰的优点。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。