本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体的说，涉及一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypellasp.d-1)中经提取、分离纯化得到的一类含氧五元环的海松烷二萜类化合物、制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
由于两极地区低温、反复冻融和强辐射的特殊环境，使极地微生物为了适应极端的生存环境，可能具有与温带、热带微生物不同的分子生物学机制和生理生化特征，并产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。因而，对极地微生物次级代谢产物的研究越来越受到国内外研究的关注。
eutypellasp.d-1分离自北极高纬度(78°55’n)，隶属于子囊菌门ascomycetes、炭角菌目xylariales、胶孢壳科diatrypaceae、弯孢聚壳属eutypella。目前，对于该种属的次级代谢产物研究的比较少，仅有部分报道，该种属的次级代谢产物主要包括桉烷型倍半萜、海松烷二萜、三萜、苯并吡喃衍生物、聚酮类(如：γ-内酯)以及含氮的化合物(如：细胞松弛素、环肽)等。这些化合物都显示了一定的生物活性，如从该菌株中分离得到的化合物libertellenoneh对人乳腺癌细胞株mcf-7生长的抑制率最高，ic50达到了3.31μm，比阳性对照紫杉醇的抑制效果更好(参见文献：lux-l,liuj-t,liux-y,gaoy,zhangj-p,jiaob-h,zhengh.pimaranediterpenesfromthearcticfunguseutypellasp.d-1.thejournalofantibiotics2014,67:171-174.)。
至今未见从该属真菌中分离得到具有抗肿瘤活性的含氧五元环的海松烷二萜类化合物的报道。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypellasp.d-1)中经提取、分离纯化得到的一中新的含氧五元环的海松烷二萜类化合物。
本发明的另一目的是提供一种所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种从北极土壤弯孢聚壳属真菌d-1(eutypellasp.d-1)中经提取、分离纯化得到的一种含氧五元环的海松烷二萜类化合物，其化学结构如式(ⅰ)所示：
eutypellenonee，为黄色油状物，分子式c26h34o8，分子量：474；高分辨质谱：492.2590[m+nh4]+，1h和13c核磁共振谱数据见表1。
eutypellenonee的结构母核属于海松烷型二萜类，具有多羟基取代和高不饱和度的特点，是真菌次级代谢产物中一类重要的二萜类化合物。
本发明所用的菌种是分离自北极
本发明的第二方面提供了所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
1、制备总粗提物
1)从平板上挑取少量保藏号为cctccno：m2013144的eutypellasp.d-1的菌株的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的种子培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天获得一级种子液，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养3.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养。然后将种子培养液接种到2000ml的锥形瓶中进行扩大培养，每个锥形瓶装400ml的发酵培养基，按照5％(v/v)的接种量接入新鲜二级种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d。当发酵培养至72h、96h、120h时，等量添加乙醇，添加终浓度为4％；
所述种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l。
所述发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l。
2)将步骤1)中培养得到的菌液过滤，分别获得菌丝体和菌液，菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂，将菌丝体用二氯甲烷：甲醇＝1:1超声提取3次(30min/次)，浓缩提取液至有机溶剂挥干，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，最后合并菌液、菌丝体所得浸膏，得总粗提物50g。
2、分离纯化
1)将总粗提物溶于乙酸乙酯中，经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:乙酸乙酯＝60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到12个组分fr.a-l；
2)对组分fr.h进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为70％-100％甲醇/水，流速8ml/min，洗脱4h，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到9个组分fr.h1-h9；对组分fr.h2进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为60％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长为252nm，保留时间为37.0分钟，得到所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物eutypellenonee。
本发明的第三方面提供了所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤为乳腺癌、结肠癌、慢性白血病、胰腺癌。
体外活性试验证明，对人胰腺癌细胞panc-1、人乳腺癌细胞mcf-7、人结肠癌细胞hct-116、人慢性白血病细胞k562、人胰腺癌细胞sw1990等多种不同的肿瘤细胞均有一定的抑制活性，其中对人胰腺癌细胞panc-1，人乳腺癌细胞mcf-7，人结肠癌细胞hct-116，人慢性白血病细胞k562，人胰腺癌细胞sw1990的ic50值分别为1.14、2.34、8.71、3.37以及3.60μm。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明的化合物经体外活性试验证明，对人胰腺癌细胞panc-1、人乳腺癌细胞mcf-7、人结肠癌细胞hct-116、人慢性白血病细胞k562、人胰腺癌细胞sw1990等多种不同的肿瘤细胞均有强烈的抑制活性，可用于制备抗肿瘤药物。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2013年4月12日
保藏编号：cctccno：m2013144
分类命名：弯孢聚壳菌d-1(eutypellasp.d-1)
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所用的菌种是分离自北极
实施例1.制备本发明化合物
1、制备总粗提物
1)从平板上挑取少量保藏号为cctccno：m2013144的eutypellasp.d-1的菌株的菌丝体，接种到250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装100ml的种子培养基，28℃摇床恒温培养，转速180r/min，培养3.5天获得一级种子液，按照5％(v/v)接种量接入相同种子培养基，于28℃、180r/min摇床培养3.5d，获得新鲜二级种子液，用于发酵培养。然后将种子培养液接种到2000ml的锥形瓶中进行扩大培养，每个锥形瓶装400ml的发酵培养基，按照5％(v/v)的接种量接入新鲜二级种子液，置于20℃、180r/min摇床培养10d。当发酵培养至72h、96h、120h时，等量添加乙醇，添加终浓度为4％；
所述种子培养基配方为：葡萄糖125g/l，硝酸钠3.3g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，酵母提取物0.7g/l，六水氯化钴3.125mg/l，硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，l-鸟氨酸盐酸盐15g/l。
所述发酵培养基配方为：蔗糖51.4g/l，硝酸钠3.3g/l，尿素2.5g/l，酵母提取物0.7g/l，三水磷酸氢二钾0.07g/l，七水硫酸镁0.4g/l，氯化钾0.625g/l，七水硫酸亚铁18.75mg/l，无水氯化钙6.5g/l，六水氯化钴3.125mg/l。
2)将步骤1)中培养得到的菌液过滤，分别获得菌丝体和菌液，菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液蒸干溶剂，将菌丝体用二氯甲烷：甲醇＝1:1超声提取3次(30min/次)，浓缩提取液至有机溶剂挥干，加水混悬，用等体积乙酸乙酯萃取3次，最后合并菌液、菌丝体所得浸膏，得总粗提物50g。
2、分离纯化
1)将总粗提物溶于乙酸乙酯中，经减压液相柱色谱(vlc)，以石油醚:乙酸乙酯＝60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1，0:1为溶剂进行梯度洗脱，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到12个组分fr.a-l；
2)对组分fr.h进行反相中压液相色谱，进行梯度洗脱，条件为70％-100％甲醇/水，流速8ml/min，洗脱4h，根据tlc薄层层析显色合并相似流分，得到9个组分fr.h1-h9；对组分fr.h2进行正相硅胶柱色谱，最后经反相高效液相，条件为60％乙腈/水，流速2ml/min，检测波长为252nm，保留时间为37.0分钟，得到所述含氧五元环的海松烷二萜类化合物eutypellenonee。
3、结构鉴定
本发明化合物经nmr、hresims、ir、uv等多种现代光谱技术，确定了本发明化合物的化学结构如式(ⅰ)所示。
本发明化合物的分子式为c26h34o8：黄色油状物；uv(meoh)(logε)λmax211.0(3.62),250.0(3.23)nm；ir(kbr)νmax3353,2972,2928,1734,1640,1537,1463,1370,1298,1242,1200,1159,1081,1031,987,947,921cm-1；hresimsm/z492.2590[m+nh4]+(calcdforc26h38no8,492.2592)。1hand13cnmr核磁共振谱数据见表1。
表1eutypellenonee的核磁共振谱数据
ameasuredat500mhzincdcl3；bmeasuredat100mhzincdcl3
实施例2本发明化合物的体外抗肿瘤活性实验：
方法：cck8法(tominagah,ishiyamam,ohsetof,etal.awater-solubletetrazoliumsaltusefulforcolorimetriccellviabilityassay[j].analyticalcommunications,1999,36(2):47-50.)
分别取对数生长期的人胰腺癌细胞panc-1、人乳腺癌细胞mcf-7、人结肠癌细胞hct-116、人慢性白血病细胞k562、人胰腺癌细胞sw1990，各以5000个/孔的细胞密度接种于96孔板中，置于37℃浓度为5％的co2恒温培养箱中培养。24h后向96孔板中加入不同浓度样品10μl，使板中溶液终体积为100μl，于培养箱内继续培养48h后，加入10μlcck-8溶液继续孵育约1h后取出，用酶标仪检测450nm处吸光度(od值)。每个待测样品在测试过程中均设置五至六个浓度梯度，并设置六个复孔作为平行实验，在实验结果中以标准偏差(sd)表示。计算待测样品对肿瘤细胞生长的抑制率的公式为：抑制率＝[对照组od值-加药组od值]/对照组od值×100％，半数抑制量ic50值采用logit法计算，结果见表2：
表2化合物eutypellenonee对肿瘤细胞的半数有效抑制浓度(μm)
由表2可见，化合物eutypellenonee对多种不同的肿瘤细胞株均表明有强烈的抑制作用，因此可用于制备抗肿瘤药物。
本发明为研制新的抗肿瘤药提供了新的先导化合物。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。