本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫缺陷小鼠模型的新应用，尤其涉及一种nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠模型在体内扩增和体内示踪人肝细胞的应用。
背景技术：
肝脏是人体最大最主要的生化反应脏器，也是药物损伤的主要靶器官。已发现近1000种药物与肝损伤有关，肝损伤是导致药物从市场撤除的最常见单个原因。在美国，一半以上的急性肝衰竭由药物引起，最常见的药物是扑热息痛(paracetamol)，即对乙酰氨基酚或醋氨酚(aap)。aap相关性急性肝衰竭的年发生率已从1998年的28％升至2003年的51％。在非aap引起的急性肝衰竭病例中，抗菌药特别是抗结核药为主要的肝损伤药物。尽管如此，药物性肝损伤的发病率和严重性仍被大大低估。据估计每100例接受药物治疗的患者中约有1例在住院期间发生药物性肝损伤。
目前，药物在进入临床试验阶段前，需要经过实验动物的体内验证，但其中仅有8％的药物可以通过临床试验被应用于人体疾病治疗。而候选药物在人体临床试验三期的淘汰率超过50％，极大地加重了新药研发的资金投入和风险，降低了药物的成药概率。造成临床试验通过率低的一个重要原因是，非人种属的临床前动物实验无法准确预测药物在人体内的代谢通路和代谢产物，以及代谢过程的中间产物对机体的潜在损伤作用。在对人体具有显著药物性肝损伤的药物中，约50％的药物在动物实验中表现出低毒性或无毒性。在抗病毒药物非阿尿苷(fialuridine，fiau)的二期临床试验中，15名患者中有7名出现了严重的药物性肝损伤，其中有5名患者在接受肝移植治疗后仍然死亡。造成该严重临床试验事件的原因是一种在线粒体中表达且具有显著种族差异的蛋白——人类平衡核苷转运体1(hent1，humanequilibrativenucleotidetransporter1)，对fiau诱导产生的毒性十分敏感。因此，种属特异性是新药临床前研究中需要考虑的重要因素之一。
目前，研究人员主要通过体外培养人体肝细胞模拟药物在人体的代谢过程，评估药物代谢对肝脏的损伤作用。然而，肝细胞体外毒性评估模型无法准确重现药物在体内复杂的代谢过程，也无法模拟活体器官中组织依赖性的药物处置通路。因此，提供一种活体模型进行体内扩增人原代肝细胞，从而模拟药物在活体器官中的代谢，具有重要意义。
cn102460162a公开了体内扩增人肝细胞的方法，所述方法包括将人肝细胞移植到免疫缺陷(rag-/-缺陷，b6小鼠背景)且fah缺陷的小鼠，所述小鼠还有il-1r缺陷或被给予il-1r拮抗剂，并允许所述肝细胞扩增，然而，该发明的小鼠模型需要il-1r缺陷或需要il-1r拮抗剂，免疫性较强，移植人肝细胞后容易发生排斥反应。
因此，研制一种免疫缺陷程度高的小鼠进行人肝细胞移植，不发生排斥反应，在生物医药领域具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种免疫缺陷小鼠模型的新应用，所述nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠免疫缺陷程度高，移植人体细胞后不产生排斥反应，可用于人肝细胞的体内扩增和体内示踪。
为达此目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠模型在体内扩增和/或示踪人体细胞的应用。
本发明中，nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠模型在现有免疫缺陷程度较高的小鼠模型(nod/scid/il2rg-/-)基础上，进一步通过基因打靶技术敲除fah基因获得。与nod/scid/il2rg-/-相比，nod/rag-/-/il2rg-/-/fah-/-小鼠免疫缺陷程度更高，对人体细胞的排斥作用更少。nod/scid/il2rg-/-小鼠具有以下优势：
(1)补体缺乏：补体系统是一个多蛋白质成分的先天免疫系统，可以帮助抗体和吞噬细胞破坏和清除机体的病原体，补体蛋白形成的复合物可以在异种细胞膜上钻孔从而裂解入侵细胞，nod/scid/il2rg-/-小鼠缺乏功能性c5，补体蛋白不能生成；
(2)nk细胞缺失：nk细胞在先天免疫系统中属于细胞毒性细胞，在没有抗体的情况下可以对被病毒感染的细胞迅速作出反应，更重要的是，nk细胞是最主要的妨碍人类造血细胞移植到小鼠的因素，nod/scid/il2rg-/-小鼠的nk细胞缺失很大程度地促进了人类细胞的异种移植；
(3)巨噬细胞和抗原呈递细胞变异和功能缺失：巨噬细胞和抗原呈递细胞是吞没病原体的重要免疫细胞，抗原最终是在抗原呈递细胞的表面由病原体衍生而来，抗原在适应性免疫反应方面具有重要作用，nod/scid/il2rg-/-小鼠的巨噬细胞保留了很多不成熟的巨噬细胞的特性，功能很弱；
以上的这些属性使得具有nod/scid/il2rg-/-基因背景的小鼠是非常理想化的异种移植模型，再结合fah-/-缺失，产生的新小鼠可以更好地用于人类肝脏等细胞的异种移植。
本发明中，nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠除了具有nod、scid、il2rg缺陷和fah缺陷外，不需要任何其他类型的基因缺陷，具有非常高的免疫缺陷程度，是一种优异的细胞异种移植模型；同时，nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠仅需在nod/scid/il2rg-/-小鼠上敲除fah基因即可制备得到，制备方法简单。
优选地，所述小鼠模型为fah基因表达缺陷型小鼠。
优选地，所述小鼠模型缺乏功能性t细胞、b细胞或nk细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述人体细胞包括人肝细胞、人胃细胞、人肾细胞或人肺细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为人肝细胞。
优选地，所述人体细胞标记有荧光素酶。
本发明中，通过采用荧光素酶标记人体细胞，可以活体观测人体细胞在小鼠体内的迁移路径，实现体内示踪。
第二方面，本发明提供一种体内扩增人体细胞的方法，包括以下步骤：
(1)将人原代体细胞移植入nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠体内；
(2)饲养步骤(1)所述小鼠。
优选地，步骤(1)所述人原代体细胞的浓度为104-106个/kg，例如可以是104个/kg、105个/kg或106个/kg，优选为105个/kg。
优选地，步骤(1)所述移植的器官为脾脏。
优选地，步骤(2)所述饲养的时间为1-8个月，例如可以是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月或8个月，优选为2-6个月。
优选地，步骤(2)所述饲养的饮水添加有尼替西农。
优选地，所述尼替西农的浓度为5-10mg/l，例如可以是5mg/l、5.2mg/l、5.5mg/l、5.8mg/l、6mg/l、6.2mg/l、6.5mg/l、6.8mg/l、7mg/l、7.2mg/l、7.5mg/l、7.8mg/l、8mg/l、8.2mg/l、8.5mg/l、8.8mg/l、9mg/l、9.2mg/l、9.5mg/l、9.8mg/l或10mg/l，优选为7.5mg/l。
本发明中，nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠是一种t细胞、b细胞和nk细胞严重缺陷和fah基因缺陷小鼠，饲养于spf环境中，饮水需添加尼替西农(nitisinone，ntbc)，ntbc撤销后，nsif小鼠逐渐发生肝脏损伤，于3-5周内死亡。
优选地，在步骤(1)之前还包括体外分离人原代体细胞的步骤。
优选地，所述体外分离人原代体细胞采用胶原酶二步灌注法。
第三方面，本发明提供一种体内示踪人体细胞的方法，包括以下步骤：
(1’)将人原代体细胞与荧光素酶慢病毒共培养，得到标记有荧光素酶的人原代体细胞；
(2’)将步骤(1’)所述人原代体细胞移植入nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠体内，并进行饲养；
(3’)注射荧光素酶底物，进行体内示踪检测。
优选地，步骤(1’)所述荧光素酶慢病毒的制备方法包括以下步骤：
(1”)将质粒pwpxld-luc-2a-gfp、pspax.2和pmd2g的混合液与聚醚酰亚胺混匀；
(2”)加入哺乳细胞中，培养后收集病毒。
本发明中，采用聚醚酰亚胺(pei)向哺乳细胞中转染pwpxld-luc-2a-gfp双标活体成像质粒，包装质粒为pspax.2和pmd2g。
优选地，步骤(1”)所述pwpxld-luc-2a-gfp、pspax.2和pmd2g的质量比为(1-5):(1-5):1，例如可以是1:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、2:1:1、2:2:1、2:3:1、2:4:1、2:5:1、3:1:1、3:2:1、3:3:1、3:4:1、3:5:1、4:1:1、4:2:1、4:3:1、4:4:1、4:5:1、5:1:1、5:2:1、5:3:1、5:4:1或5:5:1，优选为2:2:1。
优选地，步骤(1”)所述混合液与所述聚醚酰亚胺的体积比为(1-5):1，例如可以是1:1、2:1、3:1、4:1或5:1，优选为3:1。
优选地，步骤(2”)所述哺乳细胞为293t细胞。
优选地，步骤(2’)所述人原代体细胞的浓度为104-106个/kg，例如可以是104个/kg、105个/kg或106个/kg，优选为105个/kg。
优选地，步骤(2’)所述移植的器官为脾脏。
优选地，步骤(2’)所述饲养的时间为1-8个月，例如可以是1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月或8个月，优选为2-6个月。
优选地，步骤(2’)所述饲养的饮水添加有尼替西农。
优选地，所述尼替西农的浓度为5-10mg/l，例如可以是5mg/l、5.2mg/l、5.5mg/l、5.8mg/l、6mg/l、6.2mg/l、6.5mg/l、6.8mg/l、7mg/l、7.2mg/l、7.5mg/l、7.8mg/l、8mg/l、8.2mg/l、8.5mg/l、8.8mg/l、9mg/l、9.2mg/l、9.5mg/l、9.8mg/l或10mg/l，优选为7.5mg/l。
优选地，步骤(3’)所述荧光素酶底物的浓度为100-200mg/kg，例如可以是100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、190mg/kg或200mg/kg，优选为150mg/kg。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述体内扩增人体细胞的方法和/或如第三方面所述体内示踪人体细胞的方法在探究小分子药物在人体代谢途径的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠免疫缺陷程度高、肝脏损伤诱导可控，移植人肝细胞后不产生排斥反应，可作为人肝细胞的体内扩增模型；
(2)移植人肝细胞后，通过饲喂7.5mg/l尼替西农，提高了nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠的生存比例，小鼠血清中人白蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量以及小鼠肝脏中人alu基因的表达量均显著提高；
(3)移植人肝细胞后，nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠肝脏中人肝细胞的数量显著提高；
(4)通过向nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠移植标记有荧光素酶的人肝细胞，实现了人肝细胞在小鼠体内的示踪，为探究小分子药物在人肝脏中的代谢途径提供了模型。
附图说明
图1为移植人肝细胞后的nsif小鼠的生存曲线；
图2为移植人肝细胞后的小鼠血清中人白蛋白含量；
图3为移植人肝细胞后的小鼠血清中谷丙转氨酶含量；
图4为移植人肝细胞后的小鼠血清中谷草转氨酶含量；
图5为人alu基因在移植小鼠肝脏中的表达；
图6为人肝细胞占小鼠肝细胞的比例的流式细胞图；
图7为人肝细胞在小鼠肝脏中的形态学染色图；
图8为免疫组化染色显示人肝细胞特异标志物fah；
图9为免疫组化染色显示人肝细胞特异标志物ck-8/18；
图10为免疫组化染色显示人肝细胞特异标志物人白蛋白；
图11为荧光素酶报告基因标记人肝细胞及流式检测；
图12为活体成像显示荧光素酶标记的人肝细胞特异迁移到小鼠肝脏；
图13为移植人肝细胞后，小鼠血清中人白蛋白分泌量与荧光强度成正相关；
图14为异喹胍体内代谢检测结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1人原代肝细胞体内扩增
(1)人原代细胞体外分离
采用胶原酶两步灌注法分离新鲜供者的人原代肝实质组织，具体方法为：无菌条件下将新鲜肝脏组织首先采用添加0.4mm乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)的pbs缓冲液灌注15分钟(流速为5ml/min)；随后采用添加0.1mg/ml胶原酶iv和2mmca2+的pbs缓冲液继续灌注15分钟(流速为2ml/min)；消化充分后，用眼科镊轻轻抖动肝细胞，释放单个肝脏细胞，未消化完全的组织采用0.1mg/ml胶原酶iv继续消化20分钟，获得大量肝细胞；将上述细胞用添加10％胎牛血清的dmem培养基以50g转速离心3次，每次3分钟；细胞计数后用于小鼠移植。
(2)nod/scid/il2rg-/-/fah-/-(nsif)小鼠饲养
nsif小鼠是一种t细胞、b细胞和nk细胞严重缺陷和fah基因缺陷小鼠，饲养于spf环境中，饮水添加7.5mg/l尼替西农(nitisinone，ntbc)，ntbc撤销后，nsif小鼠逐渐发生肝脏损伤，于3-5周内死亡。
(3)人肝细胞移植nsif小鼠
移植人肝细胞前一周，小鼠饮水中不添加ntbc，将分离的人肝细胞于24内移植入小鼠，具体为向麻醉的小鼠脾脏内注射105-107个活的人肝细胞(台盼蓝染色排除死细胞)，移植后体重下降至20％时恢复ntbc饮水一周，体重恢复后饮水不添加ntbc。
小鼠重建后，如图1所示，小鼠的体重增加，生存率提高。
小鼠眼球采血约100ml，室温放置2h后，1000g离心5min，小心收集上层血清，检测血清中人白蛋白(halb)、谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)的含量。
如图2所示，血清中人白蛋白含量在12周内逐渐上升；如图3-4所示，谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量较对照组小鼠显著提高。
如图5所示，通过检测alu基因在移植小鼠肝脏中的表达水平，发现小鼠的外周血免疫系统重建状况良好。
实施例2移植人肝细胞后的小鼠肝脏检测
(1)流式检测
取小鼠肝脏组织加入抗体阻断受体，避光条件下加入荧光标记抗体hla-a/b/c和mhc-i，标记结束后用pbs缓冲液冲洗两次后进行流式检测。
结果如图6所示，停止添加ntbc后，小鼠肝脏细胞中人肝细胞的比例明显上升。
(2)h&e染色
将小鼠肝脏脏器置于中性甲酸溶液中固定过夜，使用浓度递增的乙醇溶液脱水，在二甲苯中变透明后浸蜡处理，包埋形成尺寸合适的蜡块；用切片机将组织切割为4-6μm切片后，进行脱蜡和水化处理；水化后的切片经苏木精染色、流水冲洗、伊红染色、流水冲洗后，再经过脱水变透明，中性树胶封片，晾干；显微镜下拍照分析。
结果如图7所示，人肝细胞分布在小鼠的肝脏中，保持正常的细胞形态。
(3)免疫荧光
小鼠肝脏组织采用与h&e染色相同的步骤进行固定、脱水、包埋、切片、脱蜡和水化后，根据需要用柠檬酸盐溶液进行抗原修复，去除内源性过氧化物酶；pbs清洗两遍后进行bsa封闭，室温孵育30min，洗去多余的封闭液，滴加稀释好的一抗，室温孵育1h；pbs清洗3遍，加荧光标记二抗，室温孵育1h，pbs清洗3遍，滴加中性树胶封片，显微镜下拍照分析。
结果如图8-10所示，小鼠肝脏中表达人肝细胞特异标志物fah、ck-8/18和人白蛋白。
实施例3人原代肝细胞体内示踪
(1)细胞培养皿预包被
采用0.1％明胶(gelatin)预包被培养皿或培养板，具体为：将1ml1％明胶溶于10mldmem培养基中，加入到60mm培养皿中，轻轻晃动使液体覆盖整个皿底部，置于37℃培养箱中4h，取出培养皿，吸去多余上清，加入dmem培养基清洗2次，备用。
(2)人原代肝细胞培养
分离供体肝细胞，调整细胞浓度为5×105/cm2，接种于gelatin包被的60mm培养皿中，培养基为添加10％fbs+1％双抗+10nm/ml肝细胞生长因子(hgf)的dmem培养基；置于5％co237℃培养箱中培养4h后，更换新鲜培养基去除部分未贴壁细胞；每2天更换新鲜培养基。
人原代肝细胞不能传代，体外培养约14天。利用表达荧光素酶基因的慢病毒转染肝细胞，进行人原代肝细胞的荧光标记。
(3)荧光素酶慢病毒包装
将293t细胞以2×105个ml的密度传代于100mm的培养皿中，用含10％fbs的dmem培养液培养，37度下在5％co2培养箱中过夜，使其生长到80％汇合度；将质粒pwpxld-luc-2a-gfp(10μg)、pspax.2(10μg)和pmd2g(5μg)与无血清无双抗的a-mem混合均匀，室温静止5min，加入混合液三分之一体积的聚醚酰亚胺(pei)，混匀后室温静置20min；逐滴加入293t细胞培养皿中，轻轻混合均匀，37℃下在5％co2培养箱中培养6h；更换为dmem培养液继续培养，转染后24h观察绿色荧光表达情况，24、48和72后小时收集病毒。
(4)荧光素酶标记人肝细胞移植nsif小鼠及体内示踪
nsif小鼠腹腔注射1％戊巴比妥进行麻醉，固定小鼠呈俯卧位，于背侧中部、左侧腋中线与腋后线间，取5mm切口进腹，显露脾脏，并拉出切口外，用胰岛素针针头于脾脏上极进针，深度约1.5cm，缓慢注入荧光素酶标记人肝细胞(5×105)；缓慢注入过程中可见注射部位的脾脏被膜变白及肿胀，拔出针头，于针眼处夹持片刻，查看无出血，将脾脏放回原位，全层缝合腹壁，术后继续在spf条件下饲养，每日密切观察；活体成像前10min，向小鼠腹腔注射150mg/kg荧光素酶底物，再用异氟烷麻醉，置于ivisspectrum操作台中进行活性检测。
如图11所示，荧光素酶标记的人肝细胞的感染比例达到53.6％。
如图12所示，荧光素酶标记的人肝细胞特异地迁移到小鼠肝脏部。
如图13所示，移植人肝细胞后，小鼠血清中人白蛋白的分泌量与荧光强度成正相关。
实施例4人原代细胞的体内功能验证
移植人肝细胞8至12周后，向nsif小鼠内口服或胃静脉注射2mg/kg异喹胍(deb)，分别于1、2、4和8h后采集血液样本，离心分离血浆；通过hplc系统定量分析4-ohdeb。
如图14所示，特异代谢药物异喹胍在人源化肝脏模型中的含量在注射2小时后达到最高值，在注射8小时后降为最低值，说明人源化肝脏模型对异喹胍具有较强的代谢能力。
综上所述，本发明的nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠免疫缺陷程度高、肝脏损伤诱导可控，移植人肝细胞后不产生排斥反应，可作为人肝细胞的体内扩增模型；移植人肝细胞后，通过饲喂尼替西农，提高了nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠的生存比例，小鼠血清中人白蛋白、谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量以及小鼠肝脏中人alu基因的表达量均显著提高，小鼠肝脏中人肝细胞的数量显著提高；向nod/scid/il2rg-/-/fah-/-小鼠移植标记有荧光素酶的人肝细胞，实现了人肝细胞在小鼠体内的示踪，为探究小分子药物在人肝脏中的代谢途径提供了模型。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。