本发明属于突变检测领域，更具体地，本发明创立了一种同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用。
背景技术：
：聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)在1985年由美国karybmullis教授发明，该技术采用一对寡核苷酸引物，通过变性、退火、延伸三个循环步骤，可使目标dna片段呈指数扩增，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力。pcr技术是一个极其灵敏的信号放大系统，能将极微弱的基因信号检测出来。将pcr扩增技术和荧光探针技术相结合，开发出了多种多样的荧光pcr检测方法，目前在医学、微生物学、遗传学等领域广泛使用。dna分子中发生碱基对的插入、缺失或替换，而引起的基因结构的改变，称为基因突变。通过检测样品中是否存在某些核酸序列变异，可以判断检测对象是否携带突变基因、患有某种疾病或处于某种遗传状态。基因突变检测技术已经广泛应用于生命科学的众多领域，包括病原微生物的鉴定、分型和耐药性检测，肿瘤患者的药效预测，疾病诊断与预后等。dna甲基化是最重要的基因表观修饰方式之一。dna甲基化能抑制某些基因的活性，去甲基化则可以诱导基因的重新活化和表达。哺乳动物中，dna的甲基化仅发生于cpg的胞嘧啶上，在dna甲基化转移酶(dnmts)的作用下使cpg二核苷酸中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mc)。这种dna修饰方式并没有改变基因序列，但是它可以调控基因的表达。dna甲基化在维持正常细胞功能、染色质结构修饰、x染色体失活、基因组印迹、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。在肿瘤细胞中，基因突变和甲基化修饰都是较为常见的现象。特定基因的突变和甲基化对于肿瘤患者的分型、预后判断、用药指导等方面都有重要的参考价值。比如：kras基因突变的大肠癌患者不能从抗egfr治疗中获益，egfr基因突变的肺癌患者使用吉非替尼和厄洛替尼治疗的效果较好，braf基因突变的大肠癌患者和甲状腺癌患者一般预后较差，mgmt基因发生甲基化的脑胶质瘤患者可以选择替莫唑胺进行术后化疗，mlh1基因发生甲基化的大肠癌患者可以排除遗传性大肠癌的可能性。对于基因突变的检测，通常采用基因组dna作为模板，直接进行pcr扩增。而对于甲基化的检测，应用最为广泛的是重亚硫酸盐转化法。该方法采用重亚硫酸钠(na2s2o5)处理样本dna，将没有发生甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，而发生甲基化的胞嘧啶(mc)保持不变；转化产物经过pcr扩增后，u转变为t，而mc转变为c，从而将基因组上的甲基化和非甲基化的差异转变成为c/t碱基的多态性，通过检测目标位点上的c/t碱基状态，就可以确定是否存在基因的甲基化。突变检测直接扩增基因组dna，甲基化检测扩增重亚硫酸盐转化后的dna。因为扩增的dna模板不同，所以针对这两种不同类型的基因检测，一般是在不同反应体系中进行的。而在同一个反应体系中同步进行基因突变和甲基化检测的方法还未见报道和应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用。在本发明的第一方面，提供一种同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的方法，所述方法包括：(1)对待测样本进行重亚硫酸盐处理，使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)；(2)设置反应体系a，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测基因突变的引物和探针、甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；设置反应体系b，以步骤(1)处理后样本为模板，加入特异性检测甲基化修饰的引物和探针、基因突变区段的通用引物和探针；(3)反应体系a和反应体系b分别进行pcr反应，确定相关的基因突变和甲基化修饰的存在与否或存在量。在另一优选例中，所述的方法是非诊断、非治疗性的方法。在另一优选例中，述的基因突变包括：位于核酸上的碱基替换、缺失或插入；或所述的甲基化修饰包括：cpg位点甲基化修饰。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物和探针，仅扩增和检测发生基因突变的核酸区段；所述的特异性检测甲基化修饰的引物和探针，仅扩增和检测发生甲基化修饰的核酸区段；所述的基因突变区段的通用引物和探针，同时扩增和检测突变型和野生型核酸区段；所述的甲基化修饰检测区段的通用引物和探针，同时扩增和检测发生甲基化修饰和未发生甲基化修饰的核酸区段。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针为同一探针，所述的特异性检测基因突变的引物中，包括一条针对基因突变位点的引物及一条非针对突变位点的引物；较佳地，突变检测通用引物的其一与该针对基因突变位点的引物序列相近，但不包含突变位点，突变检测通用引物的另一与该非针对突变位点的引物相同；或所述的特异性检测甲基化修饰的引物与甲基化修饰检测区段的通用引物相同，但特异性检测甲基化修饰的探针与甲基化修饰检测区段的通用探针不同(前者针对甲基化修饰待测位点，后者针对非甲基化修饰待测位点)。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物与所述的基因突变区段的通用引物相同，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针不同(前者针对突变位点，后者针对非突变位点)；或所述的特异性检测甲基化修饰的探针与甲基化修饰检测区段的通用探针为同一探针，所述的特异性检测甲基化修饰的引物中，包括一条针对甲基化修饰的引物及一条非针对甲基化修饰的引物；较佳地，甲基化修饰检测区段的通用引物的其一与该针对甲基化修饰的引物序列相近，但不包含cpg位点，甲基化修饰检测区段通用引物的另一与该非针甲基化修饰的引物相同。在另一优选例中，反应体系a中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的甲基化修饰检测区段的通用探针，携带不同的报告信号；反应体系b中，所述的特异性检测甲基化修饰的探针与所述的基因突变区段的通用探针，携带不同的报告信号；在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的探针与所述的基因突变区段的通用探针，携带相同的报告信号；所述的特异性检测甲基化修饰的探针与所述的甲基化检测区段的通用探针，携带相同的报告信号；从而对所述基因突变和所述甲基化修饰进行同步检测；较佳地，所述的报告信号为荧光基团。在另一优选例中，同步检测待测样本中1～5种基因突变，和/或1～5种甲基化修饰。在本发明的另一方面，提供一种用于同步检测待测样本中基因突变和甲基化修饰的试剂盒，所述试剂盒中包括：特异性检测基因突变的引物和探针；甲基化修饰检测区段的通用引物和探针；特异性检测甲基化修饰的引物和探针；基因突变区段的通用引物和探针；其中，所述的基因突变为braf基因突变；所述的甲基化修饰为mlh1基因的甲基化修饰。在另一优选例中，所述的braf基因为其15外显子的1799核苷酸上t→a的突变，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代(v600e)。在另一优选例中，所述的mlh1基因的甲基化修饰为其启动子区(转录起始位点前-231、-229和-223位点)上发生的甲基化修饰。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：使未发生甲基化修饰的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)的试剂，较佳地为重亚硫酸盐；pcr扩增试剂(包括但不限于pcr缓冲液，dna聚合酶，mgcl2或dntps)；和/或使用说明书。在另一优选例中，所述的特异性检测基因突变的引物为seqidno:1和seqidno:4所示的引物，所述的特异性检测基因突变的探针为seqidno:3所示的探针；所述的基因突变区段的通用引物为seqidno:2和seqidno:4所述的引物，所述的基因突变区段的通用探针为seqidno:3所示的探针。在另一优选例中，所述的甲基化修饰检测区段的通用引物为seqidno:5和seqidno:8所示的引物；所述的甲基化修饰检测区段的通用探针为seqidno:7所示的探针；所述的特异性检测甲基化修饰的引物为seqidno:5和seqidno:8所示的引物；所述的特异性检测甲基化修饰的探针为seqidno:6所示的探针。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、本发明基因突变和甲基化复合检测示意图。图2、braf突变和mlh1甲基化复合检测体系的荧光扩增曲线图。2-1，野生型样本；2-2，braf突变样本；2-3，mlh1甲基化样本；2-4，突变和甲基化双阳性样本。①braf突变特异性引物/探针组；②braf突变通用引物/探针组；③mlh1甲基化特异性引物/探针组；④mlh1甲基化通用引物/探针组。图3、braf/kras突变和mlh1/mgmt甲基化复合检测体系的荧光扩增曲线图。3-1，野生型样本；3-2，kras突变样本；3-3，mgmt甲基化样本；3-4，kras突变+mgmt甲基化样本。①kras突变特异性引物/探针组；②kras突变通用引物/探针组；③mgmt甲基化特异性引物/探针组；④mgmt甲基化通用引物/探针组。具体实施方式本发明人经过深入的研究，揭示了一种优化的复合扩增方法，采用不同的引物/探针组，在两个反应体系中，同时扩增重亚硫酸盐转化后的dna，实现对基因突变和甲基化的同步检测，从而有效提高基因检测的效率。如本文所用，“样本”或“样品”为需进行基因突变或甲基化状态检测的核酸物质，其可以来自于个体(如人或动物)，也可以是其它来源的，例如一些经扩增或未经扩增的实验室核酸材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断或治疗目的，还可涉及其它非诊断或治疗的目的。如本文所用，所述的“特异性检测基因突变的引物和探针”与“突变检测特异性引物/探针(组)”可互换使用，其仅扩增和检测发生基因突变的核酸区段；也即，其能扩增一段包含感兴趣的待测突变位点的核酸区段，并能特异性指示基因突变的发生。如本文所用，所述的“特异性检测甲基化修饰的引物和探针”与“甲基化检测特异性性引物/探针(组)”可互换使用，其仅扩增和检测发生甲基化修饰的核酸区段；也即，其能扩增一段包含感兴趣的甲基化修饰位点的核酸区段，并能特异性指示甲基化修饰的发生。如本文所用，所述的“基因突变区段的通用引物和探针”与“基因检测通用引物/探针(组)”可互换使用，其能同时扩增和检测突变型和野生型核酸区段；也即，其能扩增一段包含感兴趣的待测突变位点的核酸区段，所述突变发生或未发生。如本文所用，所述的“甲基化修饰检测区段的通用引物和探针”与“甲基化检测通用引物/探针(组)”可互换使用，其能同时扩增和检测发生甲基化修饰和未发生甲基化修饰的核酸区段；也即，其能扩增一段包含感兴趣的甲基化修饰位点的核酸区段，所述甲基化修饰发生或未发生。本发明基于重亚硫酸盐转化dna的基因突变和甲基化检测方法，dna样本经过na2s2o5处理后，未发生甲基化的胞嘧啶(c)转化为尿嘧啶(u)，而发生甲基化的胞嘧啶(mc)保持不变，转化产物经过pcr扩增后，u转变为t，而mc转变为c，从而将甲基化和非甲基化的差异转变为c/t碱基的多态性，通过检测目标位点的c/t碱基状态，可以明确样本dna是否发生了甲基化。由于重亚硫酸盐转化过程中，发生了c→t碱基的转变，所以本发明的方法不能直接检测c/t突变类型。对于c/t突变，可以通过检测dna负链上的g/a突变来解决。作为本发明的一种实施方式，如图1所示：基因突变和甲基化检测的引物和探针设计全部基于重亚硫酸盐转化后的dna序列为模板。针对基因突变位点，设计四个引物和探针，分别为：①突变检测特异性引物(正向)、②突变检测通用引物(正向)、③突变检测通用探针、④突变检测通用引物(反向)。针对甲基化位点，也设计四个引物和探针，分别为：⑤甲基化检测通用引物(正向)、⑥甲基化检测特异性探针、⑦甲基化检测通用探针、⑧甲基化检测通用引物(反向)。引物①为突变特异性引物，其3’末端和突变型碱基完全匹配。引物②为通用引物，结合位置和引物①基本一致，其3’末端在突变位点前终止。①+③+④组合形成突变检测特异性引物/探针组，只能扩增和检测发生基因突变的目标片段。②+③+④组合形成突变检测通用引物/探针组，可以同时扩增和检测突变型和野生型目标片段。探针⑥为甲基化特异性探针，可以和发生甲基化的dna模板特异性结合；而探针⑦为通用探针，无论dna模板是否发生甲基化，都能有效结合。⑤+⑥+⑧组合形成甲基化检测特异性引物/探针组，只能扩增和检测发生甲基化的目标片段。⑤+⑦+⑧组合形成甲基化检测通用引物/探针组，可以同时扩增和检测甲基化和非甲基化目标片段。基因突变和甲基化复合检测体系在两个反应体系中完成：反应体系a中包含突变检测特异性引物/探针组，和甲基化检测通用引物/探针组；反应体系b中包含甲基化检测特异性引物/探针组，和突变检测通用引物/探针组。作为本发明的一种优选方式，将荧光(定量)pcr可应用于确定相关的基因突变和甲基化修饰的存在与否或存在量，其原理为在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，即荧光信号的变化代表了pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最后通过对ct值和标准曲线的分析对样本的起始量进行定量。较佳地，突变检测特异性引物/探针组和突变检测通用引物/探针组采用同一种荧光标记(如以fam荧光基团标记)。甲基化检测特异性引物/探针组和甲基化检测通用引物/探针组采用另一种荧光进行标记(如以vic荧光基团标记)。反应体系a甲基化通用引物/探针在扩增过程中，既作为突变检测的内对照，又作为甲基化检测的外对照；反应体系b突变通用引物/探针在扩增过程中，既作为甲基化检测的内对照，又作为突变检测的外对照。其它可用的荧光基团还包括：rox荧光基团，cy5荧光基团，hex荧光基团，tet荧光基团，joe荧光基团，ned荧光基团，amra荧光基团，等。本发明中，基因突变和甲基化检测的准确性依赖于引物和探针与目标基因片段结合的特异性。在如图1的实施方案中，基因突变采用特异性的引物来鉴别，而甲基化采用特异性的探针来鉴别。基于相类似的设计思路，基因突变同样可以采用特异性的荧光探针来鉴别，甲基化也可以采用特异性的引物来鉴别。在本发明的实施过程中，可以根据需要在特异性引物①的3’末端-1或-2位置引入错配碱基，以提高pcr引物扩增的特异性。也可以在荧光探针中使用锁核酸(lna)或mgb等修饰基团，提高探针结合的特异性。在pcr检测系统中添加内对照和外对照，有利于监控扩增体系是否正常。内对照(internalcontrol)和目标基因扩增体系组成一个复合扩增体系，当反应管中没有检测到目标基因扩增信号时，需要考查内控的扩增情况：若内控信号抬升，说明pcr体系正常；若内控信号无抬升，说明pcr扩增受到抑制。内对照的加入可以有效消除pcr检测中的假阴性结果。外对照(externalcontrol)通常采用一个独立的反应管，其荧光信号扩增的ct值可以反映起始样本中可扩增的dna模板数量。在常规检测方法中，需要专门设计用于内对照和外对照扩增的引物和探针。本发明的复合扩增体系至少包括反应体系a和反应体系b，每一个反应体系中，都包含一个特异性的引物/探针组和一个通用引物/探针组。特异性的引物/探针组用于扩增发生了基因突变或甲基化的目标片段，通用引物/探针组在扩增过程中，既作为本反应管的内对照，又作为另一个反应管的外对照，从而提高了基因突变和甲基化复合检测体系中引物和探针的利用效率。在优选实施方式中，分析反应体系a和反应体系b中的荧光扩增曲线，可以快速、准确地明确样本中是否存在相关的基因突变和甲基化修饰在本发明的优选实施方式中，本发明中特异性引物/探针组和通用引物/探针组扩增的是相同的基因片段，可以最大限度地保证突变或甲基化目标片段的扩增效率与外对照的扩增效率保持一致。此时，突变或甲基化扩增和外对照扩增ct值的差值(△ct)可用于定量分析样本中基因突变或甲基化的含量。依照本发明的基因突变和甲基化复合扩增体系，特别适用于需要同时检测基因突变和甲基化的肿瘤样本。比如：脑胶质瘤患者一般都需要检测idh1基因突变和mgmt基因的甲基化，以便对患者进行基因分型和用药指导。遗传性大肠癌筛查过程中，需要检测braf基因突变和mlh1基因的甲基化。这些针对基因突变和甲基化的检测，目前在临床上都需要分开进行。应用本项发明，可以使这两种不同类型的检测同步完成，从而提高检测效率，降低检测成本。本发明所述的基因突变可以是存在于多种基因上的基因突变。所述的基因例如但不限于braf、idh1、kras、egfr基因，这些基因的突变与肿瘤发生及用药相关，常被进行临床诊断或非诊断性科学研究。本发明所述的甲基化修饰可以是存在于多种基因上的甲基化修饰。甲基化修饰相关基因例如但不限于mlh1、mgmt、bmp3、rassf1a基因，这些基因的甲基化修饰与肿瘤发生及用药相关，也常被进行临床诊断或非诊断性科学研究。在获得了本发明的方法后，很显然，本领域人员可以将之应用于任何以重亚硫酸盐转化dna为模板的基因突变和甲基化复合检测体系中。在增加荧光标记数量的前提下，同时检测基因突变和甲基化的数量亦可增加到多个，如1～5个或以上。例如，采用3种不同的荧光标记，可同步检测2种基因突变和1种基因甲基化(亦可检测1种基因突变和2种基因甲基化)，采用4种不同的荧光标记可同步检测2种基因突变和2种基因甲基化。本发明还包括了包含本发明的基因突变和甲基化复合检测试剂盒。所述的试剂盒中包含：①突变特异性引物/探针组；②突变通用引物/探针组；③甲基化特异性引物/探针组；和④甲基化通用引物/探针组。还可包括扩增目标基所需的pcr缓冲液、dntp、taqdna聚合酶、质控品等试剂。较佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、braf基因突变和mlh1甲基化检测实例本实施例中，以遗传性非息肉病性大肠癌(又称为lynch综合征大肠癌)为研究对象，其是最常见的遗传性大肠癌，约占大肠癌总发病率的3％。lynch综合征的发病机理是dna错配修复基因(mmr)发生了突变。对于lynch综合征大肠癌的筛查，通常的做法是首先进行mmr基因的免疫组化分析；若mmr蛋白都正常表达，可以排除lynch综合征的可能性；若mmr蛋白不表达，则需要进一步分析braf基因突变和mlh1甲基化情况：如果存在braf基因突变或mlh1甲基化，也可以排除lynch综合征可能；若不存在braf突变和mlh1甲基化，则需要进行后续的遗传和基因测序分析。通过braf突变和mlh1甲基化筛查，可以排除80％以上的mmr蛋白表达异常的患者，从而提高lynch综合征筛查的效率，节省患者的筛查费用。本实施例中，采用本发明的方法检测braf基因v600e突变和mlh1基因的甲基化。braf基因是一种癌基因，位于第7号染色体上，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞生长、分化和凋亡等。braf基因突变主要发生在15外显子的1799核苷酸上(t→a)，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代(v600e)。大约8-10％的大肠癌样本中存在braf基因v600e突变。mlh1基因属于错配修复基因家族成员，位于3号染色体上。大约15-20％的大肠癌样本中存在mlh1基因甲基化。1、braf基因v600e突变检测引物和探针依据本发明的引物和探针设计原则，基于重亚硫酸盐转化后的dna序列为模板，设计三条pcr引物和一条荧光探针，用于braf基因v600e突变检测，分别为：①braf突变特异性引物(正向)：aaataggtgattttggtttagttataca(seqidno:1)；②braf突变通用引物(正向)：aaataggtgattttggtttagttata(seqidno:2)；③braf突变通用探针：ctaataaaacccactccatc-mgb(fam标记)(seqidno:3)；④braf突变通用引物(反向)：acctcaattcttaccatccaca(seqidno:4)。2、mlh1甲基化检测引物和探针依据本发明的引物和探针设计原则，基于重亚硫酸盐转化后的dna序列为模板，设计两条pcr引物和两条荧光探针，用于mlh1甲基化检测，分别为：⑤mlh1甲基化通用引物(正向)：gtatttttgtttttattggttggatat(seqidno:5)；⑥mlh1甲基化特异性探针：tacgcttacgcgttaaa-mgb(vic标记)(seqidno:6)；⑦mlh1甲基化通用探针：ctatccrctcttcctatta-mgb(vic标记)(seqidno:7)；⑧mlh1甲基化通用引物(反向)：ccctccctaaaacgactactac(seqidno:8)。3、braf基因突变和mlh1甲基化复合检测体系依据本发明的设计思路，配制braf基因突变和mlh1甲基化复合扩增体系，扩增反应在两个反应管中进行，反应液具体组份如表1。表14、扩增反应程序运行如下扩增程序：第一阶段：95℃温育5分钟；第二阶段：95℃温育15秒，60℃温育60秒，共计45个循环；信号收集：第二阶段60℃时收集fam和vic荧光信号。5、复合扩增体系检测结果分析采用上述荧光pcr扩增体系，分别扩增：①野生型样本、②braf突变阳性样本、③mlh1甲基化阳性样本、和④braf突变和mlh1甲基化双阳性样本。野生型样本的荧光扩增曲线见图2中2-1：在a反应管中，不能检测到braf突变特异性扩增信号，只能检测到mlh1通用扩增信号(vic荧光)；在b反应管中，可以检测到braf通用扩增信号(fam荧光)，不能检测到mlh1甲基化特异性扩增信号。braf突变阳性样本的荧光扩增曲线见图2中2-2：在a反应管中，能同时检测到braf突变特异性扩增信号(fam荧光)，和mlh1通用扩增信号(vic荧光)；在b反应管中，可以检测到braf通用扩增信号(fam荧光)，不能检测到mlh1甲基化特异性扩增信号。mlh1甲基化阳性样本的荧光扩增曲线见图2中2-3：在a反应管中，不能检测到braf突变特异性扩增信号，只能检测到mlh1通用扩增信号(vic荧光)；在b反应管中，可以同时检测到braf通用扩增信号(fam荧光)，和mlh1甲基化特异性扩增信号(vic荧光)。braf突变和mlh1甲基化双阳性样本的荧光扩增曲线见图2中2-4：在a反应管中，能同时检测到braf突变特异性扩增信号(fam荧光)，和mlh1通用扩增信号(vic荧光)；在b反应管中，可以同时检测到braf通用扩增信号(fam荧光)，和mlh1甲基化特异性扩增信号(vic荧光)。检测结果表明，用于braf基因突变和mlh1甲基化检测的四组引物/探针组，在复合扩增体系中都能够发挥各自的扩增性能，实现基因突变和甲基化的同步检测。在两个反应管中，各有一组通用引物/探针组，既作为反应管本身的内对照，又作为另一个反应管的外对照。突变/甲基化扩增的ct值和外对照扩增的ct值相结合，可用于样本中基因突变/甲基化含量的定量分析。采用上述荧光pcr扩增体系，检测不同突变/甲基化含量的样本。每个反应管中加入30ng重亚硫酸盐转化dna，荧光扩增结果见表2和表3。表2、不同突变含量样本的检测结果汇总braf突变含量100％25％5％1％0％特异性扩增ct值28.7530.8132.9834.65/通用扩增ct值(外对照)28.6128.5628.5928.4828.44△ct值0.142.254.396.27/表3、不同甲基化含量样本的检测结果汇总mlh1甲基化含量100％25％5％1％0％特异性扩增ct值29.3531.6033.8735.74/通用扩增ct值(外对照)29.1229.3129.3229.1829.37△ct值0.232.294.556.56/检测结果显示：当反应管中起始dna模板相同时，通用引物/探针组扩增的ct值保持相对稳定(偏差<0.5)。随着样本中基因突变/甲基化含量的降低，检测到的△ct值逐渐增大。依据突变/甲基化含量和△ct值的变化曲线，进行待测样本中基因突变和甲基化的定量分析。实施例2、braf、kras基因突变和mlh1、mgmt甲基化检测实例本实施例中，以大肠癌为研究对象，同步开展braf、kras基因突变和mlh1、mgmt甲基化检测。如实施例1所述，braf基因突变和mhl1甲基化检测，可用于提高遗传性大肠癌(lynch综合征)筛查的效率。针对大肠癌患者，临床还需要开展与药物疗效相关的基因检测。其中kras基因突变和mgmt基因甲基化检测是较为常见的检测指标。kras基因突变与表皮生长因子受体(egfr)单克隆抗体药物的疗效密切相关。多个大样本、多中心ⅲ期临床研究结果提示，kras突变型患者并不能从抗egfr治疗中获益，而kras野生型的患者可以从egfr单抗药物的治疗中获得最大化的生存效益。mgmt基因编码o6-甲基鸟嘌呤-dna-甲基转移酶，是体内一种重要的dna修复酶。烷化剂类抗肿瘤药物(如：替莫唑胺)的治疗效果与mgmt基因的甲基化状态存在相关性。一般认为，mgmt甲基化的肿瘤细胞对烷化剂类药物敏感；而mgmt基因非甲基化则意味着对烷化剂耐药。替莫唑胺是治疗脑胶质瘤的一线化疗药物，对mgmt甲基化阳性患者的临床疗效显著。对于晚期转移性大肠癌患者，在常规治疗无效且存在mgmt甲基化的情况下，可选择替莫唑胺作为后续的治疗方案。本实施例中，采用本发明的方法，在两个反应管中同时检测braf基因v600e突变、kras基因g12d突变、mlh1基因甲基化和mgmt基因甲基化。braf基因突变主要发生在15外显子的1799核苷酸上(t→a)，导致其编码的缬氨酸由谷氨酸取代(v600e)。大约8-10％的大肠癌样本中存在braf基因v600e突变。kras基因突变主要发生在1号外显子的12和13密码子上；其中第35核苷酸上的g→a突变最为常见，导致其编码的甘氨酸由天冬氨酸取代(g12d)。大约10-15％的大肠癌样本中存在kras基因g12d突变。mlh1基因属于错配修复基因家族成员，大约15-20％的大肠癌样本中存在mlh1基因甲基化。mgmt基因编码一种dna修复酶，大约20-30％的大肠癌样本中存在mgmt基因甲基化。1、braf基因v600e突变检测引物和探针braf突变检测的引物和探针如实施例1中①～④所示。2、mlh1甲基化检测引物和探针mlh1甲基化检测的引物和探针如实施例1中⑤～⑧所示。3、kras基因g12d突变检测引物和探针依据本发明的引物和探针设计原则，基于重亚硫酸盐转化后的dna序列为模板，设计三条pcr引物和一条荧光探针，用于kras基因g12d突变检测，分别为：⑨kras突变特异性引物(正向)：gaatataaatttgtggtagttggagttca(seqidno:9)；⑩kras突变通用引物(正向)：gaatataaatttgtggtagttggagtt(seqidno:10)；kras突变通用探针：crtcaaaacactcttacctac-mgb(rox标记)(seqidno:11)；kras突变通用引物(反向)：tcatattcctccacaaaataattctaaat(seqidno:12)。4、mgmt甲基化检测引物和探针依据本发明的引物和探针设计原则，基于重亚硫酸盐转化后的dna序列为模板，设计两条pcr引物和两条荧光探针，用于mgmt甲基化检测，分别为：mgmt甲基化通用引物(正向)：gtttyggatatgttgggatagtt(seqidno:13)；mgmt甲基化特异性探针：ctacgaacgtcgaaacga-mgb(cy5标记)(seqidno:14)；mgmt甲基化通用探针：cccaaacactcaccaaat-mgb(cy5标记)(seqidno:15)；mgmt甲基化通用引物(反向)：cctacaaaaccactcraaactac(seqidno:16)。3、braf/kras基因突变和mlh1/mgmt甲基化复合检测体系依据本发明的设计思路，配制braf/kras基因突变和mlh1/mgmt甲基化复合扩增体系，扩增反应在两个反应管中进行，反应液具体组份如表4。表44、扩增反应程序运行如下扩增程序：第一阶段：95℃温育5分钟；第二阶段：95℃温育15秒，60℃温育60秒，共计45个循环；信号收集：第二阶段60℃时收集fam、vic、rox和cy5荧光信号。5、复合扩增体系检测结果分析采用上述荧光pcr扩增体系，分别扩增不同类型的大肠癌样本。结果显示，在实施例1的反应体系中，加入kras突变检测引物/探针组(采用rox荧光标记)和mgmt甲基化检测引物/探针组(采用cy5荧光标记)，并不会影响braf和mlh1目标片段的扩增，检测到的braf和mlh1基因荧光扩增曲线与图2保持一致。而添加的两组引物/探针，可以用于分析样本中kras基因g12d突变和mgmt甲基化野生型样本的荧光扩增曲线见图3中3-1：在a反应管中，不能检测到kras突变特异性扩增信号，可以检测到mgmt通用扩增信号(cy5荧光)；在b反应管中，可以检测到kras通用扩增信号(rox荧光)，不能检测到mgmt甲基化特异性扩增信号。kras突变阳性样本的荧光扩增曲线见图3中3-2：在a反应管中，能同时检测到kras突变特异性扩增信号(rox荧光)，和mgmt通用扩增信号(cy5荧光)；在b反应管中，可以检测到kras通用扩增信号(rox荧光)，不能检测到mgmt甲基化特异性扩增信号。mgmt甲基化阳性样本的荧光扩增曲线见图3中3-3：在a反应管中，不能检测到kras突变特异性扩增信号，只能检测到mgmt通用扩增信号(cy5荧光)；在b反应管中，可以同时检测到kras通用扩增信号(rox荧光)，和mgmt甲基化特异性扩增信号(cy5荧光)。kras突变和mgmt甲基化双阳性样本的荧光扩增曲线见图3中3-4：在a反应管中，能同时检测到kras突变特异性扩增信号(rox荧光)，和mgmt通用扩增信号(cy5荧光)；在b反应管中，可以同时检测到kras通用扩增信号(rox荧光)，和mgmt甲基化特异性扩增信号(cy5荧光)。检测结果表明，用于braf、kras基因突变和mlh1、mgmt甲基化检测的八组引物/探针组，在复合扩增体系中都能够发挥各自的扩增性能，实现二种基因突变和二种甲基化的同步检测。采用上述荧光pcr扩增体系，检测分析96例大肠癌样本，按基因突变和甲基化可分为7种不同的类型，具体情况见表5。表5、不同突变和甲基化类型样本汇总样本分类数量百分比野生型4243.75％braf基因v600e突变66.25％kras基因g12d突变1414.58％mlh1基因甲基化1212.5％mgmt基因甲基化1919.79％braf突变+mlh1甲基化11.04％kras突变+mgmt甲基化22.08％在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>基因科技（上海）股份有限公司<120>同步检测基因突变和甲基化的方法及其应用<130>182282<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>28<212>dna<213>引物(primer)<400>1aaataggtgattttggtttagttataca28<210>2<211>26<212>dna<213>引物(primer)<400>2aaataggtgattttggtttagttata26<210>3<211>20<212>dna<213>探针(probe)<400>3ctaataaaacccactccatc20<210>4<211>22<212>dna<213>引物(primer)<400>4acctcaattcttaccatccaca22<210>5<211>27<212>dna<213>引物(primer)<400>5gtatttttgtttttattggttggatat27<210>6<211>17<212>dna<213>探针(probe)<400>6tacgcttacgcgttaaa17<210>7<211>19<212>dna<213>探针(probe)<400>7ctatccrctcttcctatta19<210>8<211>22<212>dna<213>引物(primer)<400>8ccctccctaaaacgactactac22<210>9<211>29<212>dna<213>引物(primer)<400>9gaatataaatttgtggtagttggagttca29<210>10<211>27<212>dna<213>引物(primer)<400>10gaatataaatttgtggtagttggagtt27<210>11<211>21<212>dna<213>探针(probe)<400>11crtcaaaacactcttacctac21<210>12<211>29<212>dna<213>引物(primer)<400>12tcatattcctccacaaaataattctaaat29<210>13<211>23<212>dna<213>引物(primer)<400>13gtttyggatatgttgggatagtt23<210>14<211>18<212>dna<213>探针(probe)<400>14ctacgaacgtcgaaacga18<210>15<211>18<212>dna<213>探针(probe)<400>15cccaaacactcaccaaat18<210>16<211>23<212>dna<213>引物(primer)<400>16cctacaaaaccactcraaactac23当前第1页12