本发明涉及测序文库构建领域，具体而言，涉及一种接头封闭序列、文库构建试剂盒及测序文库的构建方法。
背景技术：
：使用illuminatrueseq接头进行文库构建的一般流程为：首先将dna打断为300-400bp，对片段化的dna进行末端修复，并加a碱基尾巴，再将文库和illuminatrueseq接头进行连接，最后以接头两端的已知通用的p5和p7序列为引物进行pcr扩增和富集，构建好的文库即可用于杂交捕获。杂交捕获过程之前需要进行文库的封闭，一方面是封闭插入片段中的重复序列，另一方面是封闭文库接头序列。封闭后的文库用捕获探针将目标区域捕获下来，然后边合成边测序，通过专注于目标区域的测序，在相同数据量下提高测序深度，对尽量多的dna进行高测序深度的测序。但目前在捕获之前的封闭过程存在封闭效率低，进而使得目标区别的捕获效率比较低。为此，有必要对现有的方法进行改进，以提高目标区域的捕获效率。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种接头封闭序列、文库构建试剂盒及测序文库的构建方法，以解决现有技术中的测序文库中目的片段的捕获效率低的问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种接头封闭序列，接头封闭序列包括：p5接头封闭序列，p5接头封闭序列具有seqidno:1所示序列：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc，且seqidno:1所示序列的3’末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰及磷酸化修饰中的任一种。进一步地，接头封闭序列还包括：p7接头封闭序列，p7接头封闭序列具有seqidno:2所示序列：caagcagaagacggcatacgagatngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc，其中n代表index的反向互补序列，且seqidno:2所示序列的3’末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰及磷酸化修饰中的任一种。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种文库构建试剂盒，包括接头封闭剂，接头封闭剂中含有上述任一种接头封闭序列。进一步地，接头封闭试剂中，接头封闭序列的工作浓度为0.1.～0.25nm。进一步地，试剂盒还包括插入片段中重复序列封闭剂；优选插入片段中重复序列封闭剂为cot-1dna。进一步地，试剂盒还包括杂交捕获试剂。进一步地，杂交捕获试剂为dna杂交捕获试剂，优选dna杂交捕获试剂为idt公司的dna杂交捕获试剂。进一步地，杂交捕获试剂为rna杂交捕获试剂，优选rna杂交捕获试剂为agilent公司的rna杂交捕获试剂。根据本发明的另一方面，提供了一种测序文库的构建方法，该构建方法包括预扩增文库的构建、接头封闭、液相杂交捕获以及捕获文库扩增的步骤，接头封闭的步骤中采用上述任一种接头封闭序列进行封闭，或者采用上述任一试剂盒中的封闭试剂进行封闭。应用本发明的技术方案，本发明通过在封闭序列的3’末端加上封闭修饰，增加了封闭序列的结合效率，通过减少因接头连接导致的非目标区域捕获提高了捕获效率，并降低了封闭序列对后续pcr过程的影响。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了本申请中的接头封闭的原理示意图。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。3’-spacer(间壁)修饰，spacer可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于dna发夹结构和双链结构研究。c3spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或"替代"一个序列中未知的碱基。3'-spacerc3用于引进一个3’间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。3’-dideoxy-c(双脱氧胞苷酸)修饰、3’磷酸化(phosphorylation)修饰和3’inverteddt(反向dt)修饰可用于抗3’外切酶消化的相关实验中，也可用于阻止dna聚合酶催化的dna链延伸反应。为了改进现有的液相杂交捕获文库构建过程中，目的区域的捕获效率相对较低的缺陷，发明人对现有的杂交捕获文库构建方法进行了详细研究，发现目前文库两端的接头封闭序列采用的是与接头的序列反向互补的序列，通过与接头序列的碱基互补配对完成文库接头的封闭。具体而言，接头封闭序列分两部分，一部分与测序接头的p5及测序引物1(sp1)区序列反向互补，另一部分与测序引物2(sp2)、标签(index)及测序接头p7区序列反向互补，通过与其对应部分的互补配对进行接头封闭。然而，使用反向互补的序列进行文库的封闭结合时，在杂交捕获的过程中，封闭序列的结合容易受到体系温度的影响，封闭序列间易形成二聚体而导致封闭效率降低，进而使得目标区域的捕获效率也降低。此外，若反向互补的序列在pcr过程之前未完全去除，也会影响后续捕获文库的正常扩增。这里的影响是指捕获之后一直是65℃清洗，理论上65℃下，文库和封闭试剂(tm大概76℃)有可能不会解开双链，而此时封闭试剂在两端形成的双链就一直存在。如果index不对应且3’端没有修饰的话，在捕获后的pcr过程中极有可能会出现封闭试剂成为引物继续扩增的状况，而这样很可能造成index混乱，无法分辨样本。在上述研究结果的基础上，发明人对现有的接头封闭序列进行了各种改进，发现通过对现有接头封闭序列的3’末端进行修饰，有助于提高对接头序列的封闭效果，进而使得目标区域的捕获效率提高。而且，发明人还发现，通过对现有的接头序列进行3’-spacer(间壁)修饰、3’-dideoxy-c(双脱氧胞苷酸)修饰、3’-phosphorylation(磷酸化)修饰以及3’-inverteddt修饰，均能不同程度地提高对接头序列的封闭效果，而其中，3’-inverteddt修饰后对接头序列的封闭效果最好，捕获效率提高最显著。申请人基于上述发现，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种接头封闭序列，该接头封闭序列包括：p5接头封闭序列，p5接头封闭序列具有seqidno：1所示的序列：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc，且seqidno：1所示的序列的3’末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰及磷酸化修饰中的任一种。本申请提供的上述接头封闭序列，主要应用于使用illuminatrueseq接头构建的文库，在这种文库进行杂交捕获之前作为接头封闭试剂使用。相比现有技术中的接头封闭序列，本申请提供的在3’末端进行封闭修饰的接头封闭序列，能够加强接头封闭序列的封闭效果，进而提高液相杂交捕获过程的捕获效率，尤其是反向dt修饰的接头封闭序列，对接头序列的封闭效果最好，对液相杂交捕获过程的捕获效率提高最显著。上述p5接头封闭序列相比现有的接头封闭序列已经提高了封闭效率，进而提高了捕获效率。为了进一步提高现有文库构建过程中的杂交捕获效率，如图1所示，在本申请另一种优选的实施例中，上述接头封闭序列还包括：p7接头封闭序列，p7接头封闭序列具有seqidno:2所示序列：caagcagaagacggcatacgagatngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc，其中n代表index的反向互补序列，且seqidno:2所示序列的3’末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰及磷酸化修饰中的任一种。通过在对p5接头封闭序列的3’末端进行封闭修饰(尤其是反向dt修饰)后，再进一步对p7接头封闭序列的3’末端进行封闭修饰(尤其是反向dt修饰)，同时提高了p5接头封闭序列和p7接头封闭序列在接头封闭步骤中的封闭效率，因而使得液相杂交捕获过程的捕获效率更高。其中，p7接头封闭序列中，n所代表index的反向互补序列的长度与index序列的长度相同，通常为6～12bp。本申请提供的接头封闭序列适用于illuminatrueseq接头构建的所有预文库进行目标区域捕获前的接头序列封闭，而后续可用的捕获体系包括但不限于agilent、nimblegen和illumina的商业和定制化捕获试剂和芯片。在本申请第二种典型的实施方式中，还提供了一种文库构建试剂盒，该试剂盒包括接头封闭剂，其中，接头封闭剂中含有上述任一种接头封闭序列。包含上述任一种接头封闭序列的文库构建试剂盒，构建文库过程中的接头封闭效果好，使得杂交捕获时对目的片段/区域的捕获效率更高。对上述试剂盒中的接头封闭试剂的具体使用浓度，可以根据预扩增文库的量进行合理设定。在本申请一种优选的实施例中，接头封闭试剂中，接头封闭序列的工作浓度为0.1～0.25nm。将接头封闭序列的工作浓度设置在该范围内，具有封闭效率高，且接头封闭序列不容易过量而导致后续捕获文库扩增时对pcr过程造成干扰而影响文库的正常构建。上述试剂盒中，除了包含上述接头封闭剂外，还可以包括其他的文库构建常用的试剂，以便使文库构建更方便快捷。在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括插入片段中重复序列封闭剂。在本申请另一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括杂交捕获试剂。进一步包含文库中目的插入片段的重复序列封闭剂的试剂盒，便于在封闭步骤中同时对接头序列以及目的插入片段的重复序列进行封闭，从而提高后续的捕获效率。而进一步包含杂交捕获试剂的试剂盒，便于使得封闭步骤与杂交捕获步骤操作更方便。上述试剂盒中的插入片段中的重复序列封闭剂采用现有的重复序列封闭剂即可。在本申请一种优选的实施例中，插入片段中重复序列封闭剂为cot-1dna。人cot-1dna是胎盘dna，长度主要为50～300bp，并且富含重复dna序列，所以用来封闭重复序列，在dna与dna、dna与rna的杂交捕获体系中都需要用到。salmonspermdna为鲑鱼精dna，其用在dna和rna杂交体系中(如安捷伦的液相杂交捕获体系)，作用是封闭dna和rna杂交过程中样本的非特异性信号。而一般dna和dna的杂交体系中不用鲑鱼精dna了，比如idt的杂交捕获体系。现有技术的试剂盒中的杂交捕获试剂通常是与封闭相关试剂相配套的，以提高捕获效率。而本申请的上述试剂盒中，杂交捕获试剂可以根据实际需要，选择dna杂交捕获试剂或rna杂交捕获试剂，而无论是dna杂交捕获试剂还是rna杂交捕获试剂，在与本申请的上述封闭试剂配合适用时，均具有封闭效率高以及捕获效率高的优势。因此，在本申请一种优选的实施例中，上述杂交捕获试剂为dna杂交捕获试剂，优选dna杂交捕获试剂为idt公司的dna杂交捕获试剂。在本申请另一种优选的实施例中，杂交捕获试剂为rna杂交捕获试剂，优选rna杂交捕获试剂为agilent公司的rna杂交捕获试剂。在本申请第三种典型的实施方式中，还提供了一种测序文库的构建方法，该构建方法包括预扩增文库的构建、接头封闭、液相杂交捕获以及捕获文库扩增的步骤，接头封闭的步骤中采用上述任一种接头封闭序列进行封闭，或者采用上述任一种试剂盒中的封闭试剂进行封闭。通过在封闭序列的3’末端加上反向dt的封闭修饰，增加了封闭序列的结合效率，通过减少因接头连接导致的非目标区域的捕获而提高了捕获效率，并降低了封闭序列对后续pcr过程的影响，因而，所构建的文库存在目的目的片段占比较高的优势。下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。实施例1实施例1中使用的试剂见表1，其中的杂交捕获试剂是agilent公司的rna杂交捕获体系。表1：一、样本提取组织样本使用天根公司的石蜡包埋组织dna提取试剂盒(商品货号dp331)，提取好的dna存放在-20℃中备用。样本名称及提取量见表2。表2：二、dna的片段化。2.1---dna打断取该样本6份(520ng/份)使用covaris打断仪器(仪器型号s220)，按照下表3设置的参数进行dna的破碎。破碎产物的主峰在200-350bp，取20ng进行电泳检测。表3：最高入射功率工作系数能量传递点数处理时间450w30％200350-380s2.2---dna打断后检测2.2.1预先准备需要使用的试剂：配制2％的琼脂糖凝胶(11孔胶)：称0.6g琼脂糖，溶解于30ml1×taebuffer中，微波炉加热溶解，至少要煮沸5次左右，溶解完全后在室温稍冷却，冷却到50度左右后倒入准备好的胶托中，让其凝固40分钟后置于4℃保存。向1ml6×loadingbuffer中加入1μlsybrgreeni待用。2.2.2取打断后的样本5μl加入0.2ml离心管中，再加入1μl6×loadingbuffer，用漩涡振荡器振荡混匀5s、掌上离心机离心5s。2.2.3取100bpmarker5μl放入0.2ml离心管中，再加入1μl6×loadingbuffer，用漩涡振荡器振荡混匀5s、掌上离心机离心5s。2.2.4将样本和配制好的marker进行点胶、电泳检测(120v，30min)。2.2.5电泳结束后，凝胶成像系统观察结果，电泳条带集中在150-300bp后进行样本纯化操作。若电泳主条带集中在300bp以上，将样本dna进行补充打断操作。2.3---1.8x的ampurexp磁珠纯化dna样本2.3.1充分混匀ampurexp磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。2.3.2将dna从0.2ml离心管中取出，放入1.5ml新管中，加入90μl混匀的ampurexp磁珠悬浮液。高速涡旋混匀5s，室温放置5min。2.3.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。2.3.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。2.3.5在磁力架上，在每个管中分别加200μl80％乙醇。2.3.6静置1min等待磁珠沉降后，吸除乙醇。2.3.7重复步骤2.3.5及2.3.6一次。2.3.8加入51μleb，在高速涡旋上混匀5s，室温放置5min。2.3.9短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。2.3.10吸取50μl上清到一个新的pcr管中，复核无误后丢弃磁珠。三、预文库的构建3.1---末端修复及加a此步骤用到的试剂：end-repair&a-tailingbuffer，end-repair&a-tailingenzymemix(取自kapahyperprepkitilluminaplatforms试剂盒，生产厂商：kapa，货号：kk8504)。fragmented,double-strandeddna是上一步骤打断的dna样本，共4份。3.1.1在pcr管里按下表4配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表4：3.1.2放入pcr仪，按下表5设置程序进行反应(热盖温度设为70℃)，反应体系为60μl。表5：3.2---连接接头(adaptor)本步骤用到的试剂：连接缓冲液(ligationbuffer)，dna连接酶(dnaligaseenzyme，取自kapahyperprepkitilluminaplatforms试剂盒，生产厂商：kapa，货号：kk8504)；接头(truseqadaptor，取自dnabarcodes–48试剂盒，生产厂商：biooscientific，货号：nova-514104)。3.2.1在pcr管里按下表6配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表6：样本编号和接头(truseqadaptor)编号以及对应的标签(index)序列如下表7。表7：上述体系放于pcr仪上，20℃温浴15min，反应体系设为100μl，不要使用热盖。3.2.20.8x的ampurexp磁珠纯化dna样本。3.2.2.1充分混匀ampurexp磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。3.2.2.2在1.5ml新管中加入88μl混匀的ampurexp磁珠悬浮液和末端加了adaptor的dna文库。高速涡旋混匀5s，室温放置5min。3.2.2.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。3.2.2.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。3.2.2.5在磁力架上，在每个管中分别加200μl80％乙醇。3.2.2.6静置1min等待磁珠沉降后，吸除乙醇。3.2.2.7重复步骤5、6一次。3.2.2.8加入25μleb，在高速涡旋上混匀5s，室温放置5min。3.2.2.9短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。3.2.2.10吸取24μl上清到一个新的pcr管中，复核无误后丢弃磁珠。3.3---扩增连接上了接头的文库本步骤用到的试剂：2xkapahifihotstartreadymix(取自kapahyperprepkitilluminaplatforms试剂盒，生产厂商：kapa，货号：kk8504)；(p5+p7)引物(25um)，序列如下表8所示。表8：seqidno:引物名称序列(5’-3’)3p5aatgatacggcgaccaccgaga4p7caagcagaagacggcatacgag3.1在pcr管里按下表9配置反应液，用枪轻柔地上下吹吸混匀。表9：将上述反应液放入pcr仪，按下表10设置程序进行反应。表10：3.3.21.8x的ampurexp磁珠纯化dna样本3.3.2.1充分混匀ampurexp磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。3.3.2.2在1.5ml新管中加入90μl混匀的ampurexp磁珠悬浮液和pcr产物高速涡旋混匀5s，室温放置5min。3.3.2.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。3.3.2.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。3.3.2.5在磁力架上，在每个管中分别加200μl80％乙醇。3.3.2.6静置1min等待磁珠沉降后，吸除乙醇。3.3.2.7重复步骤5、6一次。3.3.2.8加入26μlnf-water，在高速涡旋上混匀5s，室温放置5min。3.3.2.9短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。3.3.2.10吸取26μl上清到一个新的pcr管中，复核无误后丢弃磁珠。3.4对pre-capture文库进行qubit定量吸取上步pcr管中产物1μl进行qubit2.0定量。此时pre-capture文库产量应大于500ng。四、文库杂交4.1---配置接头封闭剂合成的接头封闭序列为粉末装，需要加入无核酸酶水进行溶解，无核酸酶水体积根据管壁上标示的体积计算。配置好的接头封闭序列称为接头封闭剂，分别称为p5封闭剂和p7封闭剂，其中，p5封闭剂具有seqidno:1所示序列，而p7封闭剂具有seqidno:2所示序列。下列各文库所用的封闭序列的区别仅在于3’末端是否存在修饰，具体如下表11和表12所示。表11：p5封闭序列-1无修饰p7封闭序列-1无修饰p5封闭序列-23’末端inverteddt修饰p7封闭序列-23’末端inverteddt修饰表12：4.2---文库的封闭和杂交4.2.1取500ngdna文库于一个新的ep管中，用真空抽干机进行浓缩，温度≤45℃，直至文库的体积为5μl。4.2.2按下表13配方配制足够所有样本反应的封闭混合液(blockmix)。表13：cb030、cb032、cb034-1浓缩后的dna文库使用无修饰序列进行封闭，cb031、cb033、cb034-2使用本申请中添加的3’末端带有反向dt修饰的封闭序列。分别加入配置的p5/p7封闭剂各1μl，注意p7封闭剂所对应的index号。用枪上下吹吸8-10次，然后管盖盖紧，高速涡旋振荡5s，短暂离心将管壁液体收集到管底，此时反应液体积为17μl。4.2.3再次确认管盖盖紧，放入pcr仪，按下表14中程序进行反应，使用105℃热盖，反应体系设置为30μl。重要：pcr程序必须在第三步暂停，用以加入探针。在第一步和第二步反应过程中可以提前配制捕获文库杂交混合液(capturelibraryhybridizationmix)。表14：4.2.4按照下表15制备捕获文库杂交混合液(capturelibraryhybridizationmix)，高速涡旋振荡混匀5s，短暂离心，立即进行下一步操作。表15：4.2.5当pcr中的反应程序进行到第三步(1minat65℃)时，暂停反应程序，保持文库混合液在65℃条件下，将13μl的capturelibraryhybridizationmix加入到文库混合液中，用枪上下吹吸混匀8-10次，立即盖好管盖，此时管内体积为30μl。4.2.6高速涡旋振荡5s，短暂离心，然后放回pcr仪中，开始程序。重要：务必保证管盖盖紧，最小化减少杂交混合液体积的蒸发，否则将会影响杂交效果。4.3---捕获和洗脱本步骤用到的试剂：dynabeadsmyonestreptavidint1(厂商：invitogen，货号：65602，以下简称t1磁珠)，提前30min拿出置于室温；sureselectbindingbuffer，sureselectwash1；sureselectwash2(取自agilentsureselectqxtreagentkit，厂商：安捷伦，货号：g9681b)，在“文库和t1磁珠的结合”步骤操作完成后，使用恒温金属浴65℃预热。4.3.1sureselectbindingbuffer平衡t1磁珠4.3.1.1磁珠在保存的时候会沉降，高速涡旋剧烈震荡，重新悬浮t1磁珠。4.3.1.2对每个杂交反应，取50μlt1磁珠到pcr管中。4.3.1.3加入200μlsureselectbindingbuffer吹吸8-10次混匀。4.3.1.4将管子放在磁力架上，至溶液变澄清后吸除上清。4.3.1.5重复步骤3、4两遍，总共冲洗3次。4.3.1.6最后一遍冲洗完成后，短暂离心，再次置于磁力架上，确保所有的sureselectbindingbuffer被吸除4.3.1.7用200μlsureselectbindingbuffer重新悬浮t1磁珠。4.3.2文库和t1磁珠的结合经过大概2小时的杂交之后，将样品置于室温，估计(用移液枪估计)并记录剩余的杂交混合液的体积。重要：此时杂交混合液的体积大约为30μl，过度蒸发将会影响后续的捕获效果。4.3.2.1确定杂交混合液降低至室温后，将其用枪直接加到平衡后的t1磁珠溶液里，颠倒混匀3-5次。4.3.2.2将混合液放在旋转混合仪上，室温(保证24℃左右)混匀30min。注：可以将pcr管置于1.5ml离心管中再放入旋转混合仪。4.3.3sureselectwash1冲洗磁珠4.3.3.1简短离心，把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。4.3.3.2加入200μlsureselectwash1，用枪上下吹吸15次使磁珠悬浮，涡旋振荡8s，简短离心。4.3.3.3把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。4.3.4sureselectwash2冲洗磁珠4.3.4.1加入200μl经过65℃预热的sureselectwash2，用枪上下吹吸15次冲洗磁珠。4.3.4.2在pcr仪上65℃温浴5min，体系设置为100μl，热盖温度设为105℃。4.3.4.3把管子放在磁力架上，静置至溶液澄清，吸除上清。4.3.4.4重复步骤1-3两遍，总共冲洗3次。4.3.4.5最后一遍冲洗完成后，短暂离心，再次置于磁力架上，确保所有的sureselectwash2被吸除。4.3.4.6加入38μlnf-water，高速涡旋5s重新悬浮磁珠。4.4---捕获后pcr扩增本步骤用到的试剂为：5×herculaseiirxnbuffer，herculaseiifusiondnapolymerase，100mmdntpmix(取自herculaseiifusionenzymewithdntpscombo400rxnkit，生产厂商：agligent，货号：600679)；(p5+p7)primer(25um)4.4.1在冰上按照下表16体系配制pcr反应液。表16：4.4.2确认将含有磁珠的反应液混匀后，将管子放入pcr仪中进行扩增，注意更换管盖，pcr仪参数设置如下表17：表17：4.4.3用1.2倍ampurexp磁珠纯化dna样本4.4.3.1充分混匀ampurexp磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。4.4.3.2在1.5ml新管中加入60μl混匀的ampurexp磁珠悬浮液和pcr扩增后的dna文库。高速涡旋混匀，室温放置5min。4.4.3.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约3min至溶液变澄清。4.4.3.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。4.4.3.5在磁力架上，在每个管中分别加200μl80％乙醇。4.4.3.6静置1min沉降磁珠后，吸除乙醇。4.4.3.7重复步骤5、6一次。4.4.3.8室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠不宜过干，否则会导致洗脱的效率显著下降)。4.4.3.9加入21μleb，在高速涡旋上混匀，室温放置5min。4.4.3.10短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。4.4.3.11吸取大约20μl上清到一个新的1.5ml管中，复核后可丢弃磁珠。4.4.3.12取1μl样品进行qubit2.0定量。4.5---文库库检及上机将文库稀释到2ng/μl，取出1μl进行安捷伦2100bioanalyzer(美国安捷伦公司)检测；另外，再取出1ul用于qpcr检测，根据检测结果决定上机浓度。根据上步所得的浓度，将文库稀释到上机要求后(2nmol)，在illumina公司的hiseqx测序平台上进行pe150测序。实施例2实施例2所使用的具体试剂见表18，其中的杂交捕获试剂是idt公司的dna杂交捕获体系。表18：一、样本提取细胞系样本使用天根公司的磁珠法血液基因组dna提取试剂盒(商品货号dp329-02)，提取好的dna存放在-20℃中备用。样本名称及提取量见表19。表19：二、dna的片段化。2.1---dna打断取该样本6份(120ng/份)使用covaris打断仪器(仪器型号s220)，按照下表20设置的参数进行dna的破碎。破碎产物的主峰在200-350bp，取20ng进行电泳检测。表20：最高入射功率工作系数能量传递点数处理时间450w30％200350-380s2.2---dna打断后检测2.2.1预先准备需要使用的试剂：配制2％的琼脂糖凝胶(11孔胶)：称0.6g琼脂糖，溶解于30ml1×taebuffer中，微波炉加热溶解，至少要煮沸5次左右，溶解完全后在室温稍冷却，冷却到50度左右后倒入准备好的胶托中，让其凝固40分钟后置于4℃保存。向1ml6×loadingbuffer中加入1μlsybrgreeni待用。2.2.2取打断后的样本5μl加入0.2ml离心管中，再加入1μl6×loadingbuffer，用漩涡振荡器振荡混匀5s、掌上离心机离心5s。2.2.3取100bpmarker5μl放入0.2ml离心管中，再加入1μl6×loadingbuffer，用漩涡振荡器振荡混匀5s、掌上离心机离心5s。2.2.4将样本和配制好的marker进行点胶、电泳检测(120v，30min)。2.2.5电泳结束后，凝胶成像系统观察结果，电泳条带集中在150-300bp后进行样本纯化操作。若电泳主条带集中在300bp以上，将样本dna进行补打操作。2.3---1.8x的ampurexp磁珠纯化dna样本2.3.1充分混匀ampurexp磁珠悬浮液，直至悬浮液颜色均一。2.3.2将dna从0.2ml离心管中取出，放入1.5ml新管中，加入90μl混匀的ampurexp磁珠悬浮液。高速涡旋混匀5s，室温放置5min。2.3.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约5min至溶液变澄清。2.3.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。2.3.5在磁力架上，在每个管中分别加200μl80％乙醇。2.3.6静置1min等待磁珠沉降后，吸除乙醇。2.3.7重复步骤5、6一次。2.3.8加入51μleb，在高速涡旋上混匀5s，室温放置5min。2.3.9短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。2.3.10吸取50μl上清到一个新的pcr管中，复核无误后丢弃磁珠。三、预文库的构建3.1---末端修复及加a这一步骤将片段化dna末端补平，并在5’端进行磷酸化和3’端加da尾。将er&amix解冻后颠倒混匀，于灭菌pcr管中配制如下表21的反应体系：表21：使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将pcr管置于pcr仪中，按下表22所示程序进行反应。表22：反应结束后，立即进行接头连接步骤。3.2---接头连接这一步骤将在末端修复产物末端连接接头。使用无核酸酶水将接头稀释10倍；将rapidligationbuffer解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。在末端修复步骤的pcr管中配制如下表23所示反应体系：表23：*rapidligationbuffer和rapiddnaligase预混后，可于4℃存放不超过24hr，接头于反应时加入。具体给样本所使用的接头序列和对应的文库名称如下表24：表24：使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀)，并短暂离心将反应液收集至管底。将pcr管置于pcr仪中，下表25所示程序进行反应。表25：反应结束后，立即进行接头连接产物纯化步骤。3.3---接头连接产物纯化注：磁珠提前30min拿出，平衡至室温。3.31磁珠平衡至室温后，涡旋震荡混匀vahtsparticlesg。3.32吸取80μlvahtsparticlesg至100μl接头连接反应产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。3.33室温孵育5min。3.34将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清(注：尽量移除上清)。3.35保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。3.36重复步骤5一次，总计漂洗两次。3.37保持pcr管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留。3.38将pcr管从磁力架中取出，加入52μl洗脱液洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温静置2min，将pcr管短暂离心并置于磁力架上静置，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取50μl上清至新的pcr管中，切勿触碰磁珠。3.4---文库扩增这一步骤将对纯化后的连接产物进行pcr扩增。将pcrprimermix，amplificationmix2解冻后颠倒混匀，于灭菌pcr管中配制如下表26所示反应体系：表26：使用移液器轻柔吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。将反应管置于pcr仪中，按下表27所示程序进行反应：表27：3.5---扩增产物纯化注：磁珠提前30min拿出，平衡至室温。3.51磁珠平衡至室温后，涡旋震荡混匀vahtsparticlesg。3.52吸取45μlvahtsparticlesg至50μl接头连接反应产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。3.53室温孵育5min。3.54将pcr管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清(注：尽量移除上清)。3.55保持pcr管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清。3.56重复步骤5一次，总计漂洗两次。3.57保持pcr管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5-10min至无乙醇残留。3.58将pcr管从磁力架中取出，加入22μl洗脱液洗脱，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，于室温静置2min，将pcr管短暂离心并置于磁力架上静置，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取20μl上清至新的pcr管中，切勿触碰磁珠。3.59取1μl用qubit试剂测定浓度，剩余文库置于-20℃冰箱备用。四、文库杂交准备接头封闭试剂：合成的接头封闭序列为粉末装，需要加入无核酸酶水进行溶解，无核酸酶水体积根据管壁上标示的体积计算。配置好的接头封闭序列称为接头封闭剂，分别称为p5blocker和p7blocker。封闭序列如下表28：表28：注：pho是phosphorylation的缩写。4.1---封闭在0.2mlpcr管中加入下表29所示的试剂：表29：将pcr管置于真空浓缩仪中，将干燥速度调成中速进行干燥，约1.5h-2h完成干燥。4.2---杂交4.2.1将所有试剂从-20℃冰箱中取出，置于室温中融化。备注：检测2xhybridizationbuffer的管中是否有结晶，如果有结晶，将试剂置于65℃加热至试剂完全融化，期间需多次振摇，这个过程需要加热数小时。4.2.2在杂交捕获(一)的管中按照下表30加入试剂并常温孵育5-10min：表30：4.2.3用移液枪吹打混匀后转移至一个新的低吸附的0.2ml的pcr管中。4.2.4置于pcr仪上95℃孵育10min。4.2.5将pcr管取出，立即加入4μl浓度为0.75pmol/μl的探针。4.2.6涡旋震荡混匀，瞬时离心后将pcr管置于pcr仪上65℃孵育4h(盖的温度为75℃)。4.3---准备洗脱缓冲液4.3.1对于每一个捕获反应，将下表31中的各个缓冲液稀释成1x的工作液。备注：1x的工作液在室温条件下(15-25℃)最多可放置4周。表31：备注：若有必要，需将10x的washbuffer在65℃进行水浴或金属浴来重悬试剂中的颗粒。4.3.2配制好如下表32所示的1x的工作液中，部分洗脱缓冲液i及严谨洗脱缓冲液需要放在65℃至少预热2h，其余1x工作液均于室温(15-25℃)保存。表32：4.4---准备m-270磁珠。注意事项：磁珠应该现配现用，不要让磁珠过干。4.4.1从4℃冰箱中取出m-270磁珠，涡旋15s，在室温下放置平衡30min左右。备注：不推荐使用替代的链霉亲和素磁珠，因为替代磁珠可能会减少捕获的产量。4.4.2涡旋震荡磁珠15s使其充分混匀。4.4.3每一个捕获反应需要用到100μl的m-270磁珠。4.4.4将装有磁珠的1.5ml离心管置于磁力架上，静置，待溶液澄清后去除上清，注意不要吸到珠子。4.4.5加入200μl1×beadwashbuffer，涡旋10s。4.4.6瞬时离心后将离心管放在磁力架上至溶液澄清后，小心吸取并弃掉上清。4.4.7重复步骤5-6一次。4.4.8加入100μl1×beadwashbuffer，涡旋混匀后转移至一个新的低吸附的0.2ml的pcr管中。4.4.9将pcr管置于磁力架上进行吸附，待溶液澄清后，小心吸取并弃掉上清。注意：珠子清洗完毕后需立即进行下一步反应。4.5---捕获4.5.1将步骤(二)的杂交产物转移至步骤(四)中的含有磁珠的pcr管中，用枪吹吸10次使其充分混匀。4.5.2将pcr管置于pcr仪上，65℃孵育45min(盖的温度为75℃)，期间，每隔12min涡旋振荡3s使珠子保持在悬浮状态。4.6---洗脱未结合到磁珠上的dna4.6.165℃洗脱1)加入100μl预热到65℃的1×washbufferi。2)涡旋振荡混匀后，瞬时离心将溶液离心到管底。3)将pcr管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取并弃掉上清(含有未结合上的dna)。4)加入200μl预热到65℃的1xstringentwashbuffer,用移液枪缓慢吹吸10次，在该过程中注意不要产生气泡。5)将pcr管置于pcr仪上，65℃孵育5min。6)将pcr管放在磁力架进行吸附，当溶液澄清后，用移液枪小心吸取并弃掉上清。7)重复步骤5和6一次。4.6.2常温洗脱1)加入200μl常温放置的1×washbufferi，涡旋混匀2min。2)瞬时离心后，将pcr管放在磁力架上进行吸附，待溶液澄清后，用移液枪小心吸取并弃掉上清。3)加入200μl常温放置的1×washbufferii，涡旋混匀1min。4)瞬时离心后，将pcr管放在磁力架上进行吸附，待溶液澄清后，用移液枪小心吸取并弃掉上清。5)加入200μl常温放置的1×washbufferiii，涡旋混匀30s。6)瞬时离心后，将pcr管放在磁力架上进行吸附，待溶液澄清后，用移液枪小心吸取并弃掉上清。4.6.3重悬磁珠1)将含有与dna结合的磁珠的pcr管从磁力架上取下来放到试管架上。2)加入20μl无核酸酶的水，用枪吹吸10次，保证所有磁珠均被重悬。4.7---捕获后扩增4.7.1按照下表33所示配制pcr扩增反应液表33：4.7.2将配制好的pcr扩增反应液涡旋混匀。4.7.3将pcr管置于pcr仪上，按照下表表34的程序进行反应。表34：备注：该pcr扩增产物可在4℃保存过夜。4.8---pcr扩增产物纯化4.8.1在含pcr扩增产物的pcr管中加入75μl(1.5×)vahtsparticlesg磁珠，涡旋振荡混匀后，常温孵育5min。4.8.2将pcr管置于磁力架上进行吸附，待溶液澄清后约5min，用移液枪小心吸取并丢弃上清。4.8.3加入200μl80％乙醇，在磁力架上静置30s后，用移液枪吸取并丢弃上清。4.8.4重复步骤3一次。4.8.5瞬时离心使管壁上的乙醇离心至管底，小心吸弃残余乙醇后，室温静置5min使乙醇充分挥发。4.8.6加入22μl无核酸酶的水，涡旋混匀，室温静置5min。4.8.7瞬时离心后置于磁力架上，静置2min待溶液澄清后吸取20μl液体至新的ep管中。4.8.8取1μl用qubit试剂测定浓度。实施例一和实施例二的结果检测：使用bwa软件将实施例一和实施例二的测序结果与参考基因组进行比对，具体质控信息如下表35所示，使用不同封闭试剂的文库的捕获效率如下36所示。表35：表36：附：捕获效率(probecaptureratio)＝覆盖目标区域的总碱基数/覆盖全基因组的总碱基数*100％。从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：与未加修饰的封闭序列相比，本发明通过在3’末端增加了修饰(尤其是反向dt修饰)的接头封闭序列，提高了与接头的结合效率，提高了封闭效率，减少因接头连接导致的非目标区域捕获而提高了捕获效率，并降低了封闭序列对后续pcr过程的影响。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>天津诺禾致源生物信息科技有限公司<120>接头封闭序列、文库构建试剂盒及测序文库的构建方法<130>pn78266nhzy<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>57<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(57)<223>3'末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰或磷酸化修饰<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc57<210>2<211>58<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(58)<223>3’末端存在反向dt修饰、间壁修饰、双脱氧胞苷酸修饰或磷酸化修饰<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>n代表a、t、c或g组成的6-12bp的index的反向互补序列<400>2caagcagaagacggcatacgagatngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc58<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>p5接头序列<400>3aatgatacggcgaccaccgaga22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>p7接头序列<400>4caagcagaagacggcatacgag22当前第1页12