一种达旦提狄克氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法及应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测方法及应用。
背景技术：
：达旦提狄克氏菌dickeyadadantii被列入国际公认的十大类分子植物病原细菌之一，引起的甘薯茎腐病是近年来我国甘薯上发生最严重的细菌病害，在浙江、广东、河北、河南均有发生危害。甘薯茎腐病严重影响国内甘薯产业的发展，对浙江番薯产业的影响最为严重，2016年列入浙江省植物检疫性有害生物补充名录。甘薯茎腐病通过种薯种苗进行远距离传播，对种薯种苗进行早期检测，能够阻止病害从病区传播到无病区，能够有效降低老病区的发病率，及时采取相关防控措施，控制病害的进一步扩展。目前，达旦提狄克氏菌检测技术主要是对病健交界处进行划线分离培养纯化结合多基因序列测定分析和maldi-tof质谱微生物鉴定,费时费力，不适合种薯种苗带菌情况、田间疑似样本的快速检测。smid等(vanderwolfjm,nijhuiseh,kowalewskamj,etal.dickeyasolanisp.nov.,apectinolyticplantpathogenicbacteriumisolatedfrompotato(solanumtuberosum)[j].intjsystevolmicrobiol,2014,64(3):768-74.)和刘鹏等(liup,huanggm,liuy,etal.moleculardetectionoferwiniachrysanthemi(inchinese)[j].actaphytopathologicasinica(植物病理学报),2007,37(6):584-587.)分别基于dickeya属(formerlyerwiniachrysanthemi)的rdnaits序列设计的特异性引物，能扩增出特异性片断的菌只能说明是dickeya属或“以往”菊欧文氏菌的菌，作为d.dadantii辅助的鉴定有一定的参考价值，但是不能区分dickeya属下的8个种，因为这8个种的同源性很高，基于16srdna序列设计的特异性引物无法区分。基于特定脂肪酸组成特性而研制的gc-fame微生物鉴定系统和基于95种碳源的利用情况而研制的biolog微生物鉴定系统这二个鉴定系统中目前还没有d.dadantii标准菌株的相关信息,即使有标准菌株的信息如maldi-tof质谱微生物鉴定，也需先分离纯化得到单菌落，不适于作快速检测。因此，有效快速甘薯茎腐病原检测方法亟待解决。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测方法及应用。为了解决上述技术问题，本发明公开了一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测的引物及探针，包括引物ddad3、ddad4和taqman探针addad2，其中，ddad3：5’-acccaggccaccagaagt-3’，其核苷酸序列如seqidno.1所示；ddad4：5’-gacggtactgttaccgctac-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；taqman探针addad2：5’-cagtggtgcctgcgccaac-3’，其核苷酸序列如seqidno.3所示；其中，taqman探针addad2的5’端标记荧光报告基因fam，3’端标记荧光猝灭基团mgb。本发明还公开了一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品dna；(2)以样品dna为模板，加入上述的达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测的引物及探针，进行实时荧光定量pcr检测；(3)根据ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌。可选地，所述的荧光定量pcr反应体系如下：premix12.5μl，浓度为5μmol/lddad3和ddad4各1μl，浓度为10μmol/ltaqman探针addad21μl，roxreferencedyeii0.5μl，模板dna1μl，ddh2o8μl，以上pcr反应总体系总量为25μl。可选地，所述的荧光定量pcr反应条件如下：95℃预变性10s；95℃变性15s，63℃退火延伸1min，40个循环。可选地，所述的步骤3中的根据ct值和预期扩增曲线判断检测样品中是否含有达旦提狄克氏菌具体为：当无ct值且无预期扩增曲线时，表示样品中不含达旦提狄克氏菌；当ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有达旦提狄克氏菌；当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值，则该样品中不含达旦提狄克氏菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含达旦提狄克氏菌。本发明还公开了一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测试剂盒，该试剂盒包括上述的达旦提狄克氏taqman荧光定量pcr检测的引物及探针。本发明还公开了一种上述的引物及探针、检测方法和试剂盒在甘薯茎腐病疑似样本、病残体、田间土壤和种薯种苗检测中的应用。与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：1)本发明将达旦提狄克氏菌编码鞭毛蛋白的flic基因序列与近缘种比对发现，该基因特异性强，适合作为分子检测的靶标。以flic基因为靶标，设计了特异性引物和taqman探针，建立了达旦提狄克氏菌荧光定量pcr检测方法。结果发现，该方法能特异识别达旦提狄克氏菌，检测灵敏度可达280fg·μl-1，是常规pcr的1000倍；检测最低限达1.5cfu·μl-1，灵敏度比常规pcr检测方法高100倍，且仅需1.5h即可完成检测。2)本发明的检测方法用于田间样本检测，达旦提狄克氏菌阳性检测率达90％，高于分离培养法和常规pcr检出结果。3)本发明建立的基于taqman探针的荧光定量pcr检测体系可用于甘薯茎腐病疑似样本、病残体、田间土壤和种薯种苗的快速检测。当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1是本发明d.dadantii与其相似菌基于flic基因的序列比较；图2是本发明基于taqman探针的实时荧光定量pcr方法的标准曲线；图3是本发明基于taqman探针的实时荧光定量pcr方法的特异性；其中，3-a包含19份阳性菌(1-19)，2个阴性菌和1个空白对照(20-22)；3-b包含27个阴性菌(1-27)，2个阳性菌(28-29)和1个空白对照(30)；图4是本发明以dna为模板的实时荧光定量pcr方法的灵敏度检测；其中，①：28ng·μl-1,②：2.8ng·μl-1,③：280pg·μl-1,④：28pg·μl-1,⑤：2.8pg·μl-1,⑥：280fg·μl-1,⑦：28fg·μl-1；图5是本发明以dna为模板的常规pcr方法的灵敏度检测；其中，m:plusiidnamarker；1-7依次是：28ng·μl-1,2.8ng·μl-1,280pg·μl-1,28pg·μl-1,2.8pg·μl-1,280fg·μl-1,28fg·μl-1；8：阴性对照(ddh2o)；图6是本发明以菌液为模板的实时荧光定量pcr方法的灵敏度检测；其中，①：1.5×109cfu·ml-1,②：1.5×108cfu·ml-1,③：1.5×107cfu·ml-1,④：1.5×106cfu·ml-1,⑤：1.5×105cfu·ml-1,⑥：1.5×104cfu·ml-1,⑦：1.5×103cfu·ml-1,⑧：1.5×102cfu·ml-1,⑨：阴性对照(ddh2o)；图7是本发明以菌液为模板的常规pcr方法的灵敏度检测，其中，m:plusiidnamarker,1-8依次是1.5×109cfu·ml-1,1.5×108cfu·ml-1,1.5×107cfu·ml-1,1.5×106cfu·ml-1,1.5×105cfu·ml-1,1.5×104cfu·ml-1,1.5×103cfu·ml-1,1.5×102cfu·ml-1，9：阴性对照(ddh2o)；图8是本发明d.dadantii在ngm培养基上的菌落形态；其中，a代表菌落在ngm培养基上的形态，b代表单菌落在ngm培养上会产生靛蓝；图9是本发明基于探针addad2的实时pcr的检测。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1达旦提狄克氏taqman荧光定量pcr检测方法的建立1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株实验选取从不同地区、不同寄主上分离得到的达旦提狄克氏菌dickeyadadantii18株、dickeya属各个种的标准菌株9株以及其他同属不同种与近缘种的菌株19株(表1)，共计供试菌株46株，来源于浙江大学生物技术研究所和上海出入境检验检疫局。表1本发明的供试菌株“*”是指12株菌是从浙江临安分离到的(其中3株是2015年分离到的，5株是2016年分离到的，4株是2017年分离到的)；2株菌是2016年从浙江永康分离到的；2株菌是2017年浙江桐庐分离到的。“**”是指该菌株是标准菌株zju：浙江大学shciq：上海出入境检验检疫局ipp·caas：中国农业科学院植物保护研究所njau:南京农业大学。1.1.2检测样品结合甘薯茎腐病田间发病症状，于2016年在浙江临安、东阳、桐庐、永康等多个甘薯生产区采集疑似植株样本58份，薯块样本8份，在明确甘薯茎腐病发生的田块采集土壤样本4份，共70份。采集没有甘薯茎腐病的上海出入境检验检疫局动植物隔离苗圃内的健康甘薯植株、薯块、以及土壤样本各2份，作为阴性对照。1.1.3实验试剂与仪器荧光定量pcr所用引物及探针由上海基康生物技术有限公司合成，荧光定量pcr和常规pcr所用试剂购于大连宝生物公司，植物基因组dna提取试剂盒(tiangendp305)，购自天根生化科技(北京)有限公司，快速克隆试剂盒(clonexpressmultisonestepcloningkit)，购于南京诺唯赞生物科技有限公司，simgen快速质粒dna小量试剂盒，购于杭州新景生物试剂开发有限公司。实验仪器主要有美国abi-viiatm7实时荧光pcr系统、thermonanodrop2000分光光度计、abiveriti96pcr仪。1.2方法1.2.1细菌培养达旦提狄克氏菌和其他参试近缘菌株在na培养基上活化后再在na培养基上划线培养，na培养基配方见参考文献(方中达编著.植病研究方法[m].中国农业出版社,1998.)，置于培养箱(28℃，黑暗)中培养36h。向平板中加入2ml无菌水，用灭菌棉棒将菌苔冲洗成菌悬液，后装入1.5mleppendorf管中，12000rpm离心2min，弃上清，沉淀用于核酸提取。从疑似甘薯茎腐病的植株样本中直接分离达旦提狄克氏菌用ngm培养基，培养基配方：营养琼脂(nutrientagar)，23g，甘油(glycerol)，10ml，四水氯化锰mncl2·4h2o，0.4g，加蒸馏水至1000ml。1.2.2核酸提取采集的疑似植株样本剪碎，剪成长为0.5cm的小段或0.5cm×0.5cm的组织块，薯块样本切小块，土壤样本用40目的筛子过筛，取适量放置在400ml灭菌锥形瓶中，倒入200ml无菌水，使样本充分浸在水中，并于25℃150rpm的摇床上培养4h，过滤，取滤液12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用于核酸提取。取上述沉淀用植物基因组dna提取试剂盒(tiangendp305)提取达旦提狄克氏菌、参试近缘菌株及实际样本的基因组dna，具体步骤详见试剂盒说明书。1.2.3特异性引物探针的设计合成根据nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)中登录的达旦提狄克氏菌(dickeyadadantii，genebankaccessionno.jn617642.1)编码鞭毛蛋白的flic基因序列(图1)，利用bioedit软件进行序列比对分析，应用primerexpressv3.0软件设计了用于实时荧光pcr的引物ddad3/ddad4和taqman探针addad(表2)，探针5’端标记荧光报告基因fam’3’端标记荧光猝灭基团mgb，扩增目的片段大小为117bp。表2引物和探针的名称及序列1.2.4标准质粒的构建以提取的达旦提狄克氏菌dna为模板，用荧光定量引物(ddad3/ddad4)扩增相应片段。回收目的片段与pmd19-tvector连接，转化dh5α感受态细胞，利用amp抗性挑选阳性克隆子。将阳性克隆接种到lb培养基(含amp100mg·l-1)，37℃摇菌过夜，使用快速质粒dna小量试剂盒提取质粒，经pcr鉴定后委托杭州擎科生物有限公司测序验证。质粒鉴定正确后，分光光度计测定质粒浓度，按照公式：标准质粒的拷贝数＝(质量数×6.023×1023)/(质粒碱基对数×660)，计算质粒拷贝数量。经pcr鉴定，重组质粒的扩增产物大小为117bp，与预期大小一致，表明flic基因已正确插入载体pmd19-tvector中，其测序结果在ncbi经blast分析显示，与参考序列(登录号：cp002038.1)的同源性达100％，由此确定重组质粒已成功构建。将该重组质粒作为标准品，经分光光度计测定a260/a280比值为1.73，其浓度为37.5μg·μl-1，根据换算公式最终得出该质粒约为1.27×1010copies·μl-1。1.2.5荧光定量pcr的建立和条件优化实时荧光定量pcr反应总体系(25μl)，包括premix12.5μl，正反向引物(5μmol/l)各1μl，探针(10μmol/l)1μl，roxreferencedyeii0.5μl，模板dna1μl，ddh2o8μl；扩增程序，95℃预变性10s；95℃变性15s，63℃退火延伸1min，40个循环。对荧光定量pcr反应体系中退火延伸温度进行优化，在保证较高的荧光强度增加值的前提下获得较高的特异性。循环条件优化结果表明，63℃为最佳退火温度，在保证较高荧光强度的同时实现较高特异性，避免弱阳性的产生。1.2.6常规pcr反应体系和程序常规pcr反应采用引物ddad5/ddad9进行扩增。总反应体积25μl，10×pcrbuffer2.5μl，mg2+2μl，dntp(10μmol/l)2μl，正反向引物(10μmol/l)各1μl，dna模板1μl，taq酶0.2μl(1u)，ddh2o15.3μl。pcr反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。pcr扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。1.2.7标准曲线的制作将已知标准品质粒进行10倍倍比稀释，得到1.27×107～1.27×101copies/μl系列标准模板，采用优化好的检测体系进行荧光定量pcr，得到各自ct值，以ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数为横坐标制作标准曲线。以10倍倍比稀释得到的1.27×107～1.27×101copies/μl的重组质粒为标准模板，同时以空质粒为阴性对照进行荧光定量pcr扩增。以各梯度浓度的对数值为x轴，ct值为y轴，绘制标准曲线(图2)。模板浓度与检测到的荧光信号循环数负相关，相关系数为r2＝0.9976(大于0.98)表明不同梯度模板的对数值与ct值之间呈现良好的线性关系，可用于模板浓度的测定。扩增效率e＝99.85％，在80％～120％之间说明扩增效率理想。当无ct值且无预期扩增曲线时，表示样品中不含达旦提狄克氏菌；当ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有达旦提狄克氏菌；当ct值＞35.0，则该样品做重复实验；重复实验结果无ct值，则该样品中不含达旦提狄克氏菌；若重复实验结果有ct值，则该样品中含达旦提狄克氏菌。实施例2特异性实验根据上述检测体系对46株供试菌株(表1)进行检测，通过荧光定量pcr结果验证引物及探针的特异性。参试菌株(表1)在最优条件下进行taqman荧光定量pcr检测。选取的19株达旦提狄克氏菌均有明显的扩增曲线生成(图3-a)，而所有的其他27株阴性菌株及空白对照均无扩增(图3-b)。说明该taqman荧光定量pcr法显示了对达旦提狄克氏菌高度特异性。实施例3灵敏度实验将d.dadantii菌株ncppb898的纯化dna用分光光度计测定该dna的浓度，并进行系列浓度梯度稀释，使其终浓度分别为28ng·μl-1、2.8ng·μl-1、280pg·μl-1、28pg·μl-1、2.8pg·μl-1、280fg·μl-1、28fg·μl-1，分别取1μldna作为实时荧光pcr和常规pcr的反应模板，比较两种方法的灵敏度差异。对标准菌株ncppb898活化，在na上划线，置于28℃培养箱中培养36h。将平板上的菌苔用无菌水冲洗下来，配制成50ml的菌悬液，吸取5ml进行10倍浓度稀释，按此方法依次稀释，形成8个系列浓度。各梯度分别取100μl涂na平板培养，每个梯度设置3个重复，利用平板计数法计算各梯度菌液的平均浓度。最终配制成1.5×109cfu/ml、1.5×108cfu/ml、1.5×107cfu/ml、1.5×106cfu/ml、1.5×105cfu/ml、1.5×104cfu/ml、1.5×103cfu/ml、1.5×102cfu/ml浓度梯度的菌悬液，取1μl菌悬液进行实时荧光定量pcr检测和常规pcr检测，以菌液为模板的灵敏度检测。对标准品质粒各稀释度进行taqman荧光定量pcr检测，结果显示所建立的taqman荧光定量pcr最低可检测到1.27×102copies，相当于375fg·μl-1(图4)。对纯化各稀释度进行taqman荧光定量pcr检测和常规pcr检测，结果显示dna含量为28ng·μl-1、2.8ng·μl-1、280pg·μl-1、28pg·μl-1、2.8pg·μl-1、280fg·μl-1时都能检测到荧光信号明显增加，表现为阳性扩增；而28fg·μl-1浓度下的dna没有检测到荧光信号的明显增加，表现为阴性扩增。由此可见，所建立的荧光定量pcr最低可检测到280fg·μl-1(图4)。常规pcr最低可检测到280pg·μl-1(图5)，因此，所建立的荧光定量pcr方法的灵敏度明显高于常规pcr，是常规pcr的1000倍。对d.dadantii菌悬液各稀释梯度进行taqman荧光定量pcr和常规pcr检测，结果显示1.5×109cfu·ml-1、1.5×108cfu·ml-1、1.5×107cfu·ml-1、1.5×106cfu·ml-1、1.5×105cfu·ml-1、1.5×104cfu·ml-1、1.5×103cfu·ml-1浓度条件下，荧光定量pcr会有特异性扩增,其他情况均表现为阴性扩增。由此可见，所建立的荧光定量pcr最低可检测到1.5×103cfu·ml-1(图6)，常规pcr最低可检测到1.5×105cfu·ml-1(图7)，表明所建立的荧光定量pcr方法的灵敏度高于常规pcr的100倍。实施例4实际样品检测本发明选用来自浙江临安、金华、桐庐和永康等地的样本共70份(表4)，样本有发黑坏死或水渍状病变的茎、叶柄组织，有叶脉及其周围发黑的叶片组织，有表皮发黑横切面可见黑褐色病斑的薯块和发病植株的根围土。采用分离培养法、普通pcr法和基于taqman探针的荧光定量pcr方法对这70份样品进行检测诊断。对发病的茎、叶柄组织及薯块，取病健交界处捣碎，浸出液划线培养；对于土壤样本，混匀过筛后随机称取10g放入灭菌锥形瓶中，然后加入100ml无菌水，置于25℃，200rpm摇床上摇30min，后三层滤纸过滤，吸取100ul滤液进行涂板。所有浸出液或滤液都在ngm培养基(leey-a,yuc-p(2006)adifferentialmediumfortheisolationandrapididentificationofasoftrotpathogen,erwiniachrysanthemi.journalofmicrobiologicalmethods64:200–206.)涂板，28℃培养48h后挑选产生靛蓝的单菌落进行纯化培养，同时挑取单菌落制备成菌悬液，利用引物flic-1/flic-2其进行flic基因位点pcr扩增(johanvanvaerenbergh,stevebaeyen，pauldevos，martinemaes.sequencediversityinthedickeyaflicgene:phylogenyofthedickeyagenusandpcrfor'd.solani',newbiovar3variantonpotatoineurope[j].plosone,2012,7(5):1-9.)，送交至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，获得的序列进入ncbigenebank进行分析比对。将上述浸出液和菌悬液进行普通pcr和荧光定量pcr扩增，普通pcr扩增使用引物ddad5/ddad9，反应体系与方法如1.2.6所述；荧光定量pcr使用引物ddad3/ddad4，探针为addad2，反应体系与方法如1.2.5所述。利用分离培养法、常规pcr法和荧光定量pcr法对田间采集的70份样本进行检测。结果显示，在根据flic基因设计的taqman探针进行荧光定量pcr中，有64份样本呈现明显扩增曲线(图9)，有15.77至32之间的ct值(表3)，证明了这64份样本中存在d.dadantii，检出率达91.4％；利用普通pcr进行检测，检出54份阳性，检出率77.1％；而常规分离法中，确实从50份样本浸出液在ngm培养基上划线培养可看到产生靛蓝的菌落(图8)，挑取单菌落纯化培养，并且用引物flic-1/flic-2产生的flic扩增子的序列分析证实了是d.dadantii，表明用常规分离法检出率为71.4％(表4)，因此可认为荧光定量pcr检测样本的灵敏度高于培养法和常规pcr。同时分离培养法实验周期长，整个检测过程需要96h，任务量大，且易受腐生菌的干扰造成实验结果的偏差，不适用于样品的快速检测；常规pcr虽然在灵敏度和特异性方面较培养法得到大幅提升，但检测灵敏度仍低于荧光定量pcr。综上所述，taqman荧光定量pcr法不仅能特异性的检测出d.dadantii，检出率高，而且省时省力，可以运用到实际样品的检测中。表3不同检测方法对甘薯茎腐疑似样本诊断分析结果注：*该列数值是ct值，当无ct值时，样品为阴性；当ct值≤35.0，时，样本为阳性；“+”为阳性，“-”为阴性。表4疑似样品的分离培养、常规pcr和实时荧光定量pcr检测结果检测方法时间/h阳性样品数阳性率/％分离培养965071.4常规pcr35477.1实时荧光定量pcr1.56491.4上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。序列表<110>浙江大学<120>一种达旦提狄克氏菌taqman荧光定量pcr检测方法及应用<130>2018051<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1acccaggccaccagaagt18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gacggtactgttaccgctac20<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cagtggtgcctgcgccaac19<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gtctgcagagcagtatcaatc21<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5aaacttcaacggcaaagcg19当前第1页12