本发明属于生物技术领域，具体涉及幽门螺杆菌感染的预防和治疗，更具体地涉及一种抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的制备方法及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌（helicobacterpylori）是科学家barrymarshall和robinwarren发现的，该菌能够感染胃部组织并且引发溃疡，而这两位研究者也因发现了幽门螺杆菌而获得了2005年的诺贝尔生理学及医学奖。
幽门螺杆菌，是胃溃疡和胃癌的致病因子。据估计，一半的世界人口感染上幽门螺杆菌。很多感染者产生胃炎症状，而且每5名感染者当中，就有1人极大可能患上胃溃疡。在很多情形下，这是一种病情进展快速的致命性疾病。胃炎和胃溃疡虽然可利用抗生素加以治疗，但是通常需要使用两到三种不同类型的抗生素，且并不是对所有的患者都有效。若未得到有效治疗，长期的幽门螺杆菌炎症最终会引发胃癌的产生。而胃癌是一种高度致死性、难以治愈的癌症。在全世界，胃癌每年影响着100万人，每年有超过70万人死于胃癌。目前，胃癌产生的主要原因被认为是幽门螺杆菌（helicobacterpylori）感染，但缺乏有效治疗胃癌的方法货药物；另一方面，由于抗生素耐药性的不断扩散和增强，幽门螺杆菌的防治变得更加复杂。
对胃黏膜的附着是建立细菌定植的第一步，而幽门螺杆菌表面的粘附在与人胃黏膜的结合中起着关键作用。日前，一项刊登于国际杂志naturemicrobiology上的研究报告中，来自慕尼黑工业大学等机构的研究人员通过研究发现了一种新方法来抑制或治疗幽门螺杆菌引发的感染或并发症。为了在人类胃部持久地生存，幽门螺杆菌必须吸附到胃粘膜的上皮细胞上，文章中研究人员检测到了幽门螺杆菌在上皮细胞中吸附力的特异性明显改变，即幽门螺杆菌表面的黏附因子hopq能够结合到胃部组织的癌胚抗原相关的细胞粘附分子（ceacams）上；研究者bernhardb.singer认为，相对比以前所报道的细菌所产生黏附因子而言，这里所研究发现的结合作用并不依赖于糖类的结构，这似乎就表明，幽门螺杆菌在胃部的酸性环境中会保持特异性地稳定作用，ceacams并不会在健康的胃部组织中出现，但当幽门螺杆菌引发胃部炎症时ceacams就会出现。hopq-ceacam1相互作用使细胞毒素相关基因a（caga）的易位成为宿主细胞，增强了促炎性介质的释放，如白介素-8。在研究中发现，如果幽门螺杆菌缺失黏附因子hopq，则不能使幽门螺杆菌定植于胃上皮细胞，从而进一步诱导炎症反应。这也就说明粘附因子hopq对幽门螺杆菌定植胃上皮细胞是相当重要的。若缺失hopq或hopq无法发挥正常作用，则能抑制hopq介导的cag毒力通路的激活，如遗传或抗体介导的hopq功能显示，也就能抑制接下来幽门螺杆菌侵染后的一系列的炎症感染。可见，hopq-ceacam1相互作用是一种潜在的有前途的新治疗靶点，用于治疗幽门疾病相关疾病。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供幽门螺杆菌hopq在制备抗幽门螺杆菌卵黄抗体中的应用。所述幽门螺杆菌hopq基因在幽门螺杆菌附着胃黏膜细胞的过程中发挥着重要的作用，本发明以幽门螺杆菌hopq为抗原制备的抗幽门螺杆菌卵黄抗，可以很好的阻止幽门螺杆菌附着在胃黏膜细胞上，即可减少幽门螺杆菌的感染，降低幽门螺杆菌引发疾病的几率。
本发明的另一目的在于提供一种抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种抗幽门螺杆菌的卵黄抗体。
本发明的再一目的在于提供所述抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的应用。
本发明的再一目的在于提供一种包含有所述抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
幽门螺杆菌hopq(37-453)在制备抗幽门螺杆菌卵黄抗体中的应用，所述幽门螺杆菌hopq的序列如seqidno:1所示。
幽门螺杆菌hopq对于幽门螺杆菌是否能够成功的粘附于胃粘膜细胞上具有重要的影响，当幽门螺杆菌无法依靠hopq粘附于胃粘膜细胞上时，则幽门螺杆菌引发感染的几率明显下降，幽门螺杆菌感染引发相关疾病的几率也将明显降低。
与ceacams结合的幽门螺杆菌hopq结构是hopq的胞外3+4螺旋绑定域中的β发夹结构，基因序列是180-218。本发明采用的是hopq中37-463的序列。通过幽门螺杆菌hopq作为抗原，制备得到可以特异性识别hopq的抗体，则能竞争性地抑制hopq介导的cag毒力通路的激活，抑制接下来一系列的炎症感染。
一种抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的制备方法，所述方法包括如下过程：
s1.先克隆幽门螺杆菌hopq基因片段，然后将其重组到表达载体上诱导蛋白表达，并将得到的蛋白进行分离和纯化，得到hopq重组蛋白；所述hopq重组蛋白的氨基酸序列如seqidno:2所示；
s2.用hopq重组蛋白对产蛋家禽进行免疫，然后收集免疫后的家禽所产的蛋；
s3.从收集的蛋的卵黄中提取、纯化抗幽门螺杆菌的抗体，并冷冻、干燥，得到抗幽门螺杆菌的卵黄抗体干粉。
利用幽门螺杆菌hopq免疫产蛋家禽，使产蛋家禽体内产生抗体，并生产蛋黄内含有抗幽门螺杆菌的抗体的鸡蛋。产蛋家禽在反复摄取幽门螺杆菌hopq抗原后，产蛋家禽体内产生抗体，其产下的蛋的蛋黄中就存在抗幽门螺杆菌hopq的抗体。该抗体可以抑制hopq-ceacam1相互作用与结合，阻止幽门螺杆菌吸附到胃粘膜的上皮细胞上，减少其入侵机体天然的免疫系统和诱发相应的感染，对于胃溃疡和胃癌有预防和治疗作用。
优选地，所述幽门螺杆菌hopq的序列如seqidno:1所示。
优选地，步骤s2中对产蛋家禽进行免疫时，hopq重组蛋白可配以佐剂进行注射免疫。
优选地，对家禽进行注射免疫时，每次注射的剂量为300～500ug/只；注射次数为3～5次；每次注射间隔时间为2周。
优选地，当收集的蛋中抗幽门螺杆菌抗体滴度低于104时，可对产蛋家禽进行强化免疫；所述产蛋家禽为产蛋鸡。
本发明同时还保护上述制备方法得到的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体，所述幽门螺杆菌hopq的序列如seqidno:1所示。
所述抗幽门螺杆菌的卵黄抗体在制备预防幽门螺杆菌感染疫苗中的应用也在本发明的保护范围内。
所述抗幽门螺杆菌的卵黄抗体作为预防幽门螺杆菌感染的添加剂的应用也在本发明的保护范围内。
优选地，所述添加剂可添加在药物、保健性和/功能性食品药品或食品中。
本发明还保护一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含有所述抗幽门螺杆菌的卵黄抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明使用幽门螺杆菌hopq作为抗原，制备出特异性抗幽门螺杆菌的卵黄抗体，可以特异性的对抗hopq-ceacam1相互作用与结合，阻止幽门螺杆菌吸附到胃粘膜的上皮细胞上，减少其入侵机体天然的免疫系统和诱发相应的感染。
（2）为了解决卵黄抗体大规模生产所需的抗原来源的问题，利用基因工程和蛋白重组的技术来制备幽门螺杆菌抗原，操作简单，成本低。
（3）本发明所述抗幽门螺杆菌卵黄抗体可添加到各种药品、保健品或食品中，用于预防预防幽门螺杆菌的感染；还可以制备成为幽门螺杆菌的检测试剂盒，用于快速、准确检测幽门螺杆菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
1、幽门螺杆菌hopq抗原的制备
先将幽门螺杆菌hopq的37-453bp基因作为模板，退火温度设为50℃进行pcr扩增。回收pcr产物经kpnⅰ和hindⅲ酶切回收，与同样经过双酶切处理的xl1-blue表达载体进行连接、转化。按常规方法对重组质粒进行鉴定，重组质粒命名为pqe-hopq(37-453)。将鉴定正确的重组质粒pqe-hopq(37-453)转化xl1-blue表达菌。次日挑取单菌落接种于3ml含amp(100ug/ml)的lb液体培养基，于37℃，200rpm振荡培养；过夜培养后，以0.5-5％的接种比例接入,诱导之前发酵条件温度为37℃，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，ph为6.0-8.0，诱导之时发酵液od值0.6-0.8，温度为20℃～30℃，iptg浓度0.1～1.0mm，搅拌转速200rpm，通气量1vvm，ph为6.0-8.0，诱导5h，离心收集菌体。超声破碎细胞。4℃、12000rpm离心10min，收集上清液。用gehealthcare公司ni-nta树脂说明书进行重组蛋白的纯化；并应用bradford法对纯化的幽门螺杆菌hopq(37-453)蛋白进行定量分析。
2、抗幽门螺杆菌hopq特异性igy的制备
（1）对产蛋鸡的免疫
将上述制备的幽门螺杆菌hopq抗原与等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂进行乳化2-4h，即得微球疫苗。将制备的疫苗对双侧翅下多点注射免疫spf级产蛋鸡，初免剂量为500ug/只；间隔2周加强免疫一次，免疫剂量调整为400ug/只，第三次免疫后一周开始收集鸡蛋，共免疫3～5次；检测卵黄抗体滴度，此后当卵黄抗体滴度低于104时可进行强化免疫，免疫剂量为200ug/只。通过sds－page、westernblot和elisa等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
（2）抗体的分离与纯化
将鸡蛋表面污物用清水洗净，用75%的酒精棉擦拭蛋壳，破壳用卵黄分离器分离卵黄，将卵黄放在中性滤纸轻轻滚动直至表面蛋清彻底去除；刺破卵黄膜，取其卵黄液，量其体积；量取双蒸水，调节ph=5.0-5.2，按比例加入双蒸水1:10（卵黄：双蒸水）；充分搅拌，4℃过夜（16h）；中性滤纸过滤后取滤液离心1000g、1h、4℃，上清加饱和硫酸铵至50%饱和度4℃孵育1h，6000g离心30min，沉淀用双蒸水重悬至原体积加入19%硫酸钠（190g/l）常温下孵育20min。6000g离心20min，沉淀用双蒸水重悬至原体积加入14%硫酸钠（140g/l）常温下孵育20min，再离心，将沉淀冷冻干燥形成干粉，即得到抗幽门螺杆菌的卵黄抗体干粉，-20℃保存备用。
实施例2抗幽门螺杆菌卵黄抗体的细菌酶标染色
取幽门螺杆菌j99（atcc700824）作酶标染色，涂片并热固定。将实施例1制得的抗幽门螺旋杆菌幽门螺杆菌的卵黄抗体用ph为7.4、0.01mol/l的pbs分配成3个浓度（1:10、1:100、1:1000）（mg：ml）滴加于玻片上37℃作用30min后充分洗涤。滴加二抗（hrp酶标兔抗鸡igy）（promegacorporation）滴加dab显色液并显微镜观察，并用未免疫鸡的igy（免疫前鸡蛋卵黄纯化而来）作为阴性对照。结果表明阴性对照未被染色，3个浓度（1:10、1:100、1:1000）的染色强度分别为+++、+++、+，说明抗幽门螺杆菌的卵黄抗体能和幽门螺杆菌结合，实施例1制备的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体可以特异性识别幽门螺杆菌。
实施例3抗幽门螺杆菌卵黄抗体的效价测定
将实施例1制得的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体从1：10倍比稀释至1：51200检测其效价。
elisa间接酶联免疫实验，将实施例1制得的重组幽门螺杆菌hopq(37-453)用包被液稀释至10µg/ml，elisa板每孔包被100μl，用封膜覆盖96孔酶标板，37℃温育2h，然后甩干孔中液体，用pbst洗涤1次，吸水纸拍干；每孔加入100µl30mg／ml脱脂奶粉进行封闭，置37℃温育1h，然后甩干孔中液体，用pbst洗涤3次（每次洗涤后留置4min），用吸水纸拍干；pbst洗板后加入卵黄抗体倍比稀释液（1:160～1:10240），100µl／孔加入酶标反应板中，最后一行加入pbs作为空白对照，37℃温育1h，甩干，用pbst洗涤3次（每次洗涤后留置4min），吸水纸拍干；每孔加入l:3000的兔抗鸡igy-hrp抗体（promegacorporation）100µl，置37℃温育1h。甩干，用pbst洗涤3次（每次洗涤后留置4min），然后用吸水纸拍干；每孔加入新鲜配制的底物液（10mg3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（tmb）溶于5ml无水乙醇，用4.5ml蒸馏水稀释，再加5ml磷酸柠檬酸缓冲液，加样前再加入10µl双氧水）100µl，置37℃温育15min，然后每孔加入50µl浓度为2mol／l的h2so4终止反应。将酶标板置酶标仪490nm长处测od值。吸光度od值在对照2倍以上为阳性标准，测定抗体滴度。结果表明，本发明制备的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体，抗体滴度可达1:10000以上，表明hopq具有良好抗原性，有望成为一个新的幽门螺杆菌的疫苗分子；同时表明实施例1制备的抗幽门螺杆菌卵黄抗体对幽门螺杆菌具有良好的特异性。
实施例4抗幽门螺杆菌幽门螺杆菌卵黄抗体致病微生物检测
根据《中国药典》2015版附录1106“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”的检验方法，对实施例1制得的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体进行控制菌检查，未检出耐胆盐革兰阴性菌，大肠埃希菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，梭菌和白色念珠菌。
结果证明实施例1制得的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体安全性高，未携带其他病原菌。
实施例5抗幽门螺杆菌卵黄抗体禽流感病毒检测
实施例1制得的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体用纯化水配制成1mg/ml溶液，使用禽流感病毒胶体金检测试剂盒进行检测，试验结果显示禽流感病毒阴性。
结果表明实施例1制得的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的安全性高，可制备成为疫苗或食品添加剂、药物添加剂进行使用。
实施例6一种含抑制幽门螺杆菌的卵黄抗体的酸奶
（1）准备原料：主要原料包括奶粉、木糖醇和幽门螺杆菌的卵黄抗体；
（2）配制乳液：称取奶粉125g，在奶粉中加入75℃，1000ml温开水配制成乳液；
（3）均质：将步骤（2）中的乳液在均质机上均质2min，均质机的压力保持在10mpa；
（4）灭菌：将步骤（3）中均质后的乳液在90℃的水浴锅中保温10min进行杀菌处理，然后将其冷却至40℃，得到料液；
（5）接种：在无菌条件下，加入无菌的抑制幽门螺杆菌的卵黄抗体10mg，另将发酵剂，按照1g/1000ml的比例接种到料液中，并将其搅拌均匀，得到接种料液；
（6）发酵：在无菌条件下，将接种料液等量灌装于灭菌的玻璃瓶中并封口，然后将封口好的玻璃瓶放置于42℃恒温培养箱中发酵5h；
（7）后发酵：将步骤（6）中发酵后的玻璃瓶放入1℃～4℃的冰箱中进行后发酵，后发酵至少保持24h，得到含抑制幽门螺杆菌的卵黄抗体的酸奶。
实施例7
每100g奶粉中加入10g含抗幽门螺杆菌的igy蛋黄粉或1g含抗幽门螺杆菌的纯化的igy冻干粉，所得产品可用于婴幼儿和成人预防hp感染，或已感染hp患者的辅助治疗。
实施例8
每100ml牛奶中加入1g含抗幽门螺杆菌的纯化igy冻干粉，所得产品可用于婴幼儿和成人预防hp感染，或已感染hp患者的辅助治疗。
实施例9
抗幽门螺杆菌的纯化igy冻干粉与猴头菇多糖按1:5比例混合，灌装胶囊，可用于保护胃黏膜的保健食品。
实施例10
抗幽门螺杆菌的纯化igy冻干粉添加制剂辅料，制成口服液，颗粒剂片剂或胶囊，可用于治疗因hp感染引起的慢性胃炎、十二指肠溃疡等疾病；也可用于预防hp的感染。
实施例1所制备得到的抗幽门螺杆菌的纯化igy还可以作为添加剂在其他药物、保健性药品以及各种其他食物中的应用，用以预防幽门螺杆菌感染引发的相关疾病。另外还可以将实施例1所制备得到的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体用于制备幽门螺杆菌的检测试剂盒中，用于快速检测幽门螺杆菌。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110>广东工业大学
<120>一种抗幽门螺杆菌的卵黄抗体制备方法及应用
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1923
<212>dna
<213>幽门螺杆菌(helicobacterpylori)
<400>1
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