本发明属于化合物制备技术领域，具体涉及一种9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷偶联荧光类探针化合物(即，9-氮(6’-氨基)己基杂双环[3.3.1]壬烷偶联罗丹明b类化合物)及其制备法与应用。
背景技术：
正常细胞与肿瘤细胞在外表上通常没有明显的区别。目前大多用分子生物学技术与方法测定基因是否发生突变或特异性标志蛋白或分泌物表达量增减来确定是正常细胞还是肿瘤细胞。这些方法所用的仪器及试剂昂贵，操作过程复杂。因此，测试费用高，难以在临床检测中广泛使用。在肿瘤临床医学活检样品中大多数情况下正常细胞与肿瘤细胞并存，上面所述方法难以区别指定细胞是肿瘤还是正常细胞。sigma-1受体是由223个氨基酸构成的具有两个跨膜结构的蛋白质，分子量为25kda，其在体内分布广泛，存在于中枢神经系统、内分泌系统、免疫系统和某些周边组织中，可能在调节神经、内分泌和免疫应答中起着重要作用。sigma受体为一类存在于多种肿瘤组织和正常组织中的独特的受体。经研究表明至少有两种类型的sigma受体已被确定，即sigma-1型和sigma-2型受体。研究发现，sigma-2受体是由176个氨基酸构成的跨膜蛋白质，分子量21.5kda，在多种肿瘤细胞株包括乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌等细胞中高丰度表达，参与调节肿瘤细胞的生长、迁移转化、凋亡等重要生理功能过程，是肿瘤细胞表达的结合位点，且其配体能够提供一种选择性抗癌症疗法的有效机制。研究发现sigma-2受体在生长期肿瘤细胞中的表达量是在普通细胞及静息肿瘤细胞中表达量的十倍之多，这一特点使sigma-2受体被认为是肿瘤繁殖状态的生物标志物。因此推动了人们对sigma-2受体作为一种癌症治疗的潜在靶点的研究。故，能和sigma-2受体特异性结合的配体可以作为靶向运载体。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种具有发射荧光功能的9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷偶联罗丹明b类探针化合物及其制备方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷偶联罗丹明b类探针化合物，其结构式如(i)所示：
其中，r为h、f、cl、br、i、no2。
本发明还同时提供了上述化合物的制备方法，总体反应式如下所示：
具体包括如下步骤：
1)、在有机溶剂ⅰ中(以有机溶剂为反应介质)，在催化剂的作用下，将罗丹明与n-羟基琥珀酰亚胺(hosu)按照1:1～4的摩尔比混合后于30～55℃反应1～3小时，得到罗丹明b-n-琥珀酰亚胺酯；
所述催化剂与罗丹明b的摩尔比1:0.8～100；
所述罗丹明为罗丹明b或罗丹明b取代衍生物；
2)、在有机溶剂ⅱ中，将9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯与罗丹明b-n-琥珀酰亚胺酯按照1:1～3的摩尔比混合后于20～40℃反应2～4小时，得到9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b。
作为本发明制备方法的改进：所述步骤1)中，所述罗丹明b取代衍生物为5(6)-氟代罗丹明b、5(6)-氯代罗丹明b、5(6)-溴代罗丹明b、5(6)-碘代罗丹明b、5(6)-硝基罗丹明b。
作为本发明制备方法的进一步改进：步骤1)中，所述催化剂为二环己基碳二亚胺。
作为本发明制备方法的进一步改进：步骤1)中，有机溶剂ⅰ为乙腈，有机溶剂ⅰ的体积用量与罗丹明的物质量的用量比为100～400ml/100mmol。
作为本发明制备方法的进一步改进：步骤2)中，有机溶剂ⅱ为氯仿：乙腈＝1:1～5体积比的混合液。
作为本发明制备方法的进一步改进：步骤2)反应结束后，所得反应产物用乙醇重结晶，得白色亮粉状粉末状的9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b。
本发明还同时提供了上述的9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷偶联罗丹明b类探针化合物的用途：用于区别乳腺正常细胞与肿瘤细胞的诊断试剂；特别是识别恶性肿瘤细胞。即，该化合物对生长期乳腺癌肿瘤细胞有高亲和性，可用于区分乳腺癌细胞与乳腺正常细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种9-氮[6’-氨基]-己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b类化合物的制备方法以及应用，其制备方法与所用设备简单、后处理方便、产品收率高、该化合物对生长期乳腺癌肿瘤细胞有高亲和性，可用于乳腺癌诊断造影。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下案例中，搅拌的转速约为300～400转/分钟。
实施例1、9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b类化合物的合成方法，依次进行以下步骤：
1)、取罗丹明b2.4g(5.21mmol)溶于100ml乙腈中，得罗丹明b溶液；
另取n-羟基琥珀酰亚胺(hosu)0.6g(5.21mmol)溶于30ml的乙腈中，得hosu溶液；
将上述两溶液(罗丹明b溶液、hosu溶液)混合，于45℃的搅拌条件下，将含5.82mmol(约1.2g)二环己基碳二亚胺(dcc)的乙腈溶液(30ml)滴加到混合反应液中(滴加过程中，控制温度不超过45℃)，保温(45℃)反应一小时后，于室温搅拌反应液过夜，过滤，滤液蒸除乙腈，粗产品用乙腈/乙醚(乙腈/乙醚＝1：1的体积比)重结晶，得罗丹明b-n-琥珀酰亚胺酯。
2)、取9-氮(6’-氨基)己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯0.5g(1.24mmol)溶于5ml的ch2cl2溶液中，加入5ml含1.43g(2.48mol)罗丹明b-n-琥珀酰亚胺酯乙腈溶液，室温反应4h，减压蒸去溶剂，得白色固体粉末，粉末用乙醇重结晶，水洗多次，干燥产物(80℃干燥至恒重)，得白色亮粉状粉末。
其结构式为：
其中：r＝h。
9-氮[6’-氨基]己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b,为白色固体，产率63.11％；m.p.219℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.83–7.01(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h65n5o5(％),calculated:c,73.97；h,7.91；n,8.46；found:c,73.96；h,7.99；n,8.25。
实施例2，将实施例1中的原料罗丹明b改为5(6)-氟代罗丹明b，摩尔量不变，其余等同于实施例1。
产物为：
其中r＝f。
9-氮[6’-氨基]己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-氟代罗丹明b,为白色固体，产率64.23％；m.p.225℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.60–7.31(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h64n5o5f(％),calculated:c,72.31；h,7.62；n,8.27；found:c,72.51；h,7.84；n,8.21。
实施例3，将实施例1中的原料罗丹明b改为5(6)-氯代罗丹明b，摩尔量不变，其余等同于实施例1。
产物为：
其中r＝cl。
9-氮[6’-氨基]己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-氯代罗丹明b,为淡黄色固体，产率57.20％,m.p.231c；1hnmr(500mhz,cdcl3).1hnmr(500mhz,cdcl3)δ8.49–7.25(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h64n5o5cl(％),calculated:c,70.93；h,7.47；n,8.11；found:c,71.22；h,7.64；n,8.21。
实施例4,将实施例1中的原料罗丹明b改为5(6)-溴罗丹明b，摩尔量不变，其余等同于实施例1。
产物为：
其中r＝br。
9-氮[6’-氨基]己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-溴罗丹明b,为棕色固体，产率51.99％,m.p.229℃；δ8.32–7.15(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h64n5o5br(％),calculated:c,67.46；h,7.10；n,7.71；found:c,67.59；h,7.36；n,7.68。
实施例5，将实施例1中的原料罗丹明b改为5(6)-碘罗丹明b，摩尔量不变，其余等同于实施例1。
产物为：
其中r＝i。
9-氮[6’-氨基]-己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-碘罗丹明b，为棕黑色固体，产率55.53％,m.p.263℃；1hnmr(500mhz,cdcl3)，δ8.04–6.98(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h64n5o5i(％),calculated:c,64.14；h,6.76；n,7.33；found:c,64.25；h,6.96；n,7.18。
实施例6，将实施例1中的原料罗丹明b改为5(6)-硝基罗丹明b，摩尔量不变，其余等同于实施例1。
产物为：
其中r＝no2。
9-氮[6’-氨基]-己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-硝基罗丹明b，为浅黄色固体，产率46.91％,m.p.193℃；.elementalanal.δ8.04–6.98(m,12h,arh),6.77(m,1h,conh),4.22(d,j＝7.1hz,1h,oc-h),3.86(m,3h,och3),3.49(s,8h,-n(ch2ch3)2中ch2),3.08(s,3h,ch3),2.31(s,4h,-n(ch2ch3)2中ch3),1.94(d,j＝11.9hz,6h),1.79–1.56(m,8h),1.56(s,8h),1.35(d,j＝2.0hz,8h),1.09(d,j＝11.6hz,10h).elementalanal.forc51h64n6o7(％),calculated:c,70.08；h,7.38；n,9.61；found:c,70.32；h,7.55；n,9.39。
实验1、肿瘤细胞亲和性分析
试验对象:乳腺癌细胞mcf-7
试验方法：采用竞争性结合实验法，利用中性环境下荧光探针能与乳腺癌细胞mcf-7结合，在激发光存在下能发出荧光的特性，先将相同摩尔量的mcf-7细胞与sigma-2受体特异性配体ac927(作为空白参照,)或9-氮[6’-氨基]-己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b类化合物孵育2h,根据细胞荧光强度的变化可以判断这些化合物与肿瘤细胞结合力的大小。
药剂准备：供试药，取药配成5×10-3mol/l的乙醇溶液；取实施例1-5所述化合物各适量，加适量乙醇溶解配成5×10-3mol/l的乙醇溶液；另取适量ac927，加适量乙醇溶解配成5×10-3mol/l的乙醇溶液，竞争结合具体方法按照常规组织细胞化学染色方法进行。
表1，5×10-3mol/l浓度下各化合物的细胞亲合力(％)(按9-氮[6’-氨基]-己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联罗丹明b参照为100％结合细胞，其他化合物结合细胞相对百分比)。
表1
从上表1各化合物与肿瘤细胞结亲和力结果表明，与对照药剂(sigma受体特异性配体)相比，本发明制得的9-氮[6’氨基]己基-9-氮杂双环[3.3.1]壬烷-3α-烷基氨基甲酸苯酯偶联5(6)-氟代罗丹明b类化合物对乳腺癌肿瘤细胞mcf-7，实施例2化合物有最高的结合力及荧光效率；实施例1,3～6化合物有一定结合力及荧光效率但都比实施例2的化合物弱。因此实施例2化合物有可能成为区别正常与肿瘤细胞的诊断试剂。
对比实验、将目前已知的以下化合物，按照上述实验1所述方法进行检测，所得结果如下表2所述。
表2
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具有实施例。显然，本发明不限于以上实施，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。