本发明涉及生物医学技术领域，并且更具体地，涉及到两种可产生tk1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种tk1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。
背景技术
胸苷激酶1（thymidinekinase1，tk1），也称为细胞质胸苷激酶，是线粒体胸苷激酶（又称肌苷激酶2，thymidinekinase2，tk2）的同工酶。tk1催化胸苷（tdr）磷酸化为胸苷一磷酸（tmp），进而形成的胸苷三磷酸（tpp），为dna合成提供必需的脱氧核苷酸原料，是dna合成的关键酶之一。
tk1的表达与多种肿瘤细胞增殖紧密相关。在肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、骨肉瘤和前列腺癌等多种癌细胞中tk1表达水平不同程度升高。因此tk1表达水平能直观反映肿瘤细胞增殖速率，可实现动态、连续和评估，是一种是国际公认的优选肿瘤广谱标志物。目前认为，tk1检测的临床应用价值体现在：①动态监控手术放化疗效果；②独立的肿瘤预后评估因子；③更早评估肿瘤复发风险；④评估各类增殖疾病恶变风险。另外tk1检测在健康体检方面也有较好的应用价值，包括：①早期发现体内的恶性增殖状况，具有早期性；②筛查出进展期癌前病变，预防肿瘤发生。
有相关流行病学调查结果表明，人体外周血中tk1浓度在2pm以下提示体内细胞增殖度正常；若在2pm以上，则提示体内存在细胞异常增殖，包括炎症、脂肪肝、胆结石、乳腺增生、前列腺增生、消化道溃疡、肿瘤等，需要予以关注、进一步全面检查或者定期复查等。
目前临床和科研工作中对tk1的检测包括检测组织切片中的tk1和检测外周血中的tk1。前者通过免疫组化的方式实现，后者则通过各种免疫学检测方法实现，包括固相酶联免疫吸附试验（elisa）和免疫化学发光等，其中酶免疫点印迹化学发光法，可以实现对外周血、细胞培养上清等标本中的tk1的高灵敏度、高特异性定量分析，应用尤为广泛。
无论是基于免疫组化的定性/半定量分析，还是基于elisa和免疫化学发光的定性/定量分析，都离不开高质量的tk1特异性抗体。目前行业内应用的tk1特异性抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，前者主要是来自鸡的igy，后者主要是来自于小鼠的igg；从免疫原性方面，主要是应用tk1蛋白中的免疫原性多肽（表位肽），包括羧基端的多肽和氨基端的多肽，免疫鸡或者小鼠得到抗体；部分抗体是应用全长的tk1蛋白作为免疫原，但这些tk1蛋白均为体外原核重组表达而成。至于以体外真核重组表达的全长tk1蛋白作为免疫原制备的tk1特异性抗体尚未见报道。
根据生物信息学分析，人tk1蛋白中存在较多的糖基化、磷酸化和乙酰化等翻译后修饰靶点，这就导致了原核重组表达的tk1与真核表达的tk1在分子组成、分子结构上存在一定差异。因此，采用真核重组表达tk1蛋白，更好地代表真核细胞中tk1的天然分子状态，将其作为免疫原免疫动物，制备抗体，将有利于提升抗体制备的效率、抗体识别天然tk1蛋白的特异性和亲和力。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，目的在于提供两种可产生tk1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种tk1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明公开了两种可产生tk1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1d3）和（2f6），其分别于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctccno:c2018106；于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏编号为cctccno:c2018105。保藏地址为：中国武汉武汉大学。
另一方面，本发明实施例还公开了采用上述两种杂交瘤细胞株产生的两种tk1特异性单克隆抗体。
第三方面，本发明实施例还公开了上述的杂交瘤细胞株的制备方法，其由纯化的真核重组表达的全长人tk1蛋白免疫小鼠后，小鼠脾脏b淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后培养、筛选得到。
进一步地，所述筛选采用间接elisa法和细胞克隆化。
第四方面，本发明实施例还公开了一种针对tk1的elisa检测方法，其以上述的1d3产生的单克隆抗体为捕获抗体，以2f6产生的单克隆抗体为检测抗体，建立标准的双抗体夹心elisa体系。
进一步地，该方法包括：
（1）采用hrp标记以2f6产生的tk1特异性单克隆抗体；
（2）以1d3产生的tk1特异性单克隆抗体作为捕获抗体，tk1校准品为测定对象，进行标本检测；
（3）制作校准曲线，根据校准曲线确定样本中的tk1含量。
第五方面，本发明实施例还公开了上述的杂交瘤细胞株、tk1特异性单克隆抗体在制备tk1免疫检测试剂中的应用。
第六方面，本发明实施例还公开了一种检测人tk1的试剂盒，其包括上述两种tk1特异性单克隆抗体。
本发明的有益效果是：
（1）本发明制备了能产生tk1特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株：构建人tk1真核表达质粒，在cho细胞中表达tk1；用纯化的tk1蛋白作为免疫原免疫balb/c小鼠，通过改良杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接elisa法进行筛选，克隆化筛选出能稳定分泌抗tk1单克隆抗体的杂交瘤细胞株；小鼠腹水诱生法生产单克隆抗体，进行抗体效价和特异性鉴定。
（2）建立tk1的elisa检测体系：利用已制备的tk1特异性单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，以tk1作为目标抗原，进行抗体配对试验，经过优化elisa反应条件，获得能检测tk1的抗体配对；以此为基础建立了检测tk1的双抗体夹心elisa方法。
（3）本发明通过杂交瘤技术，制备了杂交瘤细胞株1d3和2f6，分泌人tk1特异性单克隆抗体。两株抗体能进行配对和检测tk1蛋白，初步建立了检测人tk1的双抗体夹心elisa方法。
附图说明
图1为基于新制备的人tk1单克隆抗体建立的elisa方法检测重组tk1蛋白的校准曲线；
图2为基于新制备的人tk1单克隆抗体建立的elisa方法与市售的elisa检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(tk1)elisakit”（购自武汉华美生物）检测临床血清标本结果比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料和来源
实验动物：balb/c小鼠购自重庆医科大学实验动物中心（中国重庆）。
细胞培养基和胎牛血清购自gibco公司。
hrp-山羊抗小鼠igg购自北京中山公司。
纯化柱和填料购自美国ge公司。
其余试剂均为国产分析纯试剂。
实施例1人tk1蛋白的真核重组表达
（1）人tk1真核表达载体的构建
根据美国ncbi网站中提供的信息（nm_003258.4），编码人tk1蛋白的dna序列（5’—3’）如下（seqidno：1）：
atgagctgcattaacctgcccactgtgctgcctggctcccccagcaagacccgggggcagatccaggtgattctcgggccgatgttctcaggaaaaagcacagagttgatgagacgcgtccgtcgcttccagattgctcagtacaagtgcctggtgatcaagtatgccaaagacactcgctacagcagcagcttctgcacacatgaccggaacaccatggaggcactgcccgcctgcctgctccgagacgtggcccaggaggccctgggcgtggctgtcataggcatcgacgaggggcagtttttccctgacatcgtggagttctgcgaggccatggccaacgccgggaagaccgtaattgtggctgcactggatgggaccttccagaggaagccatttggggccatcctgaacctggtgccgctggccgagagcgtggtgaagctgacggcggtgtgcatggagtgcttccgggaagccgcctataccaagaggctcggcacagagaaggaggtcgaggtgattgggggagcagacaagtaccactccgtgtgtcggctctgctacttcaagaaggcctcaggccagcctgccgggccggacaacaaagagaactgcccagtgccaggaaagccaggggaagccgtggctgccaggaagctctttgccccacagcagattctgcaatgcagccctgccaactga（最后3个碱基为终止密码子）
设计并合成引物，在tk1的5’加上kozark序列（seqidno：2）：gccaccatgg和信号肽migκ序列（seqidno：3）：atggagtcagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac，在tk1的3’端终止密码子之前加上6×his标签的编码序列（seqidno：4）：catcatcatcatcatcat。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
从乳腺癌细胞株mcf-7（购自ntcc典型培养物保藏中心）中应用细胞总rna提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取总rna，常规进行反转录（rt试剂购自北京天根生化科技有限公司），以合成的人tk1pcr引物，常规进行pcr（试剂盒为invitrogen公司的pcdna™3.4-topo®tacloningkit，taq酶为invitrogrn公司的platinum™taqdnapolymerasehighfidelity），对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后回收（dna胶回收试剂盒购自购自北京天根生化科技有限公司）。
将回收的pcr产物亚克隆入真核表达载体pcdna3.4（试剂盒为invitrogen公司的pcdna™3.4-topo®tacloningkit）中（按照试剂盒说明书操作），挑取细菌克隆，常规培养，小量提取质粒（试剂盒购自北京天根生化科技有限公司），送上海英骏生物技术有限公司进行dna测序，正向测序引物和反向测序引物参见invitrogen公司的pcdna™3.4-topo®tacloningkit说明书。
选取测序结果正确的质粒pcdna3.4-tk1进行tk1的真核表达。插入载体pcdna3.4中的dna片段序列（5’—3’）（seqidno：5）为：
gccaccatggagtcagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacatgagctgcattaacctgcccactgtgctgcctggctcccccagcaagacccgggggcagatccaggtgattctcgggccgatgttctcaggaaaaagcacagagttgatgagacgcgtccgtcgcttccagattgctcagtacaagtgcctggtgatcaagtatgccaaagacactcgctacagcagcagcttctgcacacatgaccggaacaccatggaggcactgcccgcctgcctgctccgagacgtggcccaggaggccctgggcgtggctgtcataggcatcgacgaggggcagtttttccctgacatcgtggagttctgcgaggccatggccaacgccgggaagaccgtaattgtggctgcactggatgggaccttccagaggaagccatttggggccatcctgaacctggtgccgctggccgagagcgtggtgaagctgacggcggtgtgcatggagtgcttccgggaagccgcctataccaagaggctcggcacagagaaggaggtcgaggtgattgggggagcagacaagtaccactccgtgtgtcggctctgctacttcaagaaggcctcaggccagcctgccgggccggacaacaaagagaactgcccagtgccaggaaagccaggggaagccgtggctgccaggaagctctttgccccacagcagattctgcaatgcagccctgccaaccatcatcatcatcatcattga（5’端大写部分为kozark序列和信号肽编码序列，中间小写部分为人tk1的编码序列，3’端大写部分为6×his标签编码序列和终止密码子）。
质粒pcdna3.4-tk1所编码的成熟蛋白氨基酸序列（n端—c端，不含信号肽）（seqidno：6）为：
mscinlptvlpgspsktrgqiqvilgpmfsgkstelmrrvrrfqiaqykclvikyakdtrysssfcthdrntmealpacllrdvaqealgvavigidegqffpdivefceamanagktvivaaldgtfqrkpfgailnlvplaesvvkltavcmecfreaaytkrlgtekeveviggadkyhsvcrlcyfkkasgqpagpdnkencpvpgkpgeavaarklfapqqilqcspanhhhhhh（其中c端的6个h为6×his标签）
应用试剂盒invitrogen公司的purelink™hipureplasmidfp(filterandprecipitator)maxiprepkit，按照说明书操作，常规大量提取质粒pcdna3.4-tk1备用，确保制备的质粒产物无菌。
（2）人tk1的真核重组表达
应用高效真核表达系统expi293f™expressionsystemkit（购自lifetechology公司）进行人tk1的真核表达，按照说明书操作，简述如下：
使用70%乙醇常规清洁细胞冻存管后，于超净工作台中，快速融化细胞，将管中293f细胞全部转入容量为125ml的细胞培养瓶中，瓶中含有29ml预温的细胞培养基（试剂盒自带的expi293™expressionmedium）。
常规细胞计数和台盼蓝拒染法判断细胞的活率，要求细胞数在0.3×106/ml，细胞活率超过90%。
旋转培养细胞，条件为温度37℃，饱和湿度，co2浓度8%，水平旋转速度125r/m。
培养约3天，细胞数超过1×106/ml，用细胞培养基expi293™expressionmedium稀释，细胞密度约为0.4×106/ml，容积为125ml的锥形培养瓶，培养体积不超过50ml，培养条件同上，常规培养。
每3～4天，细胞密度达到4×106/ml，同上稀释细胞至约为0.4×106/ml，继续培养。
进行转染时，于容积为125ml的锥形细胞培养瓶中，加入细胞培养基expi293™expressionmedium25.5ml，加入状态良好的293f细胞总量7.5×107，细胞密度为2.9×106/ml；用试剂盒自带的低血清培养基（opti-mem®ireduced-serummedium）稀释30μg质粒pcdna3.4-tk1至1.5ml，混匀；用opti-mem®ireduced-serummedium培养基稀释81μl转染试剂（试剂盒自带的expifectamine™293reagent）至1.5ml，室温孵育5min；将稀释后的质粒和稀释后的转染试剂混合，混匀，室温孵育20min；将该混合物转入细胞培养瓶中，总体积为28.5ml；按照上述方法进行旋转培养。
培养20小时后，往细胞培养瓶中加入150μl增强剂1（试剂盒自带的expifectamine™293transfectionenhancer1）和1.5ml增强剂2（试剂盒自带的expifectamine™293transfectionenhancer2），总体积为30ml，按照上述方法常规培养。
培养10天，收集细胞，离心，收集细胞培养上清。
（3）人tk1的纯化
由于在重组表达的人tk1蛋白羧基端带有6×his标签，可以应用镍柱通过亲和层析纯化目标蛋白，操作过程简述如下：
含有重组表达tk1蛋白的细胞培养上清经0.45μm微孔滤膜过滤，收集滤液。
用his-bindingbuffer(20mmol/lsodiumphosphate，0.5mnacl，ph7.4，分析纯)按照1:9的比例稀释滤液。
稀释液上histraphp层析柱（gehealthcare），his-bindingbuffer平衡后用his-elutionbuffer(20mmol/lsodiumphosphate，0.5mnacl，0.5m咪唑ph7.4，分析纯)先10%b洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100%b将目的蛋白洗下。收集洗脱液。
通过sds-page加上考马斯亮蓝染色鉴定产品的纯度，用bca法（试剂购自碧云天生物）进行蛋白定量测定，sds-page法鉴定产品的纯度。
实施例2tk1特异性单克隆抗体的制备
(1)tk1单克隆抗体的制备
将纯化的tk1与等量的弗氏完全佐剂乳化，抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对4只8周龄左右的balb/c小鼠进行基础免疫（100μg/ml，每只小鼠200μl）。2周后，将tk1与等量的弗氏不完全佐剂乳化，以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫（100μg/ml，每只小鼠200μl）；2周后，再采用同样方式追加免疫一次，7天后处死小鼠取出小鼠脾脏，将脾细胞进行细胞融合。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞（sp2/0）以8:1混合，以聚乙二醇为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的hat培养液中，并置于6%co2中在37℃培养。
用间接elisa法进行筛选。筛选时，重组表达的人tk1为筛选原包被酶标板，封闭后加入各杂交瘤细胞培养上清，孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶（hrp）标记山羊抗小鼠igg（购自北京中山生物技术有限公司），孵育后洗涤，加入底物tab（购自北京中山生物技术有限公司）显色。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行细胞克隆化，并置于6%co2中于37℃培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止，即可进行杂交瘤细胞的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取已成年的balb/c小鼠，于腹腔内注入液体石蜡0.5ml，1周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4×105个/ml，每只balb/c小鼠腹腔注射0.5ml杂交瘤细胞。10～14天后收集腹水。
(2)tk1单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行纯化，具体方案简述如下。配制抗体纯化所需缓冲液（所用试剂均为分析纯）：结合缓冲液（a液)）20mmol/l磷酸钠，0.8mol/l(nh4)2so4，ph7.5；洗脱缓冲液（b液）20mmol/l磷酸钠，ph7.5；再生缓冲液（c液）20mmol/l磷酸钠，ph7.5，并按体积比30%加入异丙醇。在含有单克隆抗体的腹水中加入硫酸铵，使其终溶度与a液中硫酸铵的溶度一致，0.45μm滤膜过滤等待上样；选用hitrapiggpurificationhp柱（购自gehealthcare）接入aktaprime蛋白纯化仪，先后a、b液和c液对柱子进行充分洗涤；用a液进行充分平衡后，将准备的样品从a管上样，上样后用a液平衡柱子，去除杂蛋白，再用b液洗脱纯化柱，收集洗脱峰；调节洗脱蛋白的ph至7.0～8.0，将抗体分装冷冻于-20℃保存；用再生缓冲液对填料进行再生，然后用结合缓冲液进行平衡。
(3)elisa鉴定抗tk1单克隆抗体
将纯化的重组tk1抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/ml，酶标板每孔加入100μl，4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原，洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000......，按100μl/孔加入对应条孔中，另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h，洗板，加入1:3000hrp标记山羊抗小鼠igg（酶标二抗），按100μl/孔加入对应条孔中，37℃孵育40min。弃液，洗板，拍干，加入底物液100μl/孔，避光显色10min，加入终止液50μl/孔。在450nm处测定吸光度值。
（4）抗tk1单克隆抗体的免疫印迹鉴定
①将蛋白质分子量marker3μl、tk1抗原20μl、相关对照抗原20μl行sds-page。
②电泳结束后，取下凝胶，置于转印缓冲液中平衡10min。
③将0.22μmpvdf膜先用无水甲醇处理20s，再用ddh2o洗涤5min。然后再浸入transferbuffer超过5min。同时将滤纸浸入transferbuffer中。
④转膜：从下至上依次排列：滤纸—pvdf膜—胶—滤纸，排出气泡，放入转膜仪，18v恒压电转移1.5h。
⑤转膜完成后，在膜上可见清晰蛋白marker，ddh2o清洗两遍，tbst洗5min。将转移膜置于封闭液中，室温封闭2h。
⑥弃去封闭液，用1×tbst漂洗膜3次，每次15min。
⑦加入以1:1000稀释的纯化抗体，4℃孵育过夜。1×tbst漂洗膜3次，每次15min。
⑧加入已按照1:10000稀释的hrp-羊抗小鼠igg抗体，37℃孵育3h。
⑨1×tbst洗涤3次，每次15min。
⑩用化学发光显色，显影定影后，观察分析结果并摄像。在tk1对应分子量处可见tk1特异性单克隆抗体结合的清晰条带。
实施例3双抗体夹心elisa法检测tk1
（1）hrp标记抗体（所用试剂均为分析纯）
本法是以naio４先将hrp表面的糖分子氧化成醛基，然后再与抗体蛋白的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，具体步骤如下：
①hrp酶的准备：称取10mghrp酶，加2ml纯水配置为5mg/ml的hrp液体，按照每mghrp酶加入34µl计算，加340µlnaio4，4℃避光放置，1h后，按照每mghrp酶加入250µl的量加入乙二醇250µl，避光放置4℃，30min后转入透析袋中，用1mm醋酸缓冲液（ph4.0～4.4）透析过夜，期间至少换液2次，均要求避光。
②抗体的准备：0.01m的pbs缓冲液进行4℃透析过夜，并测定蛋白浓度。
③标记：抗体与hrp酶按1:1（质量比）混合，加入1mol/lna2co3缓冲液（1:80），调节反应的ph为9.5，25℃反应2～3h。
④终止：新鲜配制0.1mol/lnah4b（4mg/ml），按照每mghrp酶加入47μl。4℃放置2h后，转入透析袋。用0.01mol/lpbs缓冲液（ph7.0～7.2）透析过夜，期间至少换液两次，避光。
⑤分装保存：标记好的抗体用棕色ep管分装，并测定抗体效价。-20℃避光保存。
(2)抗体配对及校准曲线的制备
①抗体配对：选取单克隆抗体1d3作为捕获抗体，hrp标记单克隆抗体2f6作为检测抗体，tk1校准品为测定对象。
②包被酶标板：用包被液将抗体稀释为5μg/ml，每孔加100μl，4℃包被过夜。
③将包被过夜的酶标板洗3遍，甩干。
④封闭：每孔加封闭液350μl，37℃孵育1h，洗涤3遍，甩干。
⑤用抗体稀释液将tk1校准品从50μg/ml开始倍比稀释，每孔加100μl，第一孔为空白对照，做校准曲线。
⑥洗板3遍，甩干。
⑦将相对应的酶标二抗以1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃孵育30min。
⑧洗板5遍，甩干。
⑨每孔加入100μl底物显色液，室温避光显色5min。
⑩每孔加入50μl终止液，450nm处读取吸光度值，以重组tk1的浓度为横坐标，相应的450nm处吸光度为纵坐标，制作校准曲线（如图1所示）。
实施例4
采用本发明实施例新制备的人tk1单克隆抗体建立的elisa检测方法，与市售的elisa检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(tk1)elisakit”（购自武汉华美生物）检测临床收集血清标本并比较检测结果。
①标本收集：从重庆肿瘤医院收集临床血清标本，取回过程中用冰袋储存，以保持标本新鲜，离心取上清后做好标记分装于1.5mlep管中，-80℃保存，并将相关信息录入电脑，作好编号。
②按照实施例3所描述的方法建立elisa体系，并制备校准曲线。
③按照实施例3所描述的方法测定临床收集标本，每份血清标本添加100μl，根据校准曲线计算各标本中tk1的浓度。
④采用市售的elisa检测试剂盒“人可溶性胸苷激酶1(tk1)elisakit”（购自武汉华美生物）检测临床收集血清标本，按照说明书操作，计算各标本中tk1的浓度。
⑤以市售试剂盒的检测结果为横坐标（对照方法），新建方法检测结果为纵坐标（新建方法），制作散点图，比较两种方法的检测结果（图2，图中每个圆点代表一个标本，圆点所在的横坐标为对照方法的检测结果，圆点所在的纵坐标代表新建方法的检测结果）。
综上所述，本发明实施例以纯化真核重组表达的全长人tk1蛋白免疫balb/c小鼠，应用杂交瘤技术进行细胞融合，利用间接elisa法和细胞克隆化操作筛选出能稳定分泌人tk1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，收集腹水经hitrapiggpurificationhp亲和层析柱纯化，对所得的单克隆抗体进行效价测定和亲和力测定。经筛选得到2株稳定分泌tk1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株1d3和2f6，elisa和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
本发明实施例建立了针对tk1的elisa检测方法：以tk1特异性抗体1d3为捕获抗体，2f6为检测抗体，建立标准的双抗体夹心elisa体系，能够准确检测标本中的tk1，并以此成功建立了检测人tk1的双抗体夹心elisa方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110>重庆探生科技有限公司
<120>产生人胸苷激酶1（tk1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用
<141>2018-06-13
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
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