1.一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体的结构为scfv(x)-(y)cd3zeta-mn;
其中,x包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体;
y为共刺激受体的胞内区,所述共刺激受体选自icos、cd28、cd27、hvem、light、cd40l、4-1bb、ox40、dr3、gitr、cd30、tim1、slam、cd2、cd226;
m为gammachain家族细胞因子受体的胞内区,所述细胞因子受体选自il2ra、il2rb、il4ra、il7ra、il9ra、il15ra、il21ra;
n为il2rg胞内区。
2.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述x选自anti-cd19抗体、anti-cd20抗体、egfr抗体、her2抗体、egfrviii抗体、anti-psma抗体、anti-bcma抗体、anti-cd22抗体、anti-cd30抗体。
3.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述x为anti-cd20抗体,所述y为4-1bb胞内区,所述m选自il2rb胞内区、il4ra胞内区、il7ra胞内区、il9ra胞内区、il21ra胞内区中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述scfv(x)-(y)cd3zeta为scfv-antihcd20-20bbz,其序列如seqidno.1所示;所述il7ra胞内区的序列如seqidno.2所示;所述il2rb胞内区的序列如seqidno.3所示;所述il4ra胞内区的序列如seqidno.4所示;所述il9ra胞内区的序列如seqidno.5所示;所述il21ra胞内区的序列如seqidno.6所示;所述il2rg胞内区的序列如seqidno.7所示。
5.一种由如权利要求1~4中任一项所述的嵌合抗原受体的重组表达载体构建的car-t细胞。
6.一种如权利要求5所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一、慢病毒载体的构建及病毒生产;
将scfv(x)-(y)cd3zeta,m和n形成融合蛋白,两端加入慢病毒载体,并和慢病毒包装质粒共同转染,获得scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒;
步骤二、scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞的制备;
分离纯化后的人pbmc经过培养后,感染步骤一获得的scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒,在合适的条件下进行细胞扩增,制备scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞。
7.根据权利要求6所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,所述慢病毒载体的构建及病毒生产的具体步骤包括:
将scfv(x)-(y)cd3zeta,m和n通过overlappcr形成融合蛋白,两端加入酶切位点克隆慢病毒载体;将测序正确的克隆无内毒素大提,和慢病毒包装质粒共同转染,预定时间后收取上清,过滤、离心浓缩病毒,获得scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒。
8.根据权利要求6所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,所述scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞的制备的具体步骤包括:将人pbmc经过分离纯化后,接种到具有合适刺激条件的培养板,培养预定时间后,感染步骤一生产的scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒,按照合适的刺激条件进行细胞扩增,经过2轮刺激扩增后,获得的细胞即为scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞。
9.一种含有如权利要求5所述的car-t细胞的制剂。
10.如权利要求1~4中任一项所述的嵌合抗原受体,如权利要求5所述的car-t细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。