一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

文档序号:19538183发布日期:2019-12-27 16:08阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体的结构为scfv(x)-(y)cd3zeta-mn;

其中,x包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体;

y为共刺激受体的胞内区,所述共刺激受体选自icos、cd28、cd27、hvem、light、cd40l、4-1bb、ox40、dr3、gitr、cd30、tim1、slam、cd2、cd226;

m为gammachain家族细胞因子受体的胞内区,所述细胞因子受体选自il2ra、il2rb、il4ra、il7ra、il9ra、il15ra、il21ra;

n为il2rg胞内区。

2.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述x选自anti-cd19抗体、anti-cd20抗体、egfr抗体、her2抗体、egfrviii抗体、anti-psma抗体、anti-bcma抗体、anti-cd22抗体、anti-cd30抗体。

3.根据权利要求1所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述x为anti-cd20抗体,所述y为4-1bb胞内区,所述m选自il2rb胞内区、il4ra胞内区、il7ra胞内区、il9ra胞内区、il21ra胞内区中的一种。

4.根据权利要求3所述的一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,其特征在于,所述scfv(x)-(y)cd3zeta为scfv-antihcd20-20bbz,其序列如seqidno.1所示;所述il7ra胞内区的序列如seqidno.2所示;所述il2rb胞内区的序列如seqidno.3所示;所述il4ra胞内区的序列如seqidno.4所示;所述il9ra胞内区的序列如seqidno.5所示;所述il21ra胞内区的序列如seqidno.6所示;所述il2rg胞内区的序列如seqidno.7所示。

5.一种由如权利要求1~4中任一项所述的嵌合抗原受体的重组表达载体构建的car-t细胞。

6.一种如权利要求5所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

步骤一、慢病毒载体的构建及病毒生产;

将scfv(x)-(y)cd3zeta,m和n形成融合蛋白,两端加入慢病毒载体,并和慢病毒包装质粒共同转染,获得scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒;

步骤二、scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞的制备;

分离纯化后的人pbmc经过培养后,感染步骤一获得的scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒,在合适的条件下进行细胞扩增,制备scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞。

7.根据权利要求6所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,所述慢病毒载体的构建及病毒生产的具体步骤包括:

将scfv(x)-(y)cd3zeta,m和n通过overlappcr形成融合蛋白,两端加入酶切位点克隆慢病毒载体;将测序正确的克隆无内毒素大提,和慢病毒包装质粒共同转染,预定时间后收取上清,过滤、离心浓缩病毒,获得scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒。

8.根据权利要求6所述的car-t细胞的制备方法,其特征在于,所述scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞的制备的具体步骤包括:将人pbmc经过分离纯化后,接种到具有合适刺激条件的培养板,培养预定时间后,感染步骤一生产的scfv(x)-(y)cd3zeta-mn病毒,按照合适的刺激条件进行细胞扩增,经过2轮刺激扩增后,获得的细胞即为scfv(x)-(y)cd3zeta-mncar-t细胞。

9.一种含有如权利要求5所述的car-t细胞的制剂。

10.如权利要求1~4中任一项所述的嵌合抗原受体,如权利要求5所述的car-t细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。


技术总结
本发明涉及一种包含第三信号受体的嵌合抗原受体,该嵌合抗原受体的结构为scFv(X)‑(Y)CD3zeta‑MN;其中,X包括肿瘤靶向抗体或能与肿瘤特异结合的配体、受体;Y为共刺激受体的胞内区,所述共刺激受体选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4‑1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、CD226;M为gamma chain家族细胞因子受体的胞内区,所述细胞因子受体选自IL2Ra、IL2Rb、IL4Ra、IL7Ra、IL9Ra、IL15Ra、IL21Ra;N为IL2Rg胞内区。本发明还涉及一种由上述嵌合抗原受体的重组表达载体构建的CAR‑T细胞及其制备方法和应用。本发明所述的CAR‑T细胞显著提高了肿瘤杀伤能力和扩增能力,该CAR‑T细胞包含第三信号受体,具有潜在的增强效应的功能,且只对CAR‑T细胞有作用,降低了造成免疫副作用的风险。

技术研发人员:杨选明;傅阳心;汪鑫;叶圣勤;李民
受保护的技术使用者:上海隆耀生物科技有限公司
技术研发日:2018.06.20
技术公布日:2019.12.27
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