本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其 筛选方法与用途。
背景技术：
原发性肝癌是全世界范围内最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，因此，对 于肝癌治疗研究刻不容缓。临床治疗方案中，手术治疗虽然可根治肝癌，但仅 限于少部分患者，对于多数患者，因病灶较大或术后高复发率等因素，并不能 得到治愈。因此，化疗仍是主要治疗手段，但目前肝癌的化学治疗尚缺少有效 的治疗药物，以保障肝癌的化疗效果，迫切需要结合肝癌的发病机制研究进一 步开发新的治疗药物或方法。
肿瘤干细胞假说认为在肿瘤组织中存在一种数量较少的肿瘤干细胞，被认 为是肿瘤增殖、侵袭、转移及复发的根源。目前，在白血病、乳腺癌、肺癌、 脑肿瘤、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞。肝癌 中存在肿瘤干细胞与其难治、复发及耐药等特点密切相关，而这些特点也表明 了肝癌很可能也是一种肿瘤干细胞疾病，相关研究表明利用细胞表面分子分离 出的肝癌干细胞在复发、耐药等方面发挥着重要作用。
核酸适配体是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白 质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA/RNA)片段，其特异性如同抗体一样，对 可结合的配体有严格的识别能力和高度亲和力。然而研究显示，核酸适配体相 比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)而言，具有明显的优势，如制备简 单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、 亲和力高、特异性强及易于进行改造修饰等等。
因此，找出一种特异性针对肝癌的核酸适配体将其应用于肝癌的早期检测、 分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于：提供一种具有高度特异性且性能稳定的识别肝癌细胞 的核酸适配体及其筛选方法与用途，该适配体能够特异性识别肝癌PLC8024细 胞株及其衍生物。
一种识别肝癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。
本发明的有益效果在于：本发明的适配体具有高度特异性且性能稳定，该 适配体能够特异性识别肝癌PLC8024细胞株及其衍生物。
进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列为：
X-GGGGGATGGAGGGTGGGTCGTATAT-Y，其中，X和Y各自独立地为A、T、 C、G中的至少一个碱基或者X和Y中至少一个不存在。
进一步地，所述核酸适配体的两端中至少一端具有修饰基团。
进一步地，所述修饰基团包括但不限于氨基、羧基、巯基、荧光分子、生 物素、胆固醇或聚乙二醇基团。
进一步地，所述核酸适配体中具有碱基修饰。
进一步地，所述碱基修饰包括但不限于经硫代、氨代、锁核酸、氟代或甲 氧基修饰后。
本发明的有益效果在于：对所述核酸适配体的碱基进行修饰，使其具有较 未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性。
本发明还包括上述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：利用核酸适配 体体外筛选技术，以PLC8024肝癌细胞为正筛靶标，以肝脏永生化细胞LO2为 负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与肝癌细胞株特异结合的核酸 适配体。
进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包 括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin- ACGCTCTGACCACTGACCT；
S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成 后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛 选所得的核酸适配体一级文库；
S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵 育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞 特异性结合的正筛适配体组文库；
S4、负筛：将所述正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细 胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；
S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲 和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的核酸适配体。
进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：
S11、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：
ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包 括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin- ACGCTCTGACCACTGACCT；
S21、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成 后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛 选所得的核酸适配体一级文库；
S31、PCR扩增文库：将所述核酸适配体一级文库进行PCR扩增，得到扩 增产物；
S41、正筛：将所述步骤S31得到的扩增产物的上清与PLC8024细胞株孵 育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞 特异性结合的正筛适配体组文库；
S51、负筛：将所述步骤S41得到的正筛适配体组文库与肝脏永生化细胞 LO2细胞株孵育，孵育完成后收集上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的 负筛适配体组文库；
S61、核酸适配体循环筛选：重复步骤S11～S51至少一次，以扩增产物代替 随机文库，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升；
S71、测序鉴定：克隆测序所述步骤S61得到的适配体组文库，分别鉴定各 条序列的选择性和亲和力，最终得到带有如Seq ID No.1所示的特征序列的核酸 适配体。
本发明的有益效果在于：本发明方案采用体外筛选技术被称为指数富集的 配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX) 技术，筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力及特异性无免疫原 性，能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列 稳定，易于保存便于标记且二抗不需要标记。
本发明还包括上述核酸适配体在设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中的 用途。
进一步地，所述检测试剂包括但不限于酶联免疫反应、放射免疫测定和荧 光方法检测试剂。
本发明还包括一种靶向制剂，包括上述核酸适配体。
进一步地，所述靶向制剂还包括选自制药上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述载体选自纳米药物载体、肿瘤显影剂或染色分子中的任意 一种。
本发明还包括一种药物组合物，所述药物组合物包括上述核酸适配体，至 少一种抗肿瘤药物及制药上可接受的载体。
本发明的有益效果在于：采用本发明的核酸适配体进行肝癌细胞的检测时， 操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低， 周期短且重现性好；本发明的核酸适配体的特征序列可作为抗肝癌的分子探针 或药物靶点，将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床 价值。
附图说明
图1为本发明实施例适配体(左图)和对照适配体(右图)与PLC8024肝 癌细胞株的特异性结合图；
图2为本发明实施例适配体与肿瘤组织(左图)和癌旁组织的石蜡块(右 图)特异性结合图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合 实施方式并配合附图详予说明。
本发明实施例为：一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法，所述核 酸适配体的核苷酸序列包括AGGAGGTTAGGGGTGGGTGGGTGGT，其筛选方 法包括以下步骤：
1.初始DNA文库(即一级文库)准备：
设计合成两端含19个核苷酸(引物)，中间包括25个核苷酸随机序列的核 酸序列随机核酸文库及扩增引物，具体如下：
ACC TTG GCT GTC GTG TTG T(如Seq ID No.2所示)-25nt-A GGT CAG TGG TCA GAG CGT(如Seq ID No.3所示)
5'引物：ACC TTG GCT GTC GTG TTG T(如Seq ID No.4所示)
3'引物：ACG CTC TGA CCA CTG ACC T'(如Seq ID No.5所示)
2.靶细胞准备
2.1用台盼蓝染色实验确定肝癌细胞的活力，同时确定孵育用的细胞数目。
2.2文库与肝癌细胞孵育，筛选候选适配体。使用结合缓冲液溶解上述随机 核酸文库，结合缓冲溶液用DPBS缓冲液配制，含5mM氯化镁，4.5g/L葡萄糖， 0.1mg/mL酵母tRNA和1mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。 95℃恒温振荡5分钟，迅速放入冰中然后与已经培养和预处理好的PLC8024 细胞株在冰上孵育1小时。
2.3解离并洗脱结合的序列，孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用洗涤 缓冲液(所述洗涤缓冲液用DPBS缓冲液配制，含5mM氯化镁和4.5g/L葡萄糖) 洗涤孵育培养瓶中的细胞。用无DNase水刮取细胞沉淀，95℃加热细胞和DNA 混合物10min，加热变性分离结合在细胞表面的适配体，13000rpm离心5min， 收集上清即为筛选所得针对肝癌细胞的特异核酸适配体文库。
3.文库扩增：对文库进行PCR扩增，取100μL上述操作筛选所得的PLC8024 细胞特异结合的DNA适配体，第一轮筛选后需将全部所得的一细胞特异核酸适 体文库预扩增16个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。
4.将经PCR扩增得到的双链DNA酶解成单链DNA文库。
5.经过多轮正筛和负筛过程得到候选的适配体，其中，所述正筛过程的操 作步骤如下：将所述步骤扩增产物的上清与PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在 靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正 筛适配体组文库；
所述负筛过程的操作步骤如下：将上述正筛适配体组文库与肝脏永生化细 胞LO2细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细 胞特异性结合的适配体组文库。
6.完成筛选流程后，对终产物进行TOPO-TA扩增后测序，对测序结果进 行分析，得到一条高度富集的适配体：
5’-GGGGGATGGAGGGTGGGTCGTATAT-3’
7.适配体的特异性和临床意义的鉴定
7.1用原始DNA文库序列做阴性序列对照，合成带5’FAM荧光分子的适配 体和对照适配体。
7.2在200μL结合缓冲液中用250nM的带荧光适配体和对照文库与3×105个PLC8024细胞孵育4℃，1h。
7.3孵育完成后用500μL洗脱缓冲液洗3次，每次5min，最后用500μL洗 脱缓冲液重悬细胞沉淀，流式测定细胞荧光强度。
7.4荧光显微镜观察适配体结合特异性，1.5×105个细胞种于35mm培养皿， 生长24小时，用洗脱缓冲液洗脱残余培养基后，在1mL结合缓冲液溶解荧光标 记的适配体和对照文库使其最终浓度达到250nM，4℃，孵育1h后，观察结果 如图1所示，从图1中可以看出，本发明序列的核酸适配体与PLC8024细胞具 有极强的结合力，而对照适配体的结合力则较弱。
7.5免疫组化
取肝癌病人的肿瘤及癌旁组织的石蜡块，切片经二甲苯脱蜡后，用梯度酒 精(100％、95％、90％、80％和70％)水合处理，每个浓度处理5min，然后用 DPBS溶液洗涤5min后，用95℃的0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐溶液处理样 本20min以修复抗原，室温放置直至自然冷却。封闭液用结合缓冲液配制(添 加20％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，0.1mg/mL的硅鱼精DNA)常温封 闭1h，然后在200μL结合缓冲液中用250nM的FAM标记的适配体或对照文库 避光冰上孵育30min，荧光显微镜观察荧光发光情况，观察到的结果如图2所示， 通过观察发现本发明序列的适配体对肝癌组织具有良好的识别检测能力。
本发明中实验方法如无特殊说明均为常规方法，实验中所使用的材料如无 特殊说明，则为常规生化试剂商店购买所得；本发明所用PLC8024肝癌细胞来 源本实验所用所有细胞均来自华南肿瘤学国家重点实验室，其它细胞来源于 American Tissue Culture Collection。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运 用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 中山大学附属第五医院
<120> 一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途
<160> 5
<170> SIPO SequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggggatgga gggtgggtcg tatat 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accttggctg tcgtgttgt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aggtcagtgg tcagagcgt 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accttggctg tcgtgttgt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgctctgac cactgacct 19