一种用于鸭疫里默氏杆菌新型亚单位疫苗的重组质粒、构建、表达及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于鸭疫里默氏杆菌新型亚单位疫苗的重组质粒、构建、表达及应用。

背景技术：

鸭疫里默氏杆菌(riemerellaanatipestifer,ra)由rimer于1904年首次在患有渗出性败血症的病鹅中分离得到(riemer,1904)。随后该病呈世界性分布，国外许多学者对鸭疫里默氏杆菌进行了陆续报道。我国自1982年首次分离到此菌，随后成流行性分布(郭玉璞等，1982)。ra是一种革兰氏阴性小杆菌，无鞭毛，不形成芽孢但有荚膜，其可以感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类引发急性或慢性败血性疾病，其中3-4周龄雏鸭最易感(卡尔尼克等，1999)。该病发病率及死亡率达10％-30％，ra感染还可导致体重减轻、产蛋量下降等。目前，几乎所有集约化养鸭生产地区都有发现本病，给养禽业带来极大的经济损失(hingginsetal.,，2000；huangetal.,，2002；saifetal.,，2003)。ra血清型复杂，目前公认21个血清型(1-21型)。ra各血清型之间抗原结构存在较大差异，各血清型之间没有交叉保护性，不同血清型对异型强毒保护能力过低。目前，我国流行的ra血清型日趋复杂，不断有新的血清型出现，使得对该病的免疫变得复杂，因此亟需研制新型疫苗应对ra的感染。目前对于此类疾病，灭活苗、活苗和重组亚单位疫苗已在临床被广泛研究，然而由于机体对药物的快速清除等影响，使得疫苗中抗原结构发生变化并对机体缺乏较长的抗原刺激，从而在免疫保护效果方面受到一定影响。因此亟待研制具有有效抗原捕获速度及效率的疫苗。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于鸭疫里默氏杆菌新型亚单位疫苗的重组质粒、构建、表达及应用，解决了现有技术中存在的问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种用于鸭疫里默氏杆菌新型亚单位疫苗的ppicza-ompa-fc重组质粒，包括含氨苄青霉素筛选标签的ppicza表达质粒和ompa-fc基因；所述ompa-fc基因序列如seqidno：3；所述ompa-fc基因在含氨苄青霉素筛选标签的ppicza表达质粒的限制性酶切位点xholi和noti之间插入。

所述ompa-fc基因以ompa-linker和igyfc-linker为模板，经鸭疫里默氏杆菌ompa-linker上游引物primer1和鸭igyfc下游引物primer4进行soe-pcr扩增融合获得；

所述上游引物primer1序列如seqidno：4所示；所述下游引物primer4序列如seqidno：7所示。

所述ompa-linker由引物primer1和含linker连接子的引物primer2以鸭疫里默氏杆菌全基因组dna为模板pcr扩增ompa基因得到；所述igyfc-linker由含linker连接子的引物primer3和引物primer4以鸭脾脏cdna为模板进行igyfc段序列pcr扩增反应得到；

引物primer2的序列如seqidno：5所示；引物primer3的序列如seqidno：6所示。

所述linker连接子为柔性linker肽段连接子，所述连接子为10个氨基酸，所述连接子具有氨基酸序列自选的为：ggggsggggs。

所述表达质粒大小为3593bp。

上述重组质粒的构建方法，包括如下操作步骤：

(1)从ncbi中查找鸭疫里默氏杆菌标准株ompa(如seqidno：1)和鸭igyfc(如seqidno：2)核苷酸序列，与ppicza质粒谱图信息相比较，确定引物设计中引入ppicza质粒上携带的酶切位点为xhoi和noti；

(2)鸭疫里默氏杆菌ompa-linker的pcr扩增：以鸭疫里默氏杆菌sd01株dna为模板，利用含有linker连接子的引物进行pcr扩增，得到ompa-linker；

(3)鸭igyfc-linker的pcr扩增：提取成年鸭脾脏rna，反转录得到cdna，利用含有linker连接子的引物进行pcr扩增，得到鸭igyfc-linker；

(4)分别胶回收ompa-linker和fc-linker基因，以鸭疫里默氏杆菌ompa上游引物primer1和鸭igyfc下游引物primer4特异性引物进行soe-pcr扩增得到ompa-fc融合基因；

(5)将胶回收得到的融合基因ompa-fc，经过16℃过夜连接，经转化，质粒酶切及测序分别得到peasy-t-ompa-fc重组质粒；

(6)将双酶切peasy-t-ompa-fc重组质粒得到的ompa-fc基因胶回收，与用相同的限制性内切酶酶切的ppicza表达质粒于16℃过夜连接，经转化，酶切及测序得到正确的重组表达质粒，命名为：ppicza-ompa-fc。

鸭疫里默氏杆菌ompa的pcr扩增的体系为：ddh2o6μl、2×powertaqpcrmastermix10μl、上游引物primer11.0μl、下游引物primer21.0μl、模板dna2.0μl、总体积为20μl；其pcr反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为52.0℃，45s，延伸i条件为72.0℃，90s；延伸ii条件为72.0℃，10min；

鸭igyfc的pcr扩增的体系为：ddh2o6μl、2×powertaqpcrmastermix10μl、上游引物primer31.0μl、下游引物primer41.0μl、dntp2.0μl、一步法提取的mrna2.0μl、总体积20μl；pcr反应条件为：50.0℃，30min，94.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为94.0℃，30s，退火条件为58.0℃，45s，延伸i条件为72.0℃，90s；延伸ii条件为72.0℃，10min；

融合基因的pcr扩增的体系为：ddh2o4μl、2×powertaqpcrmastermix10μl、上游引物primer11.0μl、下游引物primer41.0μl、鸭疫里默氏杆菌ompa模板2.0μl、鸭igyfc模板2μl、总体积20μl；pcr反应条件为：95.0℃，5min的预变性，30个循环的变性、退火和延伸，其中，变性条件为95.0℃，30s，退火条件为52.0℃，45s，延伸i条件为72.0℃，90s；延伸ii条件为72.0℃，10min。

peasy-t-ompa-fc重组质粒的连接反应体系为：ompa-fc基因4μl，peasy-t质粒1μl，各组份混匀后，25℃水浴中连接30min；

双酶切peasy-t-ompa-fc反应体系：peasy-t-ompa-fc质粒1μg，noti酶0.5μl，xholi酶0.5μl，10×buffer2.0μl，灭菌超纯水补至20μl，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h；

ppicza-ompa-fc重组质粒的连接反应体系：10×反应缓冲液1.0μl，ompa-fc基因2.0μl，酶切后的ppicza质粒6.0μl，t4dna连接酶1.0μl，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；

双酶切ppicza-ompa-fc重组质粒的反应体系如下：ppicza-ompa-fc质粒1μg，noti酶0.5μl，xholi酶0.5μl，10×buffer2.0μl，灭菌超纯水补至20μl，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中2h。

一种融合蛋白的表达方法，将上述的ppicza-ompa-fc重组质粒转化毕赤酵母培养、诱导后收集菌体；破碎菌体细胞获得融合蛋白。

上述重组质粒在治疗雏鸭群鸭疫里默氏杆菌中的应用，将重组质粒ppicza-ompa-fc溶于水或者te缓冲液配成溶液，或用冷冻干燥法制成干粉。

一种疫苗，包含上述的重组质粒。

本发明的优益效果：

本发明带来的有益效果是：鸭igy结构与禽igy类似，但是氨基酸序列相似性仅有56.1％。本发明成功克隆鸭疫里默氏杆菌ompa及鸭igyfc，并将两种基因成功连接转化至含氨苄青霉素筛选标签的ppicza表达质粒，实现了ppicz-ompa-fc重组质粒在毕赤酵母表达系统的高效表达；该重组质粒在毕赤酵母表达系统表达的蛋白能在体液及细胞水平上抑制雏鸭鸭疫里默氏杆菌的增殖和迁移能力，并可促进雏鸭体内抗体的水平及延长免疫时间，其次可增强鸭体内巨噬细胞的吞噬能力；为雏鸭鸭疫里默氏杆菌的治疗提供新的治疗思路，推动养禽业的发展。

附图说明：

图1为鸭疫里默氏杆菌ompa-linker基因pcr反应结果显示图；

图1中m为dl1500marker，1泳道为鸭疫里默氏杆菌ompa-linkerdna，bp为碱基对单位，

图2为鸭igyfc–linker基因pcr反应结果显示图；

图2中m为dl2000marker，1-2泳道为鸭igyfcdna，bp为碱基对单位；

图3为ompa-fc融合基因pcr反应结果显示图；

图3中m为dl1500marker，1-2泳道为ompa-fcdna，bp为碱基对单位；

图4为鸭疫里默氏杆菌ompa基因pcr反应结果显示图；

图4中m为dl1500marker，1-3泳道为鸭疫里默氏杆菌ompa-linkerdna，bp为碱基对单位；

图5为peasy-t-ompa-fc重组质粒双酶切显示图；

图5中m为dl15000marker，1-2泳道为酶切后重组克隆质粒peasy-t-ompa-fc，3泳道为未融合质粒，bp为碱基对单位；

图6为peasy-t-ompa重组质粒双酶切显示图；

图6中m为dl15000marker，1-3泳道为酶切后重组克隆质粒peasy-t-ompa-fc，bp为碱基对单位；

图7为ppicza-ompa-fc重组质粒双酶切显示图；

图7中m为dl15000marker，1泳道为未双酶切后的重组表达质粒ppicza-ompa-fc，2泳道为双酶切后的重组表达质粒ppicza-ompa-fc,bp为碱基对单位；

图8为ppicza-ompa重组质粒双酶切显示图；

图8中m为dl15000marker，1泳道为未双酶切后的重组表达质粒ppicza-ompa，2-4泳道为双酶切后的重组表达质粒ppicza-ompa,bp为碱基对单位；

图9为swiss-model软件分析预测融合蛋白空间折叠状态显示图；

图10为ompa-fcsds-page显示图；

图10中m为blueplusproteinmarker，0泳道为空质粒阴性对照，1-4泳道分别为第24h、48h、72h、96h诱导后上清样，kda为蛋白质分子质量单位；

图11为ompasds-page显示图；

图11中m为blueplusproteinmarker，0泳道为空质粒阴性对照，1-4泳道分别为第24h、48h、72h、96h诱导后上清样，kda为蛋白质分子质量单位；

图12为蛋白纯化图；

图12中m为blueplusproteinmarker，0泳道为柱层析流出液，1-2泳道为纯化蛋白样品，kda为蛋白质分子质量单位；

图13为western-blotting显示图；

图13中m为blueplusproteinmarker，0泳道为对照，1泳道为蛋白样品，试验中一抗分别为大鼠抗omp及hrp标记羊抗小鼠igy，kda为蛋白质分子质量单位；

图14为动物保护性试验显示图；

图14中a为发病率，b为保护率；

图15为动物试验指标检测显示图；

图15中a为血清抗体效价，b为淋巴细胞转化率，c为il-2含量，d为il-4含量。

序列表信息：

seqidno：1：鸭疫里默氏杆菌ompa序列；

seqidno：2：鸭igyfc序列；

seqidno：3：融合ompa-fc基因序列；

seqidno：4：鸭疫里默氏杆菌ompa-linker上游引物primer1；

seqidno：5：鸭疫里默氏杆菌ompa-linker下游引物primer2；

seqidno：6：鸭igyfc上游引物primer3；

seqidno：7：鸭igyfc下游引物primer4；

seqidno：8：鸭疫里默氏杆菌ompa下游引物primer5。

具体实施方式：

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本发明进行详细阐述。

实施例1重组质粒ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa的构建

包括以下步骤：

1)从ncbi中查找鸭疫里默氏杆菌标准株ompa(seqidno:1)及鸭igyfc(seqidno:2)核苷酸序列，并与ppicza质粒谱图信息相比较，确定双酶切位点为xhoi和noti；

2)ppicza-ompa-fc重组质粒的构建

①鸭疫里默氏杆菌ompa-linker基因的pcr扩增

根据genbank公布的鸭疫里默氏杆菌ompa-linker设计如下引物：

primer1:5′-ccgctcgagatgggtaaagaatttatgttg-3′，短划线部分为xhoi酶切位点。如序列表seqidno：4所示。

primer2:5-tgaacctccacctcctgatccacctccaccttttcttttcttttttactacttt-3′，划线部分为linker小肽序列。如序列表seqidno：5所示。

以鸭疫里默氏杆菌sd01株dna为模板，用primer1和primer2作为引物对ompa-linker基因进行pcr扩增：

pcr反应条件为：

如图1所示:对回收的ompa-linker基因琼脂糖凝胶电泳得到一条1200bp的条带，与预期结果一致。

鸭igyfc-linker基因的pcr扩增：

根据genbank公布的鸭igyfc核苷酸序列设计如下引物：

primer3:5-atcaggaggtggaggttcaggctccggcgcccag-3′，划线部分为linker序列,如序列表seqidno：6所示。

primer4:5-ttgcggccgcctaatgatgatgatgatgatgtttaccgggggtcttctgga-3′，短划线部分为noti酶切位点，长划线部分为his标签，如序列表seqidno：7所示。

提取成年鸭脾脏rna，反转录得到cdna第一链，pcr扩增鸭igyfc-linker基因：

pcr反应条件为：

如图2所示：对igyfcpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条724bp大小的条带，与预期结果一致。

融合基因的pcr扩增：

分别胶回收ompa-linker及igyfc-linker基因，以primer1和primer4特异性引物进行soe-pcr扩增得到ompa-fc融合基因；

pcr反应条件为：

如图3所示：对融合基因的soe-pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条为1894bp大小的条带，与预期结果一致，经过基因测序鉴定，融合基因序列正确，如seqidno：3所示。

同时设不含鸭igyfc鸭疫里默氏杆菌ompa基因对照：

根据genbank公布的鸭疫里默氏杆菌ompa设计如下引物：

primer1:5′-ccgctcgagatgggtaaagaatttatgttg-3′，短划线部分为xhoi酶切位点,如序列表seqidno：4所示。

primer5:5-ttgcggccgcttaatgatgatgatgatgatgttttcttttcttttttactac-3′，短划线部分为noti酶切位点，长划线部分为his标签,如序列表seqidno：8所示。

以鸭疫里默氏杆菌sd01株dna为模板，用primer1和primer5作为引物对ompa-linker基因进行pcr扩增：

pcr反应条件为：

如图4所示：对融合基因的soe-pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳得到一条为1201bp大小的条带，与预期结果一致。经过基因测序鉴定，融合基因序列正确。

②将胶回收得到的融合基因，16℃过夜连接，经转化至dh5α，挑单菌落摇菌提质粒，酶切及测序得到peasy-t-ompa-fc、peasy-t-ompa重组质粒，具体操作如下：

感受态大肠杆菌制备：

(1)将dh5α菌种在所需lb琼脂平板上划线，37℃温箱中，正置30min后培养8-12h；

(2)挑取单个菌落，无菌接种于约4ml的lb液体培养基中，放置于37℃摇床，培养过夜；

(3)取过夜的菌液，以1:100的比例接种于100ml的lb液体培养基中，置于37℃摇床培养1.5-2h，转速为220r/min，培养菌液至半浑浊半透明状态(od600值约为0.4-0.6)；

(4)将菌体转至无菌的用冰预冷的50ml离心管中，在冰上静置10min；使菌液冷却至约0℃。

(5)4℃离心机上离心10min，转速为5000r/min，回收菌体沉淀。

(6)将离心管倒置1min，尽量倒出上清；

(7)用20ml预冷的0.1mol/l的cacl2溶液，重新悬浮细胞。

(8)在4℃离心机上5000r/min离心10min；

(9)倒出上清液，将离心管倒置1min，使最后的液体流出，收集沉淀；

(10)加入2ml提前预冷的0.1m的cacl2(含有15％的甘油)，用移液器轻轻悬浮细胞沉淀；

(11)为提高转化效率，在4℃放置18h后，再进行分装。分装200μl于每个冻存管中，放于-80℃冰箱中进行保存备用。

连接反应体系：ompa-fc/ompa基因4μl，peasy-t1质粒1μl，各组份混匀后，25℃水浴中连接30min；

peasy-t-ompa-fc/peasy-t-ompa质粒双酶切反应体系如下：peasy-t1-ompa-fc/peasy-t1-ompa/ppicza质粒1μg，noti酶0.5μl，xhoi酶0.5μl，10×buffer2.0μl，灭菌超纯水补至20μl，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中15min；

如图5所示：对重组质粒peasy-t-ompa-fc双酶切得到一条3928bp及一条1890bp大小的条带，说明成功构建克隆质粒。

如图6所示：对重组质粒peasy-t-ompa双酶切得到一条3928bp及一条1193bp大小的条带，说明成功构建克隆质粒

③将双酶切后重组质粒peasy-t-ompa-fc得到的ompa-fc融合基因胶回收，及双酶切后重组质粒peasy-t-ompa得到的ompa融合基因胶回收，分别与用相同限制性内切酶酶切的ppicza表达质粒于16℃过夜连接转化，对酶切及测序正确的质粒命名为：ppicza-ompa-fc、ppicza-ompa；

具体操作如下：

连接反应体系：10×反应缓冲液1.0μl，ompa-fc/ompa基因2.0μl，酶切后的ppicza质粒6.0μl，t4dna连接酶1.0μl，各组份混匀后，16℃水浴中连接过夜；

双酶切ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa反应体系如下：ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa质粒1μg，noti酶0.5μl，xholi酶0.5μl，10×buffer2.0μl，灭菌超纯水补至20μl，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中15min。

如图7、8所示：对ppicza-ompa-fc重组质粒双酶切得到一条3593bp及一条1890bp大小的条带，对重组质粒peasy-t-ompa双酶切得到一条3593bp及一条1193bp大小的条带，说明成功构建克隆质粒说明该融合基因成功连接到表达质粒中。

实施例2ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa质粒毕赤酵母表达及纯化：

1)ompa-fc/ompa融合蛋白在毕赤酵母的表达及鉴定

①将构建的ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa重组质粒及ppicza空质粒用sali内切酶酶切线性化并胶回收，去磷酸化处理后，酚/氯仿抽提回收，溶于te缓冲液中；用licl法将线性化回收后的质粒分别转化入毕赤酵母gs115株感受态细胞，涂布rdb平板，培养3-5d后鉴定。

licl法酵母转化步骤：

(1)将毕赤酵母gs115株接种到到5mlypd培养基中，30℃摇菌约18h；

(2)取上述菌液，按1:1000的比例接种到50mlypd培养基中，30℃摇菌约18h，培养到od值约为0.4-1.0之间；

(3)将上述菌液分装于1.5ml离心管中，13000r/min离心1min，弃去上清，用1ml无菌水洗涤1次，离心去上清，重复2次；

(4)每管加入1mlte/licl溶液，重悬菌体沉淀，室温放置30min，3000r/min离心5min，弃去上清；

(5)每管加入80μlte/licl溶液；

(6)将鲑鱼精dna水浴煮沸10min，煮完稍加离心迅速置于冰盒上；

(7)取一无菌离心管，依次加入10μl煮沸的鲑鱼精dna，10μl线性化的ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa重组质粒/ppicza空质粒，50μl毕赤酵母gs115株感受态细胞，轻轻混匀，室温孵育1h；

(8)将800μl50％的peg3350，100μlte，100μllicl混匀后加入到上述溶液中，继续孵育1h；

(9)42-44℃水浴热激15-30min；

(10)3000r/min离心3min，弃去上清；

(11)加入1mlypd培养基重悬菌体沉淀，30℃摇床上培养3h；

(12)3000r/min离心3min，弃去上清，100μlte重悬菌体；

(13)将上述菌液均匀涂布于rdb平板上，30℃恒温培养箱培养4-5d。

单酶切ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa/ppicza质粒反应体系如下：ppicza-ompa-fc/ppicza-ompa/ppicza质粒1μg，sali酶1μl,10×buffer2.5μl,灭菌超纯水补至20μl，各组份混匀后，将其置于37℃水浴中15min；

2)ompa–fc/ompa融合蛋白在毕赤酵母的表达

①在毕赤酵母中诱导表达ompa-fc/ompa融合蛋白

将筛选出的阳性重组子接种至20mlbmgy培养基中，30℃，250rpm震荡培养至od600＝2-6，离心收集菌体。若为阳性转化子，则加入等体积的bmmy培养基重悬，若为阴性转化子，则加入1/5体积的bmmy培养基重悬；30℃，250rpm震荡培养96h，每隔24h补加甲醇至1％，分别在0、12、24、36、48、60、72、84、96h取1ml培养基，离心去上清分析表达水平，以确定最佳收菌时间。

如图9所示：为融合蛋白ompa-fc及ompa三维空间结构同源建模结果，如图可见融合表达的ompa-fc由两部分组成(ompa及igyfc)，且两部分结构由一条柔性肽linker连接。

如图10、11所示：与对照组相比，在不同时间段取样泳道中分别得到一条约为65.7及43.5kda大小的条带，与预期结果一致。并且随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加，这符合毕赤酵母表达规律，因此该重组表达质粒可以在毕赤酵母表达系统中成功表达。

②ompa–fc/ompa融合蛋白表达产物的鉴定及纯化。

收集培养液，离心取上清，将上清液与sds上样缓冲液1:4混合后，煮沸10min，进行sds-page，每孔上样量为30μl。将sds-page的中蛋白分别转移至3片nc膜中，用0.5％的脱脂奶粉封闭3h,然后将已封闭的2片nc膜，分别浸入1：5000稀释的hrp-goat-anti-mouse-igy二抗(用pbst配制)中孵育1.5h，洗膜后用deb化学显色；第3片nc膜过夜封闭后，漂洗3次后直接浸入1:5000稀释的hrp-rabbit-anti-duck-igy二抗(用pbst配制)中孵育1.5h，洗膜后用deb化学显色。

如图12所示：对收获的ompa-fc蛋白进行纯化后，sds-page得到一条约为65.7kda大小的条带；ompa蛋白进行纯化后，sds-page得到一条约为43.5kda大小的条带，与上述结果一致，因此表明该融合蛋白经毕赤酵母成功表达后得到较好的纯化。

如图13所示：对纯化后的ompa-fc融合蛋白分别抗ompa一抗及兔抗鸭igy二抗进行鉴定，分别在目的条带处得到约为65.7kda大小的条带，表明经本表达系统表达的蛋白分别保留了鸭疫里默氏杆菌ompa及鸭igyfc的免疫原性。纯化后的ompa蛋白用抗ompa一抗进行鉴定，在目的条带处得到约为43.5kda大小的条带。

实施例3体内试验检测

1)疫苗制备

大量表达ompa-fc及ompa蛋白，分别采用分光光度计测定蛋白浓度，-80℃保存。ompa-fc与松花粉多糖按照相应的体积比混合后加入到组织捣碎机进行混匀，使最终的蛋白浓度为100μg/ml；多糖浓度选择50、100、200mg/ml。进行疫苗的稳定性和安全性试验。

2)免疫程序

将雏鸭分为4组，分别为ompa-fc-scp(50)组、ompa-fc-scp(100)组、ompa-fc-scp(200)组、纯化的ompa-fc组、纯化的ompa组及空白对照组。分别免疫三次，每次间隔一周。在免疫后的3、7、14、21、27、35、42、49d采血，备用。

免疫三次后一周，从每组中选取20只鸭放入一个新的隔离器，并用10ld50鸭疫里默氏杆菌的ll株鼻内攻毒。连续7d观察并记录临床表现。

发病率＝发病鸭的数量/总数×100％。

如图14所示：在感染鸭疫里默氏杆菌后，免疫重组鸭疫里默氏杆菌ompa疫苗有效增强机体免受该菌的感染几率，ompa-fc疫苗效果要由于单纯ompa疫苗组，其中100mg/ml及200mg/mlscp佐剂进一步增强机体对鸭疫里默氏杆菌的抵抗力，其中200mg/ml的scp效果最好。

3)指标检测

体液免疫的影响：利用间接elisa方法检测血清抗体效价。

细胞免疫的影响：mtt法检测淋巴细胞转化率，流式细胞仪检测t淋巴细胞cd4+,cd8+，il-2、il-4按照鸡il-2、il-4检测试剂盒进行。

cd4+淋巴细胞含量:

cd8+淋巴细胞含量:

如图15所示：结果表明，相比于重组鸭疫里默氏杆菌ompa疫苗，ompa-fc疫苗具有良好的免疫效果。值得注意的是scp作为佐剂显著提高机体抗体水平，il-2、il-4的分泌水平及淋巴细胞增殖及转化率。其中200mg/ml的scp佐剂效果优于50mg/ml及100mg/ml。

上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

<110>山东省农业科学院家禽研究所

<120>一种用于鸭疫里默氏杆菌新型亚单位疫苗的重组质粒、构建、表达及应

用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1164

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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