拟南芥剪接因子SR45a剪接体的编码基因在负调控植物盐胁迫应答中的应用的制作方法

文档序号：16016305发布日期：2018-11-20 21:34阅读：1028来源：国知局

本发明涉及拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体及其编码基因在负调控植物盐胁迫应答中的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

自然界中的植物在生长发育过程中会遭受到各种胁迫，主要分为生物胁迫和非生物胁迫，其中非生物胁迫作为范围最广的一类胁迫主要涵盖了各种环境胁迫，主要包括低温、高温、盐碱胁迫及干旱胁迫等；其中盐胁迫对植物生长的影响是非常严重的，全球大约有130亿hm²的陆地，其中30亿hm²为盐碱地。目前我国随着工业化的快速发展、有机化肥及农药的滥用等原因造成耕地的盐碱化日趋严重，而且对生产已构成较大威胁，如何提高植物的耐盐能力对我国经济农业的发展具有非常重要的意义。

盐胁迫主要是由于在土壤中存在高于植物正常水平所能耐受浓度的可溶性盐而形成的非生物胁迫。土壤中存在的许多盐离子都会对植物造成伤害，钠盐作为造成盐胁迫最主要的盐类，在植物应对盐胁迫的研究中最具代表性。土壤中高浓度的盐，如na⁺和cl^-会造成土壤中水势下降，从而导致植物水分缺失或者遭受渗透胁迫，进而导致植物自身一系列的生长发育过程受损，这其中主要包含以下几个方面：(1)造成植物生长发育迟缓，影响植物根、茎、叶等组织器官的正常发育；(2)抑制植物正常的光合作用，盐分通过减少植株的光合面积而造成植物碳同化量的减少，影响植株叶片中光合色素的合成；(3)抑制蛋白质及脂质的合成，盐胁迫条件下造成植株根部质膜中的脂类成分发生改变，降低植物对胁迫的耐受性；(4)影响植物体内抗氧化酶的活性及合成，植物体内sod、pod、cat活性受到盐胁迫的影响，使得植物体内清除活性氧的能力下降。针对盐胁迫对植物造成的影响，研究植物响应盐胁迫的分子机制是非常重要的，通过分子生物学技术获得耐盐性转基因植物进而推广到经济作物中。

植物在响应逆境胁迫的过程中，其自身基因会通过转录水平和翻译水平进行调控，而可变剪接就是在转录后水平上进行调控的一种方式。胁迫诱导的可变剪接深刻的影响与胁迫相关基因的表达及编码剪接体组分的基因的表达。在拟南芥中有61％的内含子含有基因经历可变剪接(marquezetal.2012)，而转录组测序数据分析发现非生物胁迫能够显著改变植物体内的可变剪接事件(filichkinetal.2010；thatcheretal.2016；zhangetal.2016；zhuetal.2017)。例如，盐胁迫能够使拟南芥中超过6000多个基因的可变剪接事件发生变化(fengetal.2015)；而高温胁迫能够改变葡萄中超过1000多个基因的可变剪接事件(jiangetal.2017)。研究发现这些非生物胁迫(盐胁迫、aba)能够促进基因的pre-mrna上非经典剪接位点的选择，这种剪接位点选择的改变可能通过促进转录组的多样性来应对胁迫，而且有研究已经证明了一些胁迫应答途径中的关键调控因子通过可变剪接产生功能性的和非功能性的转录本，两种转录本通过调节自身的比例来调节相关基因的表达以使植物响应胁迫。而基因转录后的可变剪接过程则主要是剪接复合体介导完成，剪接复合体主要由5种小核核糖核蛋白(snrnps)和非小核核糖核蛋白组成(konczetal.2012)，而非小核核糖核蛋白中的sr蛋白和sr-like蛋白家族作为剪接调控因子则主要保证了剪接复合体的正确装配和剪接位点的正确识别。剪接调控因子除了在可变剪接过程中发挥重要作用外，越来越多的证据表明这些剪接调控因子在植物响应胁迫过程中也发挥着非常重要的作用。剪接因子缺陷突变体sr34b中irt1基因的可变剪接存在缺陷从而减少了sr34b对cd胁迫的抗性(zhangetal.2014)；剪接因子rs40和rs41的缺失突变体表现出aba和盐胁迫的超敏性，而且在rs40、rs41中很多胁迫相关基因的可变剪接发生变化，由此猜测rs40、rs41参与调控了非生物胁迫条件下基因的可变剪接(chenetal.2013)；snw/ski互作蛋白skip与剪接调控因子sr45相互作用通过调节相关基因5’和3’剪接位点的识别或者剪接进而调节相关基因的可变剪接，使植物响应胁迫应答(wangetal.2012)。在拟南芥中有的剪接因子本身也存在可变剪接，受胁迫诱导后自身的可变剪接发生改变进而影响自身发挥正常的可变剪接功能，改变下游靶基因的可变剪接。例如sr45中sr45两种剪接体sr45.1和sr45.2二者的比例明显低于野生型中二者的比例，而且这种差别在葡萄糖存在的情况下显著增强，研究还发现sr45调控肌醇多磷酸酶5ptase13基因的可变剪接，5ptase13能够结合并调节aba正调因子snrk1的稳定性，因此sr45又参与调控了aba信号途径，最终结果证明sr45能够通过抑制葡萄糖诱导的aba积累来负调糖信号通路(carvalhoetal.2016)。

sr45a是植物中特有的一种剪接因子，其属于sr-like蛋白家族成员(tanabeetal.2007)。拟南芥中含有19种类型的sr蛋白家族(lopatoetal.1996；golovkinandreddy1998；golovkinandreddy1999；lopatoetal.2002；lorkovicandbarta2002；alietal.2003；tillemansetal.2005)，sr蛋白家族成员都具有一个或两个rna识别基序(rrm)位于n端，而在c端则含有一个富含丝氨酸/精氨酸(s/r)重复序列的rs结构域(zuoandmanley1994；manleyandtacke1996；graveley2001；reddy2004)，在rna剪接体的组装和选择性剪接过程中具有重要的作用(manleyandtacke1996；valcarcelandgreen1996)。绝大多数的sr蛋白是生存的必需因子，通过其rs结构域和特有的其他结构域，实现与前体mrna的特异性序列或其他剪接因子的相互作用，协同完成剪接位点的正确选择或促进剪接体的形成(graveleyandmaniatis1998)，而sr蛋白是植株应对环境条件的关键调节剂。在哺乳动物中sr蛋白一般具有三点特征：(1)能被单克隆抗体mab104识别；(2)都共有两种结构特点：含有一个或者更多的rna识别基序(rrm)；含有一个c端rsdomain；大多数蛋白在rna剪接、装配及代谢中发挥重要作用。而sr-like蛋白一般具有两种特征区别于sr蛋白：(1)一般缺少sr蛋白中的一些结构特点，比如不被mab104识别、缺少特定的rrm结构域；(2)虽含有rsdomain，但是这个domain不仅富集丝氨酸/精氨酸(s/r)，也常富集着精氨酸/谷氨酸(r/e)、天冬氨酸/精氨酸(d/r)二肽结构(fu1995；neugebaueretal.1995；manleyandtacke1996；blencoweetal.1999)。拟南芥中sr45a作为一种典型的sr-like蛋白(tanabeetal.2007)，其在n端和c端各含有一个rs结构域且中间被rrm结构域分隔开，根据tair上记载其含有6种剪接体(atsr45a-1a-e和atsr45a-2)，其中atsr45a-1b-e这四种剪接体缺乏c端的rs结构域(tanabeetal.2007)(tanabeetal.2009)。有报道已经证明了sr45a作为剪接复合体的一个重要组分通过分别与剪接复合体核心因子u2af³⁵b、u1-70k相互作用，进而影响pre-mrna的剪接效率(tanabeetal.2009)。而sr蛋白在植物响应逆境胁迫过程中同样发挥着非常重要的作用。sr蛋白响应胁迫过程中即可通过影响基因剪接位点的选择来调节基因的表达，自身又可通过可变剪接产生多种剪接体发挥相应的功能调控目的基因的可变剪接。

目前，有研究发现sr45a受高光胁迫的诱导，通过调控相关基因的可变剪接参与高光胁迫应答过程(yoshimuraetal.2011)。而且研究发现sr45a在aba缺陷突变体中aba2-1中表达量明显上调，而且在sr45a上游含有aba应答元件，推测sr45a很有可能参与调控aba信号通路(cruzetal.2014)。而对于sr45a响应盐胁迫应答至今是缺少研究的，而且对于盐胁迫和可变剪接之间的联系这方面的研究还是比较少的；因此通过研究sr45a响应盐胁迫过程，将可变剪接与盐胁迫联系起来，弥补这方面研究的空缺是非常重要的。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了拟南芥剪接因子sr45a的四种剪接体、及其编码基因的一种新用途——在负调控植物盐胁迫应答中的应用，本发明还提供了其表达载体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

拟南芥剪接因子sr45a的四种剪接体的编码基因：at1g07350.1，at1g07350.2，at1g07350.3，at1g07350.4，其核苷酸序列依次如seqidno.1、2、3、4所示。

拟南芥剪接因子sr45a的四种剪接体，其氨基酸序列依次如seqidno.5、6、7、8所示。

拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体的编码基因、拟南芥剪接因子sr45a的四种剪接体在负调控植物盐胁迫应答中的应用，在制备/培育具有抗盐性能的植物中的应用。本发明通过研究发现，在盐胁迫条件下，拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体超表达株系幼苗的萌发速率均慢于野生型，而且成苗期与野生型相比表现出营养体大的表型，而且盐胁迫处理后表现出对盐胁迫超敏性。本发明为农作物尤其是耐盐性育种提供基因与技术的支持。

一种植物表达载体，其含有上述拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体的编码基因中的至少一种。优选的，所述植物表达载体所用的质粒为pbi121。

一种遗传工程化的宿主细胞，其含有上述植物表达载体，或其基因组中插入了拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体的编码基因中的至少一种。

所述遗传工程化的宿主细胞的构建方法为常规技术手段，将植物表达载体导入宿主细胞(可以通过农杆菌介导、ti质粒、植物病毒载体、微注射、基因枪等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合，使其整合到拟南芥基因组中，通过繁殖获得纯合的转基因超表达株系)，使植物表达载体/拟南芥剪接因子sr45a四种剪接体的编码基因中的至少一种在宿主细胞中有效表达。

上述植物表达载体、遗传工程化的宿主细胞在制备/培育具有抗盐性能的植物中的应用中的应用。所述植物包括拟南芥。

本发明首先通过基因芯片技术结合rt-pcr筛选可变剪接受到盐胁迫调控的基因，发现sr45a的可变剪接响应盐胁迫。本发明通过合成拟南芥cdna，提取拟南芥总rna，反转录得到第一条链cdna，以拟南芥cdna为模板，根据sr45a四种剪接体编码基因序列设计引物(seqidno.9、10所示)，进行pcr扩增，回收和纯化pcr扩增产物，并测序。得到拟南芥sr45a四种剪接体的编码基因。本发明将sr45a四种剪接体的核苷酸序列在拟南芥中过量表达，结果表明四种剪接体的转基因株系表达量均高于野生型。通过观察sr45a四种剪接体超表达株系幼苗在盐胁迫条件下的生长情况，发现四种剪接体的超表达株系其萌发速率均慢于野生型，而且成苗期与野生型相比表现出营养体大的表型，而且盐胁迫处理后表现出对盐胁迫超敏性。本发明为农作物尤其是耐盐性育种提供基因与技术的支持。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：扩增sr45a四种剪接体编码基因的pcr产物电泳图。

图2：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、200mmnacl1/2ms培养基上的萌发情况(培养7天)，其中，a：正常1/2ms培养基；b：200mmnacl1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图3：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、200mmnacl1/2ms培养基上萌发的统计情况(培养7天)，其中，a：正常1/2ms培养基；b：200mmnacl1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图4：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、300mm甘露醇1/2ms培养基上的萌发情况(培养10天)，其中，a：正常1/2ms培养基；b：200mmnacl1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图5：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥种子在正常1/2ms培养基、300mm甘露醇1/2ms培养基上萌发的统计情况(培养10天)，其中，a：正常1/2ms培养基；b：200mmnacl1/2ms培养基。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图6：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥两周大成苗经200mmnacl处理后存活率的比较照片，其中，a：浇盐水前；b：浇盐水后。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图7：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥两周大成苗经200mmnacl处理后存活率的比较，其中，a：浇盐水前；b：浇盐水后。wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图8：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥成苗营养体大小比较，其中，wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

图9：sr45a四种剪接体超表达株系种子与野生型拟南芥成苗营养体鲜重统计，其中，wt代表野生型拟南芥种子，as1、as2、as3、as4分别代表sr45a四种剪接体超表达株系。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

生物材料来源：

哥伦比亚型拟南芥来自于本实验室长期保存的种子。

大肠杆菌(e.coli)top10购自transgenbiotech公司。

载体pbi121购自clontech公司。

试剂来源：

克隆载体peasy-bluntsimplecloning试剂盒购自北京全式金生物(transgenbiotech)技术有限公司。

dna凝胶回收试剂盒购自美国omegabio-tek公司。

质粒提取试剂盒、trizol试剂(9109)、反转录试剂盒(rr047a)、dnamarkerdl2502+2504购自上海捷瑞(generay)生物工程有限公司。

evodna聚合酶购自南京诺唯赞(vazyme)生物科技有限公司。

t4dna连接酶购自赛默飞世尔(thermofisher)科技有限公司。

设备说明：

琼脂糖凝胶电泳使用uvpgeldoc-it凝胶分析系统，购自美国uvp公司。

pcr反应使用1124310193labcycler基因扩增仪，购自德国sensoquestgmbh公司。

琼脂糖凝胶电泳使用dyy-60型电泳仪，购自北京市六一仪器厂。

实施例1:拟南芥剪接因子sr45a四种剪接因子编码基因as1、as2、as3、as4的克隆

(1)拟南芥幼苗cdna的合成：提取拟南芥幼苗总rna，反转录得到第一条链cdna；

(2)sr45a四种剪接因子as1、as2、as3、as4基因的pcr扩增：以拟南芥幼苗cdna为模板，根据sr45a四种剪接因子的基因序列设计引物，进行pcr扩增，回收和纯化相应大小的pcr扩增产物，并测序。引物为

as正向引物:5’-ggatccatggggaaacgtgaaattca-3’(seqidno.9)。

as反向引物：5’-gtcgactagagactgttatgggctga-3’(seqidno.10)。

pcr反应体系和扩增条件如表1。

表1

pcr程序设定为:95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min，16℃保存。

回收和纯化pcr扩增产物的具体操作如下：凝胶电泳(如图1所示)后，将符合目的基因条带大小的目的片段分别切下来，放到离心管中，用胶回收试剂盒回收含有目的基因的凝胶。

实施例2：拟南芥剪接因子sr45a四种剪接因子编码基因as1、as2、as3、as4超表达载体的构建及转基因植株的获得

(1)将胶回收后的目的片段用peasy-bluntsimplecloning试剂盒连接克隆载体并转进大肠杆菌top10感受态细胞中，连接体系如表2。

表2

25℃连接10min，连接完成后将连接产物转入50μltop10中，冰浴30min，加入1ml培养基lb(-)后，将转入连接产物的感受态top10放置37℃摇床中，培养1h30min；随后将培养后的菌体离心7000rpm1min收集，涂至含有相应抗性的固体培养基上，将含有克隆连接产物菌体的固体培养基放入37℃培养箱中倒置培养12h。

(2)次日观察过夜培养的培养基上长出菌斑，挑取过夜培养的选择性lb培养基上的12个不同的单菌落，用目的片段引物进行pcr扩增以检测目的片段是否成功连接到克隆载体。pcr扩增体系如表3。

表3

pcr程序设定为:94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃后延伸5min，16℃保存。pcr产物进行凝胶电泳，观察电泳结果，选取条带清晰且无杂带的菌液进行摇菌，放置37℃摇床过夜培养。

(3)次日，在超净台中，将37℃摇床中培养的菌，用移液器吸出一部分按相应的比例，用无菌甘油保存，置于-80℃冰箱长期保存；随后分别吸出约100μl菌液置于新的离心管中，用于测序。将用于测序的菌样按要求填写“客户送样登计表”,送至青岛生工生物公司测序；剩余的摇菌管中的菌样用质粒提取试剂盒提取质粒。提取完质粒后，用相应的限制性内切酶酶切质粒，酶切后进行凝胶电泳，观察电泳结果，酶切有目的条带大小的质粒就为成功连上克隆载体的质粒。

(4)将酶切后的目的条带用胶回收试剂盒回收，回收后的产物连接表达载体，并转入大肠杆菌top10感受态细胞中，连接体系如表4。

表4

22℃连接60min，连接完成后将连接产物转入50μltop10中，冰浴30min，加入1ml培养基lb(-)后，将转入连接产物的感受态top10放置37℃摇床中，培养1h30min；随后将培养后的菌体离心7000rpm1min收集，涂至选择性lb固体培养基上，将含有克隆连接产物菌体的固体培养基放入37℃培养箱中倒置培养12h。次日观察过夜培养的培养基上长出菌斑，挑取过夜培养的lb培养基上的12个不同的单菌落，用目的片段引物进行pcr扩增以检测目的片段是否成功连接到表达载体。pcr产物进行凝胶电泳，观察电泳结果，选取条带清晰且无杂带的菌液进行摇菌，放置37℃摇床过夜培养。次日，在超净台中，将37℃摇床中培养的菌，用移液器吸出一部分按相应的比例，用无菌甘油保存，置于-80℃冰箱长期保存；剩余的摇菌管中的菌样用质粒提取试剂盒提取质粒。提取完质粒后，用相应的限制性内切酶酶切质粒，酶切后进行凝胶电泳，观察电泳结果，酶切有目的条带大小的质粒就为成功连上表达载体的质粒。

(5)将1μg(200ng/μl)目的质粒加入到50μl感受态农杆菌中，混匀后在冰上放置30min，放入液氮冷冻1min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中5min，随后冰上放置2min，加入1mllb液体培养基，28℃摇床培养3h，最后将菌液收集涂至选择性平板培养基上，28℃倒置培养48h。

(6)挑取转化得到的阳性单克隆农杆菌菌落到5ml选择性lb液体培养基中，在28℃摇床过夜培养，待菌液od＝0.5时终止。将上述农杆菌菌液在7000rmp下离心5min，弃去上清后，用100ml5％蔗糖和0.5％silwetl-77混合溶液重悬沉淀，得到农杆菌转化溶液；将拟南芥开花的花序浸入农杆菌转化溶液中，静置12s，用黑色塑料袋包裹处理过的植株，避光24h，然后除去塑料袋，在正常条件下培养至成熟，收获种子。在含相应载体抗性的1/2ms培养基上筛选获得t1代转基因阳性苗，t1代材料进一步自交，通过t2代抗性分离比可以确定是否为单拷贝插入，在t3代则获取纯合的转基因株系。获得4个超表达株系，分别命名为as1、as2、as3、as4，分别对应sr45a的四种剪接体。

实施例3：sr45a四种剪接体超表达株系表达量检测及幼苗期盐胁迫表型鉴定

(1)超表达株系表达量检测：

将筛到的sr45a四种纯合的剪接体超表达株系种子撒到1/2ms培养基上培养7天，随后取材提取rna，rt-pcr检测表达量，挑选表达量高的株系进行接下来的表型实验。

(2)超表达株系幼苗期盐胁迫表型鉴定：

将sr45a四种剪接体的超表达株系及同时期的拟南芥野生型种子点于200mm氯化钠1/2ms培养基和1/2ms(-)培养基上，并做多个重复组，将点好种子的培养皿封好膜用黑色塑料袋装起来置于4℃冰箱层积3天。层积后拿出培养皿置于22℃光照培养箱，观察并统计200mm氯化钠1/2ms培养基和1/2ms(-)培养基上种子的萌发速率及萌发后子叶展开情况；见图2、图3，正常条件下sr45a四种剪接体超表达株系种子的萌发速率及萌发后子叶展开情况与wt相比没有差异，而在200mm氯化钠1/2ms培养基上sr45a四种剪接体超表达株系种子的萌发速率及子叶展开速率均慢于wt。这些结果说明sr45a负调控了植物的盐胁迫应答过程。

(3)超表达株系幼苗期盐胁迫表型原因鉴定：

为了进一步分析sr45a的四种剪接体超表达株系幼苗期盐敏感表型是由于渗透胁迫引起的还是离子毒害引起的，所以又分别观察统计了sr45a四种剪接体的超表达株系及同时期的拟南芥野生型种子在12mmlicl和300mmman的1/2ms培养基上的萌发速率；见图4、图5，12mmlicl1/2ms培养基上sr45a四种剪接体超表达株系种子的萌发速率及萌发后子叶展开情况与wt相比并无差异，而在300mmman的1/2ms培养基上sr45a四种剪接体超表达株系种子的萌发速率要慢于wt。这些结果说明sr45a四种剪切体的超表达株系在种子萌发期高盐胁迫敏感是由于渗透胁迫引起的。

实施例4：sr45a四种剪接体超表达株系成苗期盐胁迫表型鉴定及营养体鲜重测定

(1)超表达株系成苗期盐胁迫表型鉴定：

将sr45a四种剪接体超表达株系和拟南芥野生型种子撒于1/2ms平板培养基上，4℃冰箱黑暗层积3天。3天后拿出培养皿置于22℃光照培养箱中培养，待幼苗长到6天后，将sr45a四种剪接体超表达株系与wt同时移至盛有基质的黑框中，移8盆。待10天后，先将每盆幼苗拍照记录，随后浇含有200mmnacl的盐水，每三天浇一次盐水，共浇三次。见图6、图7，浇盐水前，sr45a四种剪接体超表达株系营养体明显大于野生型wt；盐胁迫处理后，与wt相比sr45a四种剪接体超表达株系明显黄化表现出盐胁迫超敏表型，这说明sr45a在成苗期也参与到了盐胁迫调控过程。

(2)超表达株系成苗期营养体表型鉴定：

将sr45a四种剪接体超表达株系和拟南芥野生型种子撒于1/2ms平板培养基上，4℃冰箱黑暗层积3天。3天后拿出培养皿置于22℃光照培养箱中培养，待幼苗长到6天后，将sr45a四种剪接体超表达株系与wt同时移至盛有基质的黑钵中，每种剪接体超表达株系与wt对半移到一盆基质中，各移两组重复各种60棵。待植株长到10天后，拍照记录；随后剪去莲座叶称取鲜重，每20棵为一个重复，做3个重复组。见图8、图9，sr45a四种剪接体超表达株系营养体明显大于野生型wt，且鲜重明显高于wt。这些结果说明sr45a的四种剪接体也参与调控了植株的生长发育过程。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110>山东农业大学

<120>拟南芥剪接因子sr45a剪接体的编码基因在负调控植物盐胁迫应答中的应用

<141>2018-06-28

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1149

<212>dna

<213>arabidopsisthaliana

<400>1

atggggaaacgtgaaattcattttactccggtgggtcgtcaggtgcagagagttctggaa60

tatccattgcgcttggagaatcgttcgccgatgtcttactcaagaaggtcaagatactct120

ccttcactatctccttatgacaagcgtcgtggaaggtctgtgtcaaggtcattgtctaga180

agcccgacgaggagtgtctcaagcgatgctgagaatcctggtaacagtttatatgtaact240

ggattgtctcaccgggttactgaaagagatctggaggatcatttcgctaaagaaggaaag300

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atctctatgaaaagtgttggtgatgctaaccgttgcatcagatctctagatcactctgtt420

ctgcagggccgcgtcatcactgttgagaaggcaagacgtcgtagaggacgtactccaact480

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