本发明属于作物病原菌检测技术领域，具体涉及一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法。
背景技术：
猕猴桃细菌性溃疡病(kiwifruitbacterialcanker)是猕猴桃生产上的一种毁灭性细菌性病害，现被列为全国森林植物检疫对象。近年来，随着猕猴桃栽培面积迅速扩大，猕猴桃细菌性溃疡病传播范围也逐渐增大。先后在湖南、安徽、陕西、四川、重庆等地发现了此病，流行年份致使全园濒于毁灭，造成了巨大的经济损失。猕猴桃溃疡病是一种由丁香假单孢杆菌猕猴桃致病种(pseudomonassyringaepv.actinidae,psa)侵染引起，病害发生始期一般处于植株休眠期，2～3月在猕猴桃萌芽前进入发病高峰，主要危害主干、主枝和侧枝，4～5月新叶长出后，病菌可转移侵染叶片，5月后随着气温的升高，发病减轻。
鉴于猕猴桃细菌性溃疡病传播迅速，因此，在田间开展病菌致病力测定风险较大。目前有关猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力检测方法多见于采用新生的猕猴桃离体叶片针刺喷菌液接种法及表皮微量菌液注射接种法，但采用此种方法存在以下问题：接种伤口处的菌液量少，保湿条件下的猕猴桃叶片在离体后2天易失绿萎黄，健康程度远不及活体植株叶片，对病菌致病力测定的真实性有明显影响，而采用猕猴桃枝干伤口喷菌法，因取材不便捷、不统一，发病时间及接种效果不稳定，因此，较少用于不同菌株间的致病力测定和评价。
猕猴桃属落叶植物，该病害发生高峰期往往是植株落叶休眠期至萌芽期，新叶尚未长出，分离到的菌株无法及时在猕猴桃叶片上开展致病力检测。因此，寻找一种有效的、简便的猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的快速检测方法用于病菌致病力评价及该病害的防治研究具有重要的意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，能够随时快速检测。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，包括如下步骤：
1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；
2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。
优选的，所述步骤1)中猕猴桃细菌性溃疡病病菌菌悬液的浓度为5～10×108cfu/ml，猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的接种量为30～40μl/孔。
优选的，所述步骤1)小孔的直径为4～6mm。
优选的，所述步骤2)中测量叶肉组织变褐色部位直径的方法为十字交叉法。
优选的，每一株猕猴桃细菌性溃疡病菌接种3颗番茄植株，每颗番茄植株至少接种4个小孔。
优选的，所述步骤1)中番茄植株叶片为番茄植株中上部，叶龄为20～30d的健康叶片。
优选的，所述步骤1)中猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的制备方法包括如下步骤：
a.将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌种在蛋白胨酵母粉培养基的平板上划线，在25～28℃条件下黑暗培养72～96h，得到扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌；
b.将所述步骤a的扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌与无菌水混合，得到猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液。
优选的，所述步骤a中蛋白胨酵母粉培养基每1000ml包括以下组分：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂粉17g，加水定容至1000ml，ph值为7.0～7.2。
优选的，所述步骤a中猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株在平板划线前进行活化。
优选的，所述活化的方式为：将猕猴桃细菌性溃疡病菌接种到牛肉浸膏蛋白胨培养液中，在150～180rpm，25～28℃温条件下振荡培养72～96h；所述牛肉浸膏蛋白胨培养液包括以下组分：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g、加水定容至1000ml，ph值为7.0～7.2。
本发明提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌致病力的检测方法，本发明利用菌悬液作为接种物，避免了培养基营养成份的干扰，同时利用菌悬液对番茄叶片的附着性，结合活体植株番茄叶片针刺伤口加菌悬液液滴覆盖伤口法，人工接种后3天，在番茄叶片上便能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，在田间猕猴桃叶片及茎干不易获得的条件下，利用番茄叶片症状与猕猴桃叶片症状相似的特点，来测定病菌的致病力，番茄一年四季均可种植，来源方便，病菌接种番茄叶片后具有发病时间快、病症清楚。可随时满足新分离病菌及不同保存时间病菌的致病力快速检测需求，具有较好的适用性。
附图说明
图1为用于接种的番茄叶片；
图2为针刺伤口上覆盖的病菌菌悬液液滴；
图3为不同病菌在番茄叶片上接种4天后的病症表现，其中图3-a为psafj02，图3-b为psafj04，图3-c为psafj08，图3-d为无菌水；
图4为不同株的病菌菌株在猕猴桃叶片上接种4天后的病症表现，其中图4-a为psafj02，图4-b为psafj04，图4-c为psafj08，图4-d为无菌水；
图5不同培养基培养的病菌接种番茄叶片3天后的病症表现，其中图5-a为psafj02在6种不同培养基的表现，图5-a中从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养；图5-b为psafj07在6种不同培养基的表现，从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养；
图6为接种到不同植株叶片后的病症表现，其中图6-a为采用1、2、3、4、5和6号培养基培养的psafj02在番茄叶片上的表现，图6-b为采用1、2、4号培养基培养的psafj02在猕猴桃叶片上的表现。
具体实施方式
本发明提供了一种猕猴桃细菌性溃疡病菌致病力的检测方法，包括如下步骤：
1)在番茄植株的叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在所述小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种病菌的番茄植株；
2)将所述步骤1)中接种病菌的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75～90％的条件下生长3～4天后，在所述小孔周围测量叶肉组织变褐色部位的直径，依据褐色部位的直径判断致病力，当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。
本发明在番茄植株叶片上沿叶脉两侧各刺1个小孔，在小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种后的番茄植株。本发明中，所述番茄植株叶片优选为番茄植株中上部的叶片，更优选为番茄植株中部的叶片。所述番茄植株叶片的叶龄优选为20～30d的健康叶片，更优选为25d的健康叶片。本发明对所述番茄植株的品种、来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中采用帝皇红樱桃，60d以上生育期，有6轮以上分枝，叶龄20～30d的番茄植株作为试验番茄植株，具体图1所示。本发明中，所述小孔的直径优选为4～6mm，更优选为5mm。所述刺小孔的工具优选为无菌针。本发明中，每一株猕猴桃细菌性溃疡病菌优选接种3颗番茄植株，每颗番茄植株至少接种4个叶片，每个叶片接2个小孔。
所述猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的接种量优选为30～40μl/孔，更优选为35μl/孔。将菌悬液接种到小孔上的结果如附图2所示。由附图2可以看出，菌悬液可以完全覆盖刺破的小孔伤口。本发明中，采用菌悬液作为接种物，避免了培养基营养成份的干扰，同时菌悬液接种到小孔中，菌悬液液滴对伤口进行了覆盖，避免了其他杂菌对伤口的污染。
本发明中，所述猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的浓度优选为5～10×108cfu/ml，更优选为9×108cfu/ml。
本发明中，所述猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液的制备方法优选包括如下步骤：
a.将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株在蛋白胨酵母粉培养基的平板上划线，在25～28℃条件下黑暗培养72～96h，得到扩增后的猕猴桃细菌性溃疡病菌；
b.将所述步骤a的扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌与无菌水混合，得到猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液。
本发明优选将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株在蛋白胨酵母粉培养基的平板上划线，在25～28℃条件下黑暗培养72～96h，得到扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌。本发明中，所述猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株在平板划线前优选进行活化。所述活化的方式优选为：将猕猴桃细菌性溃疡病菌接种到牛肉浸膏蛋白胨培养液中，在150～180rpm，25～28℃温条件下振荡培养72～96h；所述牛肉浸膏蛋白胨培养液包括以下组分：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g、加水定容至1000ml，ph值为7.0～7.2。所述接种量优选为0.4％～1％，更优选为0.8％。本发明中，所述蛋白胨酵母粉培养基每1000ml包括以下组分：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂粉17g，加水定容至1000ml，ph值为7.0～7.2。本发明中，所述蛋白胨酵母粉培养基中，蛋白胨酵母粉为病菌生长提供基本碳氮营养，氯化钠有助于病菌产毒物质的产生，进而利于植株感染，便于观察致病能力，。本发明中，所述黑暗培养的温度优选为27℃。所述黑暗培养的时间优为78～90h，更优选为84h。
得到接种后的番茄植株后，本发明将所述接种后的番茄植株在20～30℃，相对湿度在75～90％的条件下生长3～4天后，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小，依据病部大小确定致病力。本发明中，优选将接种后的番茄植株在25℃，相对湿度在80％的条件下生长3.5天后，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小。本发明中，所述测量叶肉组织变褐色部位大小的方法优选为十字交叉法。本发明中，当叶肉组织变褐色部位越大，表明致病力越强。当褐色部位的直径≤1.00mm，为弱致病力菌株；当1mm<褐色部位的直径≤2.50mm，为中等致病力菌株；当2.5mm<褐色部位的直径，为强致病力菌株。
本发明中，将菌悬液接种到番茄植株的叶片上，人工接种后3天，在番茄叶片上便能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似。番茄一年四季均可种植，来源方便，病菌接种番茄叶片后具有发病时间快、病症清楚等特点，在田间猕猴桃叶片及茎干不易获得的条件下，采用本发明提供的方法可随时满足新分离病菌及不同时间保存病菌的致病力快速检测需求，具有较好的适用性。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在福建地区，采用常规的病组织分离法及猕猴桃细菌性溃疡病菌特异性分子检测方法(参照文献[youngjinkoh,illsupnou.dnamarkersforidentificationofpseudomonassyringaepv.actinidiae.mol.cells,2002,13(2):309-314]的方法进行特异性分子检测)，单菌落得到菌落表现为淡乳白色，菌株编号分别为psafj01、psafj02、psafj03、psafj04、psafj05、psafj06、psafj07、psafj08猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株。
其中常规的病组织分离法：切取大小约1～2cm的猕猴桃枝干病样病部组织块，病组织块用无菌水清冼2～3次，75％乙醇消毒30s～60s，0.1％升汞消毒2～3min，再用无菌水清冼2～3次。取消毒好的病组织3～5块，加入无菌水0.5～1ml，用无菌手术刀切碎，静置3～5min，使枝干病部组织内部的病菌释放至无菌水中，用无菌接种环沾取细菌菌悬液在牛肉浸膏蛋白胨培养基平板上划线后，于25℃培养箱中黑暗条件下培养72h，再用无菌接种环从培养基平板长出的目标细菌的单菌落中沾取少量菌浓，用200μl无菌水稀释后，涂布于牛肉浸膏蛋白胨培养基平板，培养72h后，获得目标细菌单菌落并进行相应的编号。
在福建地区，采用同样的方法在病组织中分离过程中得到一株菌落表现为鲜黄色的杂菌，经猕猴桃细菌性溃疡病菌特异性分子检测，表现为阴性，视为非病原菌，菌株编号npsafj01。
实施例2
将实施例1得到的猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株用牛肉浸膏蛋白胨培养液活化后，将活化后的猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株psafj01、psafj02、psafj03、psafj04、psafj05、psafj06、psafj07、psafj08和非病原菌npsafj01在蛋白胨酵母粉培养基上平板划线，在25℃条件下黑暗培养96h，得到扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌psafj01、psafj02、psafj03、psafj04、psafj05、psafj06、psafj07、psafj08和非病原菌npsafj01，将得到的扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌与无菌水混合，使猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液浓度为6×108cfu/ml。
在番茄植株叶片上沿叶脉左右两侧各刺1个小孔，在小孔中接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种后的番茄植株。将接种后的番茄植株在23±2℃，85±5％的条件下生长4天后，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小，依据病部大小确定致病力。
同理，将实施例1得到的猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株psafj01、psafj02、psafj03、psafj04、psafj05、psafj06、psafj07、psafj08和非病原菌npsafj01采用上述方法接种到番茄植株叶片和猕猴桃植株叶片上，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小，依据病部大小确定致病力。
同时，将无菌水采用上述方法接种到番茄植株叶片和猕猴桃植株叶片上，作为对照，具体结果如表1所示。
表1不同猕猴桃细菌性溃疡病菌在番茄叶片上和猕猴桃叶片上的致病力测定
注：各菌株在番茄叶片上的病斑直径和猕猴桃叶片上的病斑直径相关性分析：相关系数r＝0.9527，p＝0.0001。致病力评价标准：病斑直径≤1.00mm，视为弱致病力菌株，1mm<病斑直径≤2.50mm，视为中等致病力菌株，2.5mm<病斑直径，视为强致病力菌株。
由表1可以看出，本发明提供的将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液接种到番茄植株上进行检测致病力的方法，与在猕猴桃植株上的相关系数高，试验结果表明：将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液接种到番茄植株上，能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，具有较好的适用性。
同时，观察病菌psafj02、psafj04、psafj08和无菌水组分别接种在番茄叶片和猕猴桃叶片上4天后的病症表现，具体结果如图3和4所示。由图3和4可以看出，将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液接种到番茄植株上，能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，具有较好的适用性。
实施例3
将实施例1得到的活化后猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株psafj02、psafj05、psafj07、psafj08在蛋白胨酵母粉培养基上平板划线，在28℃条件下黑暗培养72h，得到扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌psafj02、psafj05、psafj07、psafj08，将得到的扩大培养后的猕猴桃细菌性溃疡病菌与无菌水混合，使得到猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液浓度为9×108cfu/ml。
取3株番茄，在每株番茄植株中上部的叶片上沿叶脉两侧各刺1个0.4mm的小孔，每株刺4个小孔，每孔接种量为30μl。在小孔上接种猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液，得到接种后的番茄植株。将接种后的番茄植株在28±2℃，相对湿度在80±5％的条件下生长4天后，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小，依据病部大小确定致病力。
同理，将实施例1得到的猕猴桃细菌性溃疡病菌菌株psafj02、psafj05、psafj07、psafj08采用上述方法接种到猕猴桃植株叶片上，在接种点周围测量叶肉组织变褐色部位大小，依据病部大小确定致病力。
同时，将无菌水采用上述方法接种到番茄植株叶片和猕猴桃植株叶片上，作为对照，具体结果如表2所示。
表2不同猕猴桃细菌性溃疡病菌在番茄叶片上和猕猴桃叶片上的致病力测定
注：各菌株在番茄叶片上的病斑直径和猕猴桃叶片上的病斑直径相关性分析：相关系数r＝0.9972，p＝0.0001。
由表2可以看出，本发明提供的将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液接种到番茄植株上进行检测致病力的方法，与在猕猴桃植株上的相关系数高，试验结果表明：将猕猴桃细菌性溃疡病菌菌悬液接种到番茄植株上，能产生明显的病症，症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，病菌接种番茄叶片后具有发病时间快、病症清楚，具有较好的适用性。
实施例4
将实施例1分离得到的猕猴桃细菌性溃疡病菌psafj07、psafj05、psafj02分别在6个不同培养基平板上划线后，置于28℃培养箱中黑暗培养72h，然后刮取各培养基平板上的菌浓，用无菌水将菌浓配成浓度约为5×108cfu/ml菌悬液用于病菌的接种。在温棚内选取番茄叶片(番茄品种为帝皇红樱桃，60d以上生育期，有6轮以上分枝，叶龄20～30d)进行接种，其余方法与实施例3完全相同。接种3天后测量不同培养基培养的菌株在番茄叶片针刺接种点周围的病斑直径，具体结果如表4所示。其中供试的6种培养基为：
1号培养基配方组成：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g、琼脂粉17.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
2号培养基配方组成(本发明提供的培养基)：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂粉17.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
3号培养基配方组成：蛋白胨20g、甘油10g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁.七水1.5g、琼脂粉17.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
4号培养基配方组成：胰蛋白胨10.0g、酵母浸膏5.0g、氯化钠5.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
5号培养基配方组成：蛋白胨5.0g、蔗糖3.0g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁.七水0.25g、琼脂粉17.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
6号培养基配方组成：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨7.5g、蔗糖10.0g、酵母提取物1.0g、琼脂粉17.0g、水1000ml，ph值为7.0～7.2。
表4不同培养基对病菌在番茄叶片上致病力的影响
由表4可以看出，在番茄叶片上，psafj02、psafj07、psafj05菌株用本发明提供的培养基(2*号)培养后产生的病斑直径最大，用其余5个培养基培养的病菌，产生的病斑较小，平均病斑直径均低于1.25mm，实验结果表明：本发明提供的培养基能显著提高病菌的致病力。将分别在1～6号培养基培养后的菌株psafj02和psafj07再分别接种到番茄叶片上，接种3天后观测番茄叶片的病症表现(其中图5-a为psafj02在6种不同培养基的表现，图5-a中从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养；图5-b为psafj07在6种不同培养基的表现，从左到右分别依次为采用1、2、3、4、5和6号培养基进行培养)。具体结果如附图5所示。由附图5可以看出本发明提供的培养基能明显区分出不同菌株的致病力大小。
实施例5
将实施例5分别在6种培养基中培养后制备得到的6中猕猴桃细菌性溃疡病菌psafj02的菌悬液分别接种到番茄和猕猴桃的叶片上，具体方法与实施例4完全相同，观察不同培养基培养的病菌在番茄和猕猴桃上的致病力，具体结果如表5所示。
表5不同培养基培养的病菌psafj02在番茄和猕猴桃叶片上致病力的比较
由表5可以看出，在番茄和猕猴桃两种作物叶片上，供试的psafj02菌株均以用本发明提供的培养基培养的产生的病斑直径最大，用4号培养基培养产生病斑直径次之，用其余培养基上培养的病菌，产生的病斑直径均较。实验结果表明：本发明提供的培养基培养病菌能显著提高病菌在番茄和猕猴桃叶片上致病力，病菌在番茄叶片上接种产生的病斑与在猕猴桃叶片上接种产生的病斑症状相似。
将采用1、2、3、4、5和6号培养基培养的psafj02分别接种到番茄叶片上，同时将采用1、2、4号培养基培养的psafj02分别接种到猕猴桃叶片上，3天后观察不同植株的病症表现。具体结果如附图6所示(图6-a为采用1、2、3、4、5和6号培养基培养的psafj02在番茄叶片上的表现，图6-b为采用1、2、4号培养基培养的psafj02在猕猴桃叶片上的表现)。由附图6可以看出在番茄叶片上接种菌悬液症状与猕猴桃寄主叶片病斑症状相似，具有较好的适用性。
本发明对所述猕猴桃细菌性溃疡病菌的菌株没有特殊限定，所有猕猴桃细菌性溃疡病菌均能采用上述检测方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。