本发明属于植物基因工程领域,涉及一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf2a的应用。
背景技术
裂荚性状是影响大豆产量的重要农艺性状，因为荚在收获之前开裂会影响大豆的产量。本实验室许光莉(2014)和王婷婷(2016)分别对219份栽培大豆材料构建的自然群体进行大豆裂荚表型鉴定(2012，2013，2014和2015年4年数据)，利用覆盖全基因组的1142个snp分子标记和205对ssr分子标记采用q+k混合模型进行了大豆全基因组扫描(p<0.01)进行大豆裂荚性状-标记的关联分析。2012年检测到1个snp位点与大豆裂荚性状相关联，2013年检测到14个snps位点与大豆裂荚性状相关联，2014年检测到10个snps位点与大豆裂荚性状相关联，2015年检测到6个标记与大豆裂荚性状相关联。其中3年(2012，2014和2015)重复定位到2号染色体上的1个snp位点(barc-020045-04420)与大豆裂荚性状相关联，我们搜索了这个标记前后130kb(自然群体的ld衰减值)范围内的基因，发现有个基因glyma02g302400属于e3泛素连接酶家族，含有ring-finger结构域。在此我们将这个基因命名为gmrnf2a，对其功能进行初步研究。
植物中许多关键的生化过程，如形态发生、抗虫抗病等生物胁迫、盐碱等非生物胁迫、自交不亲和性、激素合成和信号传导、光形态建成及花的生长发育等都涉及蛋白的降解过程。作为e3泛素连接酶家族中数量较多的一个亚类，ringe3s广泛的参与了植物的很多重要的生物学过程。ringe3s在多方面影响植物的生长发育过程。tanaka等(2011)发现水稻中cop1的同源蛋白pps通过抑制rap1b的表达水平，调控营养期到生殖期之间的转变。许多ringe3s通过参与aba途径来调节植物对干旱和盐胁迫的抗性。拟南芥sdir1受到干旱和盐胁迫的诱导表达。zhang等(2007)发现干旱条件下sdir1在气孔保卫细胞和叶肉细胞中高表达，过表达提高了植株的气孔关闭程度及耐旱性。许多ringe3s参与了植物的抗病反应。basnayake等(2011)发现拟南芥的dal1/dal2编码ring-hc类e3泛素连接酶，受到pseudomonassyrinagpv.tomato(pst)dc3000侵染或者fusariummoniliforme分泌的毒素伏马菌素b1(fb1)渗透后诱导表达。
尽管e3泛素连接酶数目众多，但是不同的e3泛素连接酶在生物功能上发挥的作用不完全相同，因而，新的e3泛素连接酶基因的功能仍需进一步的实验验证。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供公开一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf2a在裂荚性状方面的影响基因工程应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
大豆gmrnf2a蛋白编码基因gmrnf2a在提高转基因拟南芥的千粒重中的应用；所述的大豆gmrnf2a蛋白编码基因gmrnf2a，其核苷酸序列为：seqidno.1。
含有大豆gmrnf2a蛋白编码基因gmrnf2a的重组表达载体在提高转基因拟南芥的千粒重中的应用；所述的大豆gmrnf2a蛋白编码基因gmrnf2a，其核苷酸序列为：seqidno.1。
使用gmrnf2a构建植物表达载体时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的选择性标记基因(gus基因、gfp基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
携带有本发明gmrnf2a的植物表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物,也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
有益效果:
本发明中gmrnf2a属于e3泛素连接酶类的ring家族，含有ring-finger结构域。通过组织表达分析发现gmrnf2a在各个器官都有表达，亚细胞定位显示gmrnf2a蛋白主要定位于细胞质中。利用植物过量表达载体pmdc83-gmrnf2a,将本发明的gmrnf2a导入植物体内,可以调控植株千粒重，获得转基因植株。拟南芥中异源表达gmrnf2a，发现与对照相比，千粒重显著提高。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1gmrnf2a基因的克隆
根据phytozome网站预测的gmrnf2a序列信息设计引物，以willmas82盛花期的花cdna为模板pcr扩增，得到一条长1056bp的dna片段。经过测序结果分析，该片段的序列信息与phytozome网站预测的序列一致，即该片段即为gmrnf2a基因。其中marker为2kplus，从下往上依次为100，250，500，750，1000，2000，3000和5000bp。
图2gmrnf1a基因的组织表达分析。
采用实时荧光定量pcr技术对gmrnf2a在大豆willmas82的不同组织表达进行研究，大豆不同组织从左至右分别为根、茎、叶、花、7d荚、15d荚、25d荚、35d荚、45d荚、种子。
图3gmrnf2a的亚细胞定位
(a)d35s::gfp；(b)d35s::gmrnf2a-gfp；
图4转基因拟南芥的pcr鉴定。
1-5为不同的转基因株系；wt为野生型拟南芥(阴性对照)；p：为pmdc83-gmrnf2a重组质粒(阳性对照)。
图5gmrnf2a在不同转基因拟南芥株系中的相对表达量
02-2，02-4，02-5为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。
图6转基因拟南芥千粒重与氨基酸统计分析
02-2，02-4，02-5为不同的转基因株系，wt为野生型拟南芥。*表示0.01<p<0.05水平下显著差异；**表示p<0.01水平下极显著差异。
图7转基因株系02-2，02-4，02-5的各组分氨基酸含量分析
具体实施方式
下面结合附图和实施例,并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物,均在首次出现时标明,其后所用相同引物,均以首次标明的内容相同。
实施例1大豆gmrnf2a及其编码基因的克隆与鉴定
根据phytozome网站预测的gmrnf2a序列信息设计引物，以willmas82盛花期的花cdna为模板进行pcr扩增。
上游引物gmrnf2a-f：ggatcttccagagatcacaaagaggcaaaaagagaaca；(seqidno.3)
下游引物gmrnf2a-r：ctgccgttcgacgatgctatttctacctctataatcc。(seqidno.4)
应用rt-pcr方法，从大豆花器官总rna中扩增gmrnf2a基因。取大豆花组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mlep管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mlep管中，采用植物总rna提取试剂盒(tiangendp404)进行总rna提取。用甲醛变性胶电泳鉴定总rna质量，然后在分光光度计上测定rna含量。以获得的总rna为模板,按照takara公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cdna第一链。进行pcr扩增反应。pcr反应体系为:2μlcdna(0.05μg)、上、下游引物各2μl(10μm)、25μl2×phantamaxbuffer、1μldntp(10mm)和1uphantamaxsuper-fidelitydna聚合酶(vazyme),用超纯水补足50μl。pcr程序如下：在bio-radptc200型pcr仪上进行,其程序为94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s,共32个循环；然后72℃延伸5min终止反应，4℃保存。pcr产物回收将其克隆至pgem-teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆基因gmrnf2a的cdna序列seqidno.1，全长1014bp，编码seqidno.2所示的337个氨基酸。
实施例2gmrnf2a在大豆不同器官中的表达特征
提取willmas82根、茎、叶、花、7d荚、15d荚、25d荚、35d荚、45d荚、种子的rna，反转成cdna进行rt-pcr分析。
总rna的提取同实施例1。以大豆组成型表达基因tubulin为内参基因，其扩增引物为tubulin正向引物序列:ggagttcacagaggcagag(seqidno.5)，tubulin反向引物序列:cacttacgcatcacatagca(seqidno.6)。以来自大豆不同组织或器官的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr分析。gmrnf2a的扩增引物为:gmrnf2a-qpcr-f:tcctcggctacaacatgaacat(seqidno.7),gmrnf2a-qpcr-r:tctaacttggctccagcttctt(seqidno.8)。结果(图2)分析表明gmrnf2a检测的这几个组织中均有表达，并且相对表达量之间差异并不是很大，说明gmrnf2a有可能是一个组成型表达的基因。
实施例3gmrnf2a的亚细胞定位
亚细胞定位采用拟南芥原生质体瞬时表达的方法，使用的载体是pan580，引物为gmrnf2a-an-f:aagtccggagctagctctagatgaattctaggtgcttcct(seqidno.9)，gmrnf2a-an-r:gcccttgctcaccatggatcctaatccttgtttgcaaatagggc(seqidno.10)。pcr扩增，目的条带正确后进行割胶回收，胶回收产物通过同源重组的方法连接到载体上，构建亚细胞定位载体pan580-gmrnf2a(基因在gfp的n端)，拟南芥原生质体瞬时表达后暗培养16h，经激光共聚焦显微镜(zeiss，lsm780)激光照射后，可产生绿色荧光信号，对蛋白质进行定位，观察拍照。结果如图所示，转入空载质粒在整个细胞中都有分布，gmrnf2a：gfp融合蛋白也分布于整个细胞中，表明gmrnf2a没有明确的细胞器定位，也没有与叶绿体自发红色荧光融合，表明gmrnf2a可能在细胞质中发挥功能。
实施例4gmrnf2a的基因工程
利用gateway方法构建载体，分为bp反应和lr反应两步，引物序列为：f:ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatgaattctaggtgcttcct(seqidno.11)r:ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctataatccttgtttgcaaatagggc(seqidno.12)
bp反应将目的片段连接到入门克隆载体pdonor221上，lr反应将入门载体上的基因连接到表达载体pmdc83中，即表达载体pmdc83-gmrnf2a，转化大肠杆菌dh5α,转化液涂布于含50mg/l潮霉素的lb固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后,提取质粒,得到pmdc83-gmrnf2a植物过量表达载体,用冻融法将pmdc83-gmrnf2a转入根癌农杆菌菌株eha105中。将pmdc83-gmrnf2a通过农杆菌株eha105的介导转化拟南芥,在含有50mg/l潮霉素的ms培养基上培养,初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因植株。
提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的基因组dna,使用基因特异性引物gmrnf2a-bp-f:ggtttgtgatgggcaatgtttg(seqidno.13),和gmrnf2a-bp-r:tgaagaagatggtcctctcctg(seqidno.14)进行pcr鉴定。能够扩增出约为850bp大小条带的为阳性转基因拟南芥(图3)。选择pcr鉴定为阳性的植株,以gmrnf1a-qpcr-f:tcctcggctacaacatgaacat(seqidno.7)和gmrnf1a-qpcr-r:tctaacttggctccagcttctt(seqidno.8)为引物,进行实时荧光定量pcr检测。结果表明gmrnf2a可在转基因拟南芥中表达(图4)。将pcr、实时荧光定量pcr检测均为阳性的转基因植株命名为35s::gmrnf2a转基因拟南芥。
对35s::gmrnf2a转基因拟南芥进行表型观察。在25℃、长日照的生长条件下,与对照相比，35s::gmrnf1a转基因拟南芥与对照相比，转基因拟南芥与对照相比并无明显的表型变化，根、叶和角果等组织器官的发育并未受到影响。为了探究gmrnf2a与拟南芥果实发育的关系，我们对转基因拟南芥种子的千粒重进行了统计分析。结果表明转基因株系2、4的千粒重比对照有显著提高。(图6)同时我们还测定了转基因株系种子的各组分氨基酸含量，结果表明转基因株系02-2，02-4，02-5的各组分氨基酸含量比对照有显著提高(图7)。表明gmrnf2a在果实的发育过程中可能发挥重要作用。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一个大豆e3泛素连接酶家族基因gmrnf2a的应用
<160>14
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