本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种检测水稻胡麻叶斑病病菌的方法。
背景技术
水稻胡麻叶斑病，又称水稻胡麻斑病、胡麻叶枯病。从秧苗期至收获期均可发病，稻株地上部均可受害，尤以叶片最为普遍。芽期发病，芽鞘变褐，芽未抽出，子叶枯死。苗期叶片、叶鞘发病，多为椭圆病斑，如胡麻粒大小，暗褐色，有时病斑扩大连片成条形，病斑多时秧苗枯死。成株叶片染病，初为褐色小点，逐渐扩大为椭圆斑，如芝麻粒大小，病斑中央灰褐色至灰白色，边缘褐色，周围有深浅不同的黄色晕圈，严重时连成不规则大斑。病叶由叶尖向内干枯，潮湿时，死苗上产生黑色霉状物(病菌分生孢子梗和分生孢子)。叶鞘上染病病斑初椭圆形，暗褐色，边缘淡褐色，水渍状，后变为中心灰褐色的不规则大斑。穗颈、枝梗发病，病部暗褐色，造成穗枯。谷粒染病，早期受害的谷粒灰黑色扩至全粒造成瘪谷。后期受害病斑小，边缘不明显。病重谷粒质脆易碎。潮湿条件下，病部长出黑色绒状霉层(即病原菌分生孢子梗和分生孢子)。
水稻胡麻叶斑病是由半知菌亚门稻平脐蠕孢，又称稻离蠕孢(bipolarisoryzae)引起的一种真菌病害。病菌以以菌丝体在病草、颖壳内或以分生孢子附着在种子和病草上越冬，成为翌年初侵染源。在干燥条件下，病斑上的分生孢子在干燥条件下可存活2～3年，潜伏菌丝体能存活3～4年，菌丝翻入土中经一个冬季后失去活力。带病种子播后，潜伏菌丝体可直接侵害幼苗，分生孢子则借助气流传播至水稻植株上，从表皮直接侵入或从气孔侵入。条件适宜时很快出现病症，并形成分生孢子，借助风雨传播进行再侵染。病菌菌丝生长适宜温度为5～35℃，最适温度24～30℃；分生孢子形成的适宜温度为8～33℃，以30℃最适，孢子萌发的适宜温度为2～40℃，以24～30℃最适。孢子萌发须有水滴存在，相对湿度大于92％。饱和湿度下25～28℃，4小时就可侵入寄主。
体外扩增dna采用pcr及其相关技术具有简便、快速、灵敏等一些优点，在植物病原真菌检测当中被广泛的应用。但是由于植物病原真菌的复杂性和植物病害的多样性，使传统的pcr技术较难满足需要，采用传统的致病性检测技术，需要较长的时间才能鉴定出水稻胡麻叶斑病菌，降低了对该菌的分子鉴定、侵染机制和生活史的研究效率，因此，对于水稻胡麻叶斑病的研究迫切需要建立一种基于dna分子标记技术快速鉴定水稻水稻胡麻叶斑病菌株的有效方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题：针对目前水稻胡麻叶斑病病菌鉴定中出现的问题，提供一种基于dna分子标记技术快速鉴定水稻水稻胡麻叶斑病菌株的有效方法。
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
一种检测水稻胡麻叶斑病病菌的方法，包含以下操作步骤：
(1)将已知的水稻胡麻叶斑病菌株活化培养后收集菌丝，滤纸吸干菌丝外表水分，放入-20℃冰箱储存备用；
(2)菌丝冷冻干燥后采取ctab法提取dna，检测提取dna的浓度和纯度，之后将检测的dna样品放入-20℃冰箱保存备用；
(3)采用随机引物对供试菌株dna进行pcr扩增，产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，90v电泳40min后切胶回收dna；
(4)将回收的水稻胡麻叶斑病菌特异性随机引物扩增片段与puc18-t载体连接后转入大肠杆菌bl-21中；
(5)采用菌落pcr筛选阳性单克隆，单克隆摇菌培养后提取质粒，对插入片段测序；
(6)将测序后的序列输入ncbi核酸数据库作blast分析，与genebank中己有序列进行同源性对比，验证序列为水稻胡麻叶斑病菌的特异性序列，采用primer5.0设计病菌分子检测的特异性scar引物；
(7)在水稻胡麻叶斑病发生的田块，于水稻黄熟期，采集病穗的谷粒，75％乙醇浸泡45s，无菌条件下分别剥取病穗谷粒颖壳和健穗谷粒颖壳各0.5g，ctab法提取dna，将提取的dna测定浓度并稀释后作为dna模板；
(8)采用scar引物对待测水稻胡麻叶斑病菌dna进行扩增，产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，恒压90v电泳40min，紫外下在400bp处出现产物条带。
(9)利用primer5.0设计第二轮巣式pcr引物，采用scar引物扩增产物作为模板进行第二轮巣式pcr反应，产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，特异性扩增出218bp目的片段即为检测阳性。
优选地，所述随机引物为随机8聚体寡聚核苷酸，选用对水稻胡麻叶斑病菌dna能够扩增出稳定多态性条带的随机引物。
优选地，所述随机引物扩增的体系为：引物1.5μl、dna模板1μl、5×taqmastermix5μl、ddh2o18.5μl。
优选地，所述随机引物扩增的反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；52.5℃，45s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
优选地，所述水稻胡麻叶斑病菌株活化培养方法为：在马铃薯琼脂蔗糖培养基上培养8d后，沿菌落边缘切取菌丝3块转接到装有100ml的马铃薯蔗糖液体培养基的三角瓶内，于27℃，140rpm摇床上振荡培养8d，直接用纱布过滤，无菌水冲洗2～3次，收集菌丝球。
优选地，所述scar引物对待测水稻胡麻叶斑病菌进行扩增鉴定的体系为：1μl上游引物，1μl下游引物，1μldna模板，5μldreamtaqgreenpcrmastermix(5x)和17μl双蒸水。
优选地，所述scar引物对待测水稻胡麻叶斑病菌进行扩增鉴定的反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
进一步优选地，dna模板的浓度为100ng/μl。
优选地，第二轮巣式pcr反应的体系为：0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，1μldna模板，5μldreamtaqgreenpcrmastermix(5x)和18μl双蒸水。
优选地，第二轮巣式pcr反应的条件为：95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
本发明获得的有益效果：
本发明可快速鉴定水稻胡麻叶斑病病原菌，特异性高，无须根据水稻胡麻叶斑病病菌的基因组dna序列设计筛选特异性引物，直接提取样本dna序列后即可进行鉴定，有效提高水稻胡麻叶斑病病菌的鉴定效率。
附图说明
图1鉴定已知病菌和待测田间病叶样本的琼脂糖凝胶电泳图。
m：dnamarker；lane1～2：已知水稻胡麻叶斑病病菌菌株；lane3～9：田间病叶样本；lane10：阴性对照；lane11～18分别为大豆炭疽病菌、大豆疫霉病菌、大豆腐化镰刀菌、番茄早疫病菌、茄子枯萎病菌、水稻纹枯病菌、水稻稻瘟病病菌、水稻稻曲病病菌。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
实施例1：
采用如下方法鉴定田间获取的水稻胡麻叶斑病稻叶样本：
(1)将保存的已知胡麻叶斑病病菌在马铃薯琼脂蔗糖培养基上培养10d后，沿菌落边缘切取菌丝3块(5mm×5mm大小)转接到装有100ml的马铃薯蔗糖液体培养基的三角瓶内，于27℃，140rpm摇床上振荡培养8d，直接用纱布过滤，无菌水冲洗2～3次，收集菌丝球，滤纸吸干菌丝外表水分，放入-20℃冰箱储存备用；
(2)菌丝冷冻干燥后采取ctab法(参考《分子克隆实验指南》)提取dna，采用紫外分光光度计检测提取dna的浓度和纯度，用ddh2o将dna浓度调整至100ng/μl之后将检测的dna样品放入-20℃冰箱保存备用；
(3)采用随机8聚体寡聚核苷酸(购自上海生工随机引物库)对供试菌株dna进行pcr扩增，筛选出一条对水稻胡麻叶斑病菌dna能够扩增出稳定多态性条带的随机引物s1，序列为5’-acgcttac-3’。
(4)采用s1进行pcr体系如下：引物1.5μl、dna模板1μl、5×taqmastermix5μl、ddh2o18.5μl。pcr反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s；52.5℃，45s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
(5)pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，90v电泳40min后利用上海生工dna回收纯化试剂盒对dna进行切胶回收；
(6)将回收的水稻胡麻叶斑病菌特异性随机引物扩增片段与puc18-t载体连接后转入大肠杆菌bl-21中(参考《分子克隆实验指南》)，将bl-21稀释涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的lb琼脂平板上，分离单菌落，挑取单克隆，分别接种于含50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，150rpm，37℃摇菌10h，取200μl菌液7000rpm离心15min后弃上清，采用100μlddh2o重悬菌体，沸水浴5min制得菌体裂解液；
(7)采用s1进行菌落pcr筛选阳性单克隆，单克隆摇菌培养(方法同步骤6)后提取质粒，对插入片段测序；菌落pcr条件如下：引物1.5μl、dna模板1μl、5×taqmastermix5μl、ddh2o18.5μl。pcr反应条件如下：95℃，5min；95℃，30s；52.5℃，45s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
(8)将测序后的序列输入ncbi核酸数据库作blast分析，与genebank中己有序列进行同源性对比，如没有找到同源序列，则序列为水稻胡麻叶斑病菌的特异性序列，采用primer5.0设计病菌分子检测的特异性scar引物，引物序列如下：
s2：5’-cgcataccgctactactc-3’
s3：5’-actacgcgcattcatctg-3’
(9)在水稻胡麻叶斑病发生的田块，取幼嫩的染病叶片0.5g，75％乙醇浸泡45s，ctab法提取dna，将提取的dna测定浓度并稀释至100ng/μl后作为dna模板；
(10)采用引物s2和s3对已知水稻胡麻叶斑病病菌和待测水稻胡麻叶斑病病菌dna进行扩增，pcr体系为：1μl上游引物，1μl下游引物，1μldna模板，5μldreamtaqgreenpcrmastermix(5x)和17μl双蒸水。pcr反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，45s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。
(11)步骤(9)中的pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，恒压90v电泳40min，紫外下在400bp处出现条带。
(12)利用primer5.0设计第二轮巣式pcr引物，采用步骤(11)中的scar引物扩增产物作为模板进行第二轮巣式pcr反应，第二轮巣式pcr反应的体系为：0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，1μldna模板，5μldreamtaqgreenpcrmastermix(5x)和18μl双蒸水；第二轮巣式pcr反应的条件为：95℃，5min；95℃，30s；57℃，40s；72℃，1min，35循环；72℃，10min，4℃保存。第二轮巣式pcr引物序列如下：
s4：5’-tcaagcctcatcgtatg-3’
s5：5’-ctagatacctactagcg-3’
(13)第二轮巣式pcr产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，恒压90v电泳40min，紫外下特异性出现218bp目的片段条带即为检测阳性。
检测结果见图1。
检测结果显示利用设计的水稻胡麻叶斑病菌检测特定的scar标记引物和巣式pcr引物进行扩增，可特异性扩增出218bp的目标片段，特异性高，仅出现一条dna条带，其它病原真菌、细菌及空白对照，均无扩增条带。
综上所述，本发明可快速鉴定水稻胡麻叶斑病病原菌，特异性高，无须根据水稻胡麻叶斑病病菌的基因组dna序列设计筛选特异性引物，直接提取样本dna序列后即可进行鉴定，有效提高水稻胡麻叶斑病病菌的鉴定效率。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。