本发明属于试剂盒检测
技术领域：
，涉及用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法及其应用。
背景技术：
目前检测试剂盒主要有酶联免疫吸附测定(elisa)检测试剂盒、普通聚合酶链反应(pcr)试剂盒、实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-timefqrt-pcr)试剂盒。病毒、细菌、寄生虫的常规临床及实验室检测鉴定方法有镜检、病原分离、免疫组化、血清学诊断以及分子生物学方法。其中实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-timefqrt-pcr)试剂盒具有耗时短、灵敏度高、特异性强的优点。现在市场上常见的实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-timefqrt-pcr)扩增试剂盒包括反应液(含引物探针)、酶混合液、无菌无核酸酶水，进行实时荧光反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)扩增时，先按照说明书比例配制各种试剂的混合液，然后再分装到每个反应管中。现在市场上应用的实时荧光反转录聚合酶链式反应(real-timefqrt-pcr)扩增试剂盒存在以下不足：一、扩增体系配制错误，导致结果错误；二、试剂盒组分包括反应液(含引物探针)、酶混合液、无菌无核酸酶水等，检测前须按照说明书比例配制预混液，再进行分装。容易造成配液错误、污染，并且预混液需现配现用，操作繁琐且耗时较长；三、常见的实时荧光反转录聚合酶链式反应扩增试剂盒反应时间通常需要1～2小时，耗时长，难以满足大批量检测的需求。poct(point-of-caretesting)，指即时检验、现场快速检验，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedsidetesting)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。poct由中国医学装备协会poct装备技术专业委员会在多次专家论证基础上统一命名，并将其定义为：在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。poct含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检验，即“床旁检验”；时间上，可进行“即时检验”。目前，限制poct检测模式在pcr检测领域的应用的主要制约因素有：常规pcr或荧光pcr需现场配液、操作繁琐、耗时较长、不稳定、易污染等。因此，亟需一种稳定性好、保存期长、操作简便、不需配液(提取好模板直接加入扩增体系)、检测时间短的poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物及其制备方法，该方法制得的单体系酶扩增组合物稳定性好、保存期长、操作简便、不需配液(提取好模板直接加入扩增体系)，且rt-pcr扩增时间仅需30分钟(常规试剂盒的rt-pcr扩增时间在70分钟以上)，使检测时间相比常规检测减少了75％～80％，并且可大大减少试验出错及污染的可能性，非常适用于poct检测模式。本发明的技术方案如下：用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法，其特征在于，包括：(1)针对目标序列设计并合成特异性的引物和探针；(2)按如下配方配制反应液：ph值8.3～8.7的tris-hcl反应缓冲液20～50mm、mgcl21～3mm、kcl40～50mm、dntps50～200μm、dutp100～400μm、反转录酶100～200u/μl、taq酶0.8～2.8u/μl、rna酶抑制剂10.5u/t～12.5u/t、引物0.1～1μm、探针0.01～0.2μm、终浓度为1～20mm或体积比0.05％～10％的反应增强剂、其余为无菌无核酸酶水；(3)将上述反应液按份分装，每一份即所述单体系酶扩增组合物。所述反应液还包括通用内参引物0.1～1μm、内参探针0.01～0.2μm；通用内参优选xenornacontrol。所述反转录酶优选primescripttmrtenzyme；所述taq酶优选takaraextaqtmhs酶。所述反应增强剂选自具有下述在所述反应液中的终浓度的下述物质之一，10-20mm的硫酸铵、体积浓度为1％～5％的甲酰胺或甜菜碱、体积浓度为1％～10％的甘油、体积浓度为0.05％～0.1％的tween-20、体积浓度为0.05％～0.1％的bsa、或，1mm～2mm的dtt或明胶。1份单体系酶扩增组合物的总体积选自12～14μl、14～16μl、16～18μl、18～20μl、20～22μl、22～24μl或24～26μl。所述的制备方法制备得到的单体系酶扩增组合物。用于poct荧光rt-pcr体系的试剂盒，其特征在于，包括至少1份所述的单体系酶扩增组合物。所述单体系酶扩增组合物为若干份。所述单体系酶扩增组合物被存放在pcr扩增管中；每个pcr扩增管中存放1份所述单体系酶扩增组合物。本发明提供了一种用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法，其特征在于，1份快速实时荧光反转录聚合酶链式反应试剂盒的单体系酶扩增组合物包含反应缓冲液、dntps、dutp、反应增强剂、反转录酶、taq酶、rna抑制剂、引物、探针、扩增用pcr管。本发明的一个方面，poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法其特征在于选取的单体系酶扩增组合物为1份扩增反应。本发明的还一个方面，poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法其特征在于选取的引物探针为任意的可以进行反转录聚合酶链式反应的引物探针。在本发明的具体实施方式中，所选取的引物探针为可以扩增犬瘟热病毒和内参。本发明的还一个方面，poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法其特征在于选取的扩增用pcr管为可以应用于不同荧光pcr仪的扩增管。在本发明的具体实施方式中，所选取的扩增用pcr管为cepheidtubes25μl，荧光pcr仪为anhealt8。本发明还提供了上文所述单体系酶扩增组合物的用途，其用作poct荧光rt-pcr体系的部分。本发明的单体系酶扩增组合物可以置于反转录聚合酶链式反应试剂盒中。在本发明的具体实施方式中，所用的poct荧光rt-pcr体系包括但不限于犬瘟热病毒快速实时荧光反转录聚合酶链式反应试剂盒。与现有技术相比，本发明的制备方法可制备出十分适用于poct检测模式的荧光pcr单体系酶组合物，填补了poct荧光rt-pcr检测领域的空白。本发明方法制备的单体系酶扩增组合物稳定性好、保存期长、操作简便、不需配液(提取好模板直接加入扩增体系)，避免了现有技术中现用现配液，操作繁琐，容易出错及污染的缺点，可实现及时检验。本发明的制备方法及其制备出的poct荧光rt-pcr单体系酶组合物及试剂盒经反复试验，其灵敏度高达101.5tcid50、准确率高达100％、保存期长达18个月、rt-pcr扩增时间缩短至30分钟，相比常规操作缩短75％～80％，大大降低试验出错及污染的可能性。附图说明图1为采用现有常规手段：正常荧光rt-pcr扩增体系进行的real-timefqrt-pcr扩增结果；图2为采用本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物进行real-timefqrt-pcr的扩增结果；图3为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物放置0个月后，将其取出进行real-timefqrt-pcr的扩增结果；图4为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物放置6个月后，将其取出进行real-timefqrt-pcr的扩增结果；图5为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物放置12个月后，将其取出进行real-timefqrt-pcr的扩增结果；图6为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物放置18个月后，将其取出进行real-timefqrt-pcr的扩增结果；图7为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物的特异性试验结果：其中，1：cpiv；2：aiv；3：cpv；4：ccv；5：cav-1；6：cav-2；7：cdv。图8为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物的pcr敏感性试验结果：其中，1：105.5tcid50；2：104.5tcid50；3：103.5tcid50；4：102.5tcid50；5：101.5tcid50；6：100.5tcid50；图9为本发明的一个实施例提供的单体系酶扩增组合物的应用试验结果：1～6为临床样品检测；7～12为临床样品检测内参。图10为本发明的一个实验例提供的犬瘟热病毒快速real-timefqrt-pcr试剂盒的灵敏度验证；其中1为105.5tcid50；2为104.5tcid50；3为103.5tcid50；4为102.5tcid50；5为101.5tcid50；6为100.5tcid50。图11为本发明的一个实验例提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒多联快速real-timefqrt-pcr试剂盒猪繁殖与呼吸综合征病毒的扩增效果。图12为本发明的一个实验例提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒多联快速real-timefqrt-pcr试剂盒猪瘟病毒的扩增效果。图13为本发明的一个实验例猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒多联快速real-timefqrt-pcr试剂盒中内参扩增效果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。第1组实施例、本发明的单体系酶扩增组合物制备方法本组实施例提供一种用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物的制备方法，其特征在于，包括：(1)针对目标序列设计并合成特异性的引物和探针；(2)按下述配方配制反应液：ph值8.3～8.7的tris-hcl反应缓冲液20～50mm、mgcl21～3mm、kcl40～50mm、dntps50～200μm、dutp100～400μm、反转录酶100～200u/μl、taq酶0.8～2.8u/μl、rna酶抑制剂10.5u/t～12.5u/t、引物0.1～1μm、探针0.01～0.2μm、终浓度为1～20mm或体积比0.05％～10％的反应增强剂、其余为无菌无核酸酶水；或，按下表1任一组配方配制反应液：表1(3)将上述反应液按份分装，每1份即所述单体系酶扩增组合物。在进一步的实施例中，所述反应液还包括通用内参引物0.1～1μm、内参探针0.01～0.2μmμm；通用内参优选xenornacontrol，可商购获得。在进一步的实施例中，所述反转录酶优选primescripttmrtenzyme；所述taq酶优选takaraextaqtmhs酶。这两种酶均为进行了酶活优化的商品化的酶；其中primescripttmrtenzyme反转录酶通过基因修饰和重组技术克隆表达的rnaseh活性缺失，提高了热稳定性，同时增强了对rna复杂二级结构的耐受，缩短反应时间；taq酶(takaraextaqtmhs酶)是基于抗体法修饰的热启动酶，通过基因工程技术改造后，可缩短反应时间。在一些实施例中，所述反应增强剂组分按下述配方所示，成分为硫酸铵10-20mm、体积浓度为1％-5％的甲酰胺或甜菜碱、体积浓度为1％-10％的甘油、体积浓度为0.05％-0.1％的tween-20、体积浓度为0.05％-0.1％的bsa、dtt或明胶1mm-2mm。或者，所述反应增强剂选自如下表2所示的具有下述在所述反应液中各个终浓度的物质之一：表2在具体的实施例中，1份单体系酶扩增组合物的总体积选自12～14μl、14～16μl、16～18μl、18～20μl、20～22μl、22～24μl或24～26μl。以下是本发明制备方法试验过程中的具体操作步骤：一、引物和探针设计二、核酸提取(元亨提取试剂盒)三、标准品制备含扩增片段的t载体转化大肠杆菌dh5α经过转化、富集后提取质粒，用分光光度仪稀释并定量至1×1010拷贝/μl，分装后置于-80℃保存。四、反应介质优化反应体系各组分设置包括：模板dna/rna15、30、45、60、75、90、120、150、180ng九个梯度。随机引物0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、1.2、1.4、1.8μmol/l六个浓度梯度。探针0.01、0.05、0.10、0.15、0.2μm五个梯度。taq酶0.5、1、1.5、2、2.5、3u五个浓度梯度。dntps50、100、150、200μm四个浓度梯度。dutp100、150、200、250、300、350、400μm六个浓度梯度。反转录酶100、120、140、160、180、200u/μl六个浓度梯度。rna酶抑制剂10.5、11.5、12.5、13.5u/t四个浓度梯度。mg2+3.5、3.0、2.5、2、1.5、1、0.5、0.025mmol/l八个浓度梯度。五、温度优化反转录酶将酶液与提取好的rna10μl混合，分别在pcr仪器上设置41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃，同时进行温浴。反转录产物取2μl进行pcr，反应结束后将所有pcr产物进行1.5％～2％琼脂糖电泳，溴化乙锭染色凝胶成像系统观察。2.taq酶在其他条件不变的情况下，将退火温度设置为32℃、34℃、36℃、38℃、40℃，对比荧光定量pcr结果。六、ph值优化调节缓冲液ph，设置为8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8的ph值梯度，随机选取引物进行荧光定量pcr，对比结果。七、冻融试验采用反复冻融法，取4份单体系扩增组合物在-20℃冰箱中冷冻2h，融化1h为一个循环，冻融0、5、10、20次。逐一完成冻融后，以-20℃冰箱中未发生冻融的单体系扩增组合物作为对照，随机选取引物进行荧光定量pcr对比检测。第2组实施例、本发明的单体系酶扩增组合物本组实施例提供一种用于poct荧光rt-pcr体系的单体系酶扩增组合物，其特征是，所述单体系酶扩增组合物由第1组实施例任一项所述的制备方法制备得到。第3组实施例、本发明的试剂盒本组实施例提供一种用于poct荧光rt-pcr体系的试剂盒，其特征在于，包括至少1份第2组实施例任一项所述的单体系酶扩增组合物。在具体的实施例中，所述单体系酶扩增组合物为若干份。在进一步的实施例中，所述单体系酶扩增组合物被存放在扩增管中；每个扩增管中存放1份所述单体系酶扩增组合物。实验例1：单体系酶扩增组合物的比对本发明人购买市售荧光rt-pcr扩增体系，并设计扩增犬瘟热病毒的引物探针，通过比对试验，筛选单体系酶扩增组合物的配制方法和扩增条件。正常荧光rt-pcr扩增体系，及扩增条件，现用现配反应试剂体积(μl)终浓度反应缓冲液(含mgcl2和dntp)12.51×热启动taq酶0.50.1u/μl高效反转录酶0.5——10pmol/μl引物对1.5400nm10pmol/μl探针0.5200nmrox染料0.51×总rna2——ddh2o7——总体积25——扩增条件单体系酶扩增组合物配制方法，及扩增条件按照以上配方进行配制，将配制好的反应体系充分混匀后，分装每个cepheidtubes反应管中各15μl，即为单体系酶扩增组合物，冻存于-20℃。扩增条件敏感性和特异性结果一致，但是单体系酶扩增组合物稳定性好、保存期长、操作简便、不需配液(提取好模板直接加入扩增体系)、扩增时间仅需30分钟；相比常规市售荧光rt-pcr扩增体系及方法所需时间70分钟以上，本发明的反应时长有效缩短了75％以上。结果分别如图1和图2所示。实验例2：单体系酶扩增组合物保存期本发明制备方法制备得到的单体系酶扩增组合物的保存期实验结果如图3-图6所示，保存期长达18个月时，取出仍能进行扩增反应，并获得优良的结果。实验例3：犬瘟热病毒快速poct荧光rt-pcr体系试剂盒组成(10份/盒)1.反应管：1份犬瘟热病毒单体系酶扩增组合物，15μl/支，10支，-20℃保存；2.rna内参：300μl/支，1支，-20℃保存；3.裂解液：6ml/瓶，1瓶，室温保存。4.洗液：12ml/瓶，1瓶，室温保存。5.洗脱液：1ml/支，1支，室温保存。6.吸附柱和收集管：10套/袋，1袋，室温保存。实验例4、实验例3制备的试剂盒的使用方法1样品制备1.1将无菌棉拭子用无菌生理盐水沾湿，在结膜囊内或鼻黏膜处翻转涂擦，采集样本，或用无菌拭子蘸取气管灌洗样本。再将拭子插入无菌生理盐水，涡旋震荡混匀，然后将拭子在管壁挤干液体，放入消毒液中弃掉，取上清液200μl于1.5ml灭菌离心管中。1.2edta抗凝血、细胞培养液，取上清液200μl于1.5ml灭菌离心管中。2病毒rna的提取2.1将处理好的样品分别加入20μlrna内参，再加入裂解液500μl，充分颠倒混匀，室温静置3min。将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸入液体时尽量不要吸入悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s。2.2弃去收集管中液体，吸取洗液500μl加入吸附柱，13000rpm离心30s。2.3弃去收集管中液体，吸取洗液500μl加入吸附柱，13000rpm离心2min(拿出时请注意避免吸附柱碰到下面的液体)以除去残留的洗液。2.4将吸附柱移入1.5ml离心管中，向吸附柱中央加入50μl洗脱液，13000rpm离心30s，离心管中液体即为模板rna。3实时荧光rt-pcr操作取反应管置于室温融化，用移液器吸取模板rna5μl加入反应管中，用离心机离心30s，放入机器中，使用程序cdv进行扩增检测。【结果判定】根据自动分析，ct值≤36并出现特定的扩增曲线为cdv阳性；ct值＞36时，并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取rna，扩增后进行结果判定，如仍出现特定的扩增曲线，可判定为阳性；对于某些未呈现s型曲线，但本底较高的样品，应为阴性。实验例5、实验例3制备的试剂盒的应用1特异性试验特异性试验结果见图7。由图7可见，设计的引物探针只能从cdv培养物中扩增出目的片段，其它可以感染犬的病毒扩增结果为阴性。2敏感性试验结果敏感性试验结果见图8。由图8可见，采用本试验的pcr方法可以从做105.5tcid50、104.5tcid50、103.5tcid50、102.5tcid50、101.5tcid50稀释的5μl样品中获得阳性扩增结果，最小检出量为101.5tcid50。7500仪器检测结果如图10所示，图中的1为105.5tcid50；2为104.5tcid50；3为103.5tcid50；4为102.5tcid50；5为101.5tcid50；6为100.5tcid50。3应用试验结果初步试验结果见图9。由图9可见，采用pcr方法可从6份疑似样品中获得4份阳性扩增结果。准确率是100％实验例6、其它几类不同检测靶标的本发明检测试剂盒性能验证按照本发明的上述制备方法，可制备得到：猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒多联快速poct荧光rt-pcr体系试剂盒poct荧光rt-pcr体系，制备方法与实验例3相同。各类试剂盒扩增效果良好，猪繁殖与呼吸综合征病毒快速poct荧光rt-pcr体系试剂盒的扩增效果如图11所示；猪瘟病毒快速poct荧光rt-pcr体系试剂盒的扩增效果如图12所示；内参扩增效果如图13所示。上述试剂盒的保存期均能达到18个月以上，且采用上述各类试剂盒进行poct荧光rt-pcr体系的反应时间均控制在40分钟以内，灵敏度均能达到101.5tcid50。当前第1页12