促生菌负载材料及利用其制备生物炭肥料的方法与流程

本发明属于微生物菌剂领域，具体的涉及一种促生菌负载材料的制备方法，以及利用该促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法。

背景技术

长期过量施用化肥不仅使农产品的品质下降，更严重是可能会产生环境污染问题(沈振月等，2004)。生物菌肥是一种环境友好型肥料，施加到土壤中可以持续作为植物的营养和生长激素的来源。对于农业生产来讲，长期使用生物菌肥是经济、高效、高产的选择(mahdietal.2010)。另一方面，生物菌肥可以通过固定大气中的氮气，溶解固态磷和产生植物促生物质来改良土壤性质(marschner1995)。

植物生长素的发现可以追溯到19世纪关于向光性和趋向性实验。1880年，charlesdarwin通过实验发现植物具有趋光性现象，并将这种植物体内可以传递信号的物质命名为“indole-3-aceticacid”(即iaa)(spaepen,s.etal2007)。iaa作为最早被发现的植物生长激素，几乎参与植物生长发育的各个阶段，调节植物细胞的生长、根茎叶的分化及果实发育，在植物生长发育和防御中发挥重要作用(hallidavk.t.etal2009；杨扬等，2016)。随着分子生物学的发展发现不仅植物可以合成iaa，有相当一部分的植物根际促生菌(pgpr)也可以产生iaa，这部分微生物被称作iaa产生菌。

枯草芽抱杆菌(bacillussubtilis)是一种广泛分布于各种不同生态环境中的革兰氏阳性细菌，呈杆状，在土壤和植物的表面普遍存在，可以产生内生芽饱，具有较强的耐热抗逆性，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人和动物无毒害作用，不污染环境。由于它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖与繁殖，而且生产枯草芽饱杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，储存期长，因此是一种理想的生防微生物(袁玉娟，2008)。在过去的几十年中，bacillussubtilis被广泛的应用于各种基因组学和生物化学的研究中(moszer,i.etal.,2002；kunst,f.etal.1997)。而bacillussubtilis168更是作为iaa产生菌的模式菌株被大量使用。

为了制备稳定的生物菌肥需要找到理想的载体材料，生物炭不仅具有丰富的有机质和强大的保水能力，而且具有无毒、可灭菌、不发生电抗反应等诸多优点，是微生物菌剂的理想载体。但是原材料对与生物炭的理化性质影响很大。生物炭的原材料来源广泛，包括秸秆类(如玉米秸秆、水稻秸秆、竹子等)、壳谷类(如椰壳、稻壳、花生壳等)、木材类(如松木等)、有机肥(如猪粪、鸡粪、牛粪等)、固体废弃物类(如纸浆、纸箱等)。所以目前需要找到一种合适的生物炭负载材料，制备成为廉价易得效果突出的微生物菌剂。

参考文献：

低温花生壳(生物炭)参考文献：

yaoy,gaob,zhangm,etal.effectofbiocharamendmentonsorptionandleachingofnitrate,ammonium,andphosphateinasandysoil[j].chemosphere,2012,89(11):1467-1471.

松木生物炭参考文献：

halel,luthm,crowleyd.biocharcharacteristicsrelatetoitsutilityasanalternativesoilinoculumcarriertopeatandvermiculite[j].soilbiologyandbiochemistry,2015,81:228-235.

稻壳生物炭参考文献：

el-fattahdaa,ewedawe,zayedms,etal.effectofcarriermaterials,sterilizationmethod,andstoragetemperatureonsurvivalandbiologicalactivitiesofazotobacterchroococcuminoculant[j].annalsofagriculturalsciences,2013,58(2):111-118.

利用控制od600值来调节每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量参考文献：

liuyp,chenl,zhangn,lizf,zhanggz,xuy,shenqr,zhangrf.2016.molecularplant-microbeinteractions.29(4):324-330.

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是是筛选一种能延长促生菌菌株存活时间、提高吲哚乙酸的产量的促生菌负载材料，并利用该促生菌负载材料制备一种低价易得的生物炭肥料，促进农林废弃物的循环再利用和生物炭肥料的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出一种促生菌负载材料的制备方法，包括以下步骤：

将含水量≤5％的原材料粉碎、过筛；

将过筛后的原材料放置于无氧密闭的容器中，再将该容器放置在马弗炉中，于无氧条件下加热到250～350℃，升温速率为10℃min^-1，制得促生菌负载材料。

作为本发明促生菌负载材料的制备方法的改进：

将过筛后的原材料放置于无氧密闭的容器中，再将该容器放置在马弗炉中，于无氧条件下加热到300℃，升温速率为10℃min^-1，制得促生菌负载材料。

作为本发明促生菌负载材料的制备方法的进一步改进：

所述原材料为青竹；

将青竹放置在160～200℃烘箱中杀青15～25min，然后放置于50～60℃烘箱中烘干48±2h脱水，获得含水量≤5％的青竹；

将所得含水量≤5％的青竹置于室温(25～35℃)下平衡24±1h后粉碎、过筛。

为解决上述技术问题，本发明还提出一种利用上述方法制备获得的促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法，包括以下步骤：

s1、菌悬液的制备：所述菌悬液为iaa产生菌的菌悬液；

s2、促生菌负载材料灭菌处理(高压蒸汽灭菌)；

s3、制备生物炭肥料：

按1～3g：50ml的比例将步骤s1所得的iaa产生菌的菌悬液和步骤s2灭菌后的促生菌负载材料混合后，于30～40℃恒温震荡2-14d，获得生物炭肥料。

作为本发明利用促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法的改进：

所述步骤s3中制备生物炭肥料的方法为：

按1.5g：50ml的比例将步骤s1所得的iaa产生菌的菌悬液和步骤s2灭菌后的促生菌负载材料混合后，于37℃恒温震荡7d，获得生物炭肥料。

作为本发明利用促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法的进一步改进：

所述步骤s1中菌悬液的制备的方法包括以下步骤：

1.1、将iaa产生菌的种子液按1％体积比接种至已灭菌(常规的高温高压灭菌)的lb液体培养基中，于30～40℃，100-150rpm恒温振荡培养箱中培养12-18h，制备获得初始菌悬液；

1.2、将步骤1.1所得初始菌悬液的od600值调节至0.7-0.9。

作为本发明利用促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法的进一步改进：

所述步骤1.1中初始菌悬液的制备方法为：将iaa产生菌的种子液按1％的接种量接种至已灭菌(常规的高温高压灭菌)的lb液体培养基中，于37℃，135rpm恒温振荡培养箱中培养16h。

作为本发明利用促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法的进一步改进：

所述iaa产生菌为bacillussubtilis168。

为解决上述技术问题，本发明还提供一种利用上述方法制备所得的生物炭肥料。

与现有技术相比，本发明的技术优势在于：

1、本发明以低温竹炭(生物炭)为菌株载体，其营造的微环境可以为微生物提供生存的空间，并为微生物提供有效养分。且本发明所制备的低温竹炭(生物炭)负载bacillussubtilis168菌株材料的第7天，与仅添加对应菌株处理的负载液相比，iaa的浓度增加了将近30倍。

2、本发明的生产成本低，操作简单。本发明利用竹子低温裂解的生物炭为载体，价格低廉，来源广泛，负载过程简单易行。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为菌株b.subtilis168-生物炭负载液中iaa的浓度随时间的变化趋势图。

具体实施方式

实施例1、利用促生菌负载材料制备生物炭肥料的方法：利用生物炭作为iaa产生菌的载体材料，将菌株负载到生物炭材料上，可以提高菌株的iaa产量，延长菌株的存活时间。

在本发明中所用到的生物炭均为实验室自己制备，用到的菌株bacillussubtilis168为购买自biovectorsciencelab,inc(bacillussubtilissubsp.subtilis(ehrenberg1835)nakamuraetal.1999)，即由biovectorsciencelab菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。

注：biovectorsciencelab，中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心。

具体制备方法包括以下步骤：

1、菌悬液的制备：制备bacillussubtilis168的菌悬液。

1.1、将甘油保存的bacillussubtilis168按1％(体积比)的接种量接种至已灭菌(采用常用的高温高压灭菌方式)的lb液体培养基中进行活化，于37℃下135rpm培养16h时间后获得浓度约为1*10⁸cfu/ml的bacillussubtilis168的种子液。

1.2、将步骤1.1所得bacillussubtilis168的种子液按1％(体积比)的接种量接种至含有50ml已灭菌lb液体培养基的三角瓶中，于37℃下135rpm恒温振荡培养箱中培养16h，得到bacillussubtilis168的菌悬液，即初始菌悬液。

lb液体培养基的制备方法如下：在每升水中加入蛋白胨10g、酵母膏5g和nacl10g，并采用naoh调节其ph＝7.4～7.6，然后对最终获得的lb液体培养基进行常规的高温高压灭菌即可。

1.3、将步骤1.2中所得的初始菌悬液调节od＝0.8左右，即，每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量约为5.0*10⁸cfu，获得bacillussubtilis168菌悬液。

本发明中利用控制od600值来调节每ml的初始菌悬液中所含有的菌体的数量。例如：当调节od＝0.8左右，该菌悬液含有的菌体数量约为5.0*10⁸cfu。

2、促生菌负载材料的制备：

本实施例中选用青竹作为负载材料的原材料。

将新鲜青竹放置在180℃烘箱中杀青20min，然后放置于55℃烘箱中烘干48h脱水，得到含水量≤5％的青竹，将其置于室温(25℃)下平衡24h，粉碎，过1mm筛。

之后将过筛后的原材料用锡箔纸包紧，挤压出中间的空气，密封。然后密封无氧条件下的原材料放置在马弗炉中，无氧条件下加热到300℃(升温速率为10℃min^-1)，制备成低温竹炭(生物炭)，即，促生菌负载材料。

注：上述新鲜青竹指新砍伐获得的青竹。

3、制备生物炭肥料：

取步骤1.3所得的bacillussubtilis168菌悬液50ml，加入步骤2所得的低温竹炭(负载材料)1.5g，37℃恒温震摇7d，将bacillussubtilis168菌株负载到低温竹炭上，获得生物炭肥料。

注：在低温竹炭加入bacillussubtilis168菌悬液前需进行灭菌，本实施例中采用高压蒸汽灭菌，将制备好的低温竹炭置于锥形瓶中，并用橡胶塞封口，于103.4kpa、121℃下灭菌20min，冷却后再密封待用。

实验1：b.subtilis168–低温竹炭(生物炭)负载液中iaa浓度的变化：

取实施例1中步骤1.3所得的bacillussubtilis168菌悬液50ml到3个培养瓶中，然后在每个培养瓶中加入1.5g步骤2所得的低温竹炭(负载材料)和0.05106g色氨酸(即5mmiaa合成前体物质)，均匀混合后，得到b.subtilis168–低温竹炭(生物炭)负载液，简称为bamboo+168。

将所得负载液bamboo+168于37℃135rpm恒温震摇，并于0h，3h，6h，12h，24h，48h，3d，7d，14d取样后在hplc(highperformanceliquidchromatography，高效液相色谱法)上测定iaa的浓度，取测定得到3个iaa的浓度的平均值。

如图1所示：

本实施例中第7天时负载液bamboo+168中iaa的浓度达到峰值，此时iaa的浓度为1.496mg/kg。

注：上述通过hplc测定iaa浓度为现有技术，故在本发明中不再详细描述。

以同样的方法做空白(ck)试验，即只添加菌株b.subtilis168的处理(简称为b.subtilis168)及仅有lb培养基的处理(简称为lbcultureonly)，获得对应实验中不同时段iaa的浓度的平均值；负载液b.subtilis168中iaa的浓度在第48h达到峰值，此时iaa的浓度为0.154mg/kg。负载液lbcultureonly中iaa的浓度在第3h达到峰值，此时iaa的浓度为0.077mg/kg。

对比例1、将实施例1中步骤2中使用的“青竹”改成“花生壳(含水量≤5％)”，取消杀青、脱水及平衡的步骤，即，将该花生壳按步骤2进行粉碎，过1mm筛后，利用锡箔纸包紧置于马弗炉内烧制，制备获得低温花生壳(生物炭)，其余等同于实施例1。

将低温花生壳按照实验1的步骤进行制备获得b.subtilis168–低温花生壳(生物炭)负载液，简称为peanutshell+168。

测定其iaa的浓度的平均值，结果显示，负载液peanutshell+168中iaa的浓度在48h达到峰值，但也仅有0.156mg/kg，实施例1负载液bamboo+168中第48h的iaa含量为0.347mg/kg，相差2.22倍。实施例1负载液bamboo+168中第7天，即达到峰值时的iaa含量为1.496mg/kg，相差9.6倍。

对比例2、将实施例1中步骤2中使用的“青竹”改成“松木(含水量≤5％)”，取消杀青、脱水及平衡的步骤，即，将该松木按步骤2进行粉碎，过1mm筛后，利用锡箔纸包紧置于马弗炉内烧制，制备获得低温松木(生物炭)，其余等同于实施例1。

将低温松木按照实验1的步骤进行制备获得b.subtilis168–低温松木(生物炭)负载液，简称为pinewood+168。

测定其iaa的浓度的平均值，结果显示，负载液pinewood+168中iaa的浓度在第7天达到峰值，但也仅有0.469mg/kg，与实施例1负载液bamboo+168中的iaa含量相差将近3倍。

对比例3、将实施例1中步骤2中使用的“青竹”改成“稻壳(含水量≤5％)”，取消杀青、脱水及平衡的步骤，即，将该稻壳按步骤2进行粉碎，过1mm筛后，利用锡箔纸包紧置于马弗炉内烧制，制备获得低温稻壳(生物炭)，其余等同于实施例1。

将低温稻壳按照实验1的步骤进行制备获得b.subtilis168–低温稻壳(生物炭)负载液，简称为ricehusk+168。

测定其iaa的浓度的平均值，结果显示，负载液ricehusk+168中iaa的浓度在第3天达到峰值，但也仅有0.305mg/kg，与实施例1负载液bamboo+168中第7天，即达到峰值时的iaa含量为1.496mg/kg，相差近5倍。

由图1可知，菌株b.subtilis168–低温竹炭(生物炭)处理在0-14天负载液中都能检测到iaa，并且在第7天时菌株b.subtilis168–低温竹炭(生物炭)处理负载液中iaa的浓度为1.496mg/kg，比同时段其它处理高3-15倍浓度，说明低温竹炭(生物炭)作为菌株载体能显著提高iaa产生菌合成iaa。同时，空白对照组b.subtilis168在第14天iaa的浓度为0.134mg/kg，菌株b.subtilis168–低温竹炭(生物炭)处理在第14天iaa的浓度为1.050mg/kg，仍然显著高于空白对照组，从而证明生物炭负载iaa产生菌后，其提高iaa产量的效果至少能够维持到14天。

bamboo+168在第7天的时候负载效果最好，iaa产量达到峰值。现有技术制备生物炭肥料时通常仅负载48h，保证菌株生长在生物炭上即可，未对负载时间有特殊控制，不能促进菌株的活性。

综上，本发明通过将低温竹炭(生物炭)作为植物生长促生菌的载体，延长促生菌的发挥功能的时间同时显著提高菌株合成吲哚乙酸(即iaa)的量。本发明通过制备一种成本低、操作便捷的生物炭-菌株负载体作为生物肥料，促进农林废弃物的资源化再利用。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。