一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用的制作方法

本发明涉及一种重组大肠杆菌全细胞转化合成四氢嘧啶的方法，属于基因工程和生物技术领域。

(二)

背景技术：

海洋微生物为了适应深海的高盐条件，需要依赖于一种被称为相容性溶质机制的策略(compatible-solutes，strategy)，来抗衡外界盐环境形成的负面影响，维持渗透压平衡。根据化学结构，相容性溶质主要包括：①糖类及衍生物：蔗糖、海藻糖、甘油葡萄苷等；②多元醇类及衍生物：甘油山梨醇、甘露醇等；③氨基酸及衍生物：脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、四氢嘧啶、5-羟基四氢嘧啶等；④甜菜碱类：甜菜碱、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱。相容性溶质作为细胞的渗透压保护剂，有很好的稳定生物大分子的功能，对细胞内的蛋白酶和其它大分子物质起着抗热、抗冻和抗变性等稳定作用。

四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，ectoine)，是目前发现分布最广泛的相容性溶质，它与细胞相容性好，高浓度的积累可对抗渗透压冲击，且不干扰细胞的新陈代谢和蛋白质的正确折叠，甚至具有稳定蛋白质结构的作用，被广泛的运用：①被称为“分子伴侣”保护生物大分子；②蛋白质与酶分子稳定剂；③dna结构稳定和保护剂；④生物医药，如阿尔兹海默氏症、帕金森病、结肠炎等疾病的治疗过程均有一定的作用，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力、延缓其老化和抑制黑色素的生成，可作为安全的化妆品保湿剂与增白剂。⑤据报道，高纯度的四氢嘧啶市场价约$1300/kg。其结构式如下：

由于四氢嘧啶的手性结构和最初可分离到的菌株四氢嘧啶产量极低，而且化学合成成本很高，很难直接应用于商业用途，导致四氢嘧啶的相关研究进展难以推进。目前，以天冬氨酸钠为底物，采用重组大肠杆菌进行全细胞生物催化生成四氢嘧啶，已广泛应用于四氢嘧啶的大规模生产。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种产生四氢嘧啶的工程菌、构建方法及制备四氢嘧啶的方法，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(e.colihect)，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌e.colimg1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysa基因敲出，并导入核苷酸序列为seqidno.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectabc获得的。所述二氨基庚二酸脱羧酶lysa基因核苷酸序列为seqidno.2所示。所述四氢嘧啶合成基因簇ectabc先与ptrc99a质粒连接，再将重组质粒导入宿主菌获得的。

本发明所述产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(e.colihect)的构建方法如下：

(1)敲出大肠杆菌e.colimg1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysa基因，切断l-天冬氨酸到赖氨酸支路的代谢，获得大肠杆菌e.colimg1655-1。

(2)从伸长盐单胞菌h.elongata(cgmcc1.6329)中克隆四氢嘧啶的合成基因簇ectabc，以ptrc99a质粒为载体导入到大肠杆菌e.colimg1655-1，构建从l-天冬氨酸到四氢嘧啶的合成途径，基因簇ectabc分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶，构建得到产生四氢嘧啶的工程菌e.colihect。

本发明还提供一种重组大肠杆菌在转化合成四氢嘧啶中的应用，所述的应用为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂加入转化液中，在25-45℃、150-200rpm条件下进行转化反应6-48h(优选40℃，200rpm反应24h)，反应结束，获得含四氢嘧啶；所述转化液终浓度组成：l-天冬氨酸钠5-80g/l，甘油5-80g/l，氯化钾0-50g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.5-8.0，优选转化液终浓度组成：l-天冬氨酸钠5-20g/l，甘油5-25g/l，氯化钾10-50g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.0-8.0。

进一步，所述湿菌体用量以转化液体积计为4-7g/l，优选6g/l。

进一步，湿菌体发酵方法为：将重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在28-37℃、150-200rpm(优选37℃，200rpm)条件下震荡培养至od600为0.6-0.8，再加入终浓度50mg/ml的iptg进行诱导，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养8-12h(优选30℃，200rpm震荡培养12h)，获得发酵液，将发酵液离心(4000-7000rpm离心5min，优选5000rpm，4℃离心5min)，获得湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成：酵母提取物5-20g/l，胰蛋白胨5-15g/l，氯化钠10-50g/l，溶剂为去离子水，ph7.0-7.3；优选发酵培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

本发明所述湿菌体在发酵前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度5-10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养方法为：将重组大肠杆菌接种于种子培养基，在28-37℃、150-200rpm条件下震荡培养至对数生长期，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成：酵母提取物5-20g/l，胰蛋白胨5-15g/l，氯化钠10-50g/l，溶剂为去离子水，ph7.0-7.3。优选种子培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

进一步，优选所述转化液终浓度组成：l-天冬氨酸钠10g/l，甘油10g/l，氯化钾10g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.5。

本发明所述重组大肠杆菌(escherichiacoli)hect，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno.60398，保藏日期2018年6月28日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)在e.colimg1655中异源表达h.elongata的四氢嘧啶生物合成基因簇ectabc，并通过系统代谢改造切断赖氨酸合成途径，四氢嘧啶的产率提高了134％，得到产四氢嘧啶的工程菌e.colihect。

(2)传统发酵生产四氢嘧啶的菌株，需要依赖高盐的刺激诱导，对设备损耗严重，本发明以l-天冬氨酸钠为底物，全细胞生物催化产生四氢嘧啶，成功实现不依赖高盐的诱导。

(四)附图说明

图1为sds-page分析四氢嘧啶基因簇ectabc在工程菌e.colihect的表达情况；m，蛋白质marker；1:e.colimg1655-1-ptrc99a；2:e.colihect；

图2为hplc检测四氢嘧啶谱图；a:四氢嘧啶标准品；b:e.colihectabc转化液；

图3为不同转化液组成及反应条件对四氢嘧啶制备的影响，a为l-天冬氨酸钠，b为氯化钾，c为甘油，d为反应温度，e为ph值，f为反应时间。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：大肠杆菌四氢嘧啶代谢通路的构建

1.lysa基因的敲出

利用red同源重组基因操作方法

根据e.colimg1655的lysa基因序列和pkd3质粒序列，设计引物lysa-1和lysa-2，以pkd3为模板扩增抗性片段。pcr扩增的程序：30个循环，98℃变性30sec，55℃退火15sec，72℃延伸30sec。

表1pcr扩增体系

表2引物核酸序列

将扩增的抗性片段(核苷酸序列见seqidno.2所示)电转入含有pkd46质粒的e.colimg1655中，涂布于含氯霉素抗性(30μg/ml)平板上，菌落pcr鉴定筛选阳性转化子，即得到lysa敲出菌e.colimg1655-1。

抗性平板组成(g/l)：蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10，琼脂粉20，ph7.4，121℃，1×10⁵pa灭菌20min，待稳定降至50-60℃时，加入终浓度为30μg/ml氯霉素。

2.四氢嘧啶合成基因簇ectabc的合成

查阅文献，h.elongata是报道最多的用于产生四氢嘧啶的细菌，根据genbank中伸长盐单胞菌h.elongata(cgmcc1.6329)的ectabc基因序列，由金唯智(苏州)公司合成，并在5’端分别添加酶切位点ecori和bamhi以及保护碱基。ectabc基因核苷酸序列见seqidno.1所示，目的片段约2500bp。

3.重组质粒ptrc99a-hectabc的构建

使用限制性内切酶ecori和bamhi分别对质粒ptrc99a和目的片段ectabc双酶切3h，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，按照摩尔比3:1混合，用t4dna连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒ptrc99a-hectabc。

4.大肠杆菌中四氢嘧啶代谢通路的构建。

将重组质粒ptrc99a-hectabc通过化转导入到e.colimg1655-1中，得到重组大肠杆菌(escherichiacoli)hect，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno.60398，保藏日期2018年6月28日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，邮编：510075。

将工程菌e.colihect与含ptrc99a空质粒的e.colimg1655-1-ptrc99a于lb培养基，37℃，200rpm培养至od至0.2-0.3时，加入50mg/ml诱导剂iptg。30℃，200rpm培养12h，sds-page分析蛋白表达情况结果见图1。采用iptg诱导重组菌株e.colihect表达产生四氢嘧啶三个酶，sds-page结果显示，均明显看到ecta(21.2kda)，ectb(41.8kda)，ectc(15.2kda)蛋白的表达。

实施例2：工程菌e.colihect发酵制备四氢嘧啶

1.工程菌e.colihect的发酵培养

将工程菌e.colihect、e.colimg1655-1-ptrc99a、e.colimg1655分别接种于种子培养基中进行摇床培养，培养条件：温度37℃，转数200rpm，培养时间12h至对数生长期，获得种子液。种子培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

将种子液以体积浓度10％的接种量到发酵培养基中，于培养温度37℃，200rpm震荡培养至od600为0.6，加入50mg/ml诱导剂iptg，于培养温度30℃，200rpm震荡培养12h，获得发酵液。发酵结束后，发酵液经5000rpm，4℃离心5min，得到菌体。发酵培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph7.0。

2.生物转化制备四氢嘧啶

将6g菌体加入到1l转化液中，调节od600为5，于培养温度40℃，200rpm反应24h。转化液组成：l-天冬氨酸钠10g/l，甘油10g/l，氯化钾10g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.5。

3.hplc检测四氢嘧啶的含量

转化反应结束后，转化液经10000rpm，离心1min，得到转化液，0.22μm的膜过滤。滤液hplc检测四氢嘧啶含量(图2)。hplc检测条件：色谱柱为welchpolarrp-c18(ultimate5μm,250×4.6mm)，流动相为纯水，流速1.0ml/min，柱温度为30℃，检测波长为210nm，进样体积10μl。hplc检测结果表明e.colihect、转化液中四氢嘧啶含量为3.24g/l。而e.colimg1655-1-ptrc99a、e.colimg1655转化液中均未检测到四氢嘧啶。

实施例3：全细胞生物催化体系的优化

离心收集实施例1步骤1发酵12后的菌体，用pbs缓冲液重悬菌体至od600＝5，分别在实施例2的基础上考察不同转化液组成及反应温度和时间对制备四氢嘧啶的影响，根据实施例2转化液(l-天冬氨酸钠10g/l，甘油10g/l，氯化钾10g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.5)，每次考察一个元素的影响，其余元素浓度不变。

l-天冬氨酸钠(5，10，20，40，80g/l)，氯化钾(0，5，10，20，40g/l)，甘油(5，10，20，40，80g/l)，ph值(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)，反应温度(25，30，35，40，45℃)，反应时间(6，12，18，24，36，48h)。

结果如图3所示，最佳的全细胞生物催化体系为l-天冬氨酸钠10g/l，甘油10g/l，氯化钾10g/l，溶剂为pbs缓冲溶液，ph6.5，反应温度40℃，反应24h。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2506

<212>dna

<213>伸长盐单胞菌(halomonaselongata)

<400>1

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<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

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