重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用的制作方法

本发明涉及一株表达藻类来源的血红素加氧酶-1的基因重组大肠杆菌，以及该菌株在生物转化血红素制备胆绿素中的应用。

(二)

背景技术：

胆绿素(biliverdin，cas：114-25-0)是由血红素经血红素加氧酶(hemeoxygenase-1，ho-1)水解开环而得到的一种线性四吡咯环物质(反应式见图1)，因其呈深绿色而得名。在脊椎动物细胞内，血红素在ho-1的水解作用下，在α-亚甲基桥处开环形成胆绿素ixα异构体，因此，胆绿素一般就是指胆绿素ixα。

胆绿素不仅仅是血红素代谢循环系统的一个中间代谢物，更重要的是它能启动一系列的抗炎、抗氧化和免疫调节等生理作用，如可以改善肝功能、降低丙氨酸转氨酶、减轻因肝脏移植导致的缺血再灌注损伤，抑制新生血管内膜形成的血管重塑，以及抑制牛腹泻病毒复制等功能。因此，胆绿素作为临床药物使用的潜力巨大。所以，近年来，如何高效制备胆绿素一直是科研人员关注的热点。

目前，制备胆绿素主要有提取法、化学转化法、酶转化法和生物合成法。提取法是直接从三文鱼胆汁或鸸鹋蛋壳中提取胆绿素，存在的问题是原料来源不足，难以工业化应用；化学转化法是利用胆红素脱氢制备，但该方法存在2个问题：①需要价格高的胆红素作为底物，原料来源困难；②胆红素提取自哺乳动物的胆汁，而且需在酸性条件下，这使胆红素形成多种异构体，从而导致产物胆绿素ixα的收率和纯度较低；也有采用化学氧化血红素法制备胆绿素的报道，同样产生较多的异构体，收率较低；酶转化法制备胆绿素的报道是美国的一项专利，将来自蓝藻的ho-1基因重组到酵母细胞中，表达ho-1，再以血红素作为底物，全细胞生物转化制备胆绿素，该方法的优点是异构体少，但该专利未报道产率情况。生物合成法的报道是于2012年，美国犹他州立大学的chen和takemoto将蓝藻的ho-1基因重组到大肠杆菌，重组大肠杆菌全细胞能够合成胆绿素，胆绿素产率可达23.5mg/l，即便如此，产率仍然相对较低。可以看出，目前缺乏经济有效的胆绿素制备方法。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株表达集胞藻(synechocystissp.)的胞内活性血红素加氧酶-1基因(ho-1)的基因重组大肠杆菌，经诱导表达培养后，在培养液中加入氯化血红素作为底物，在胞内ho-1的催化作用下，用于生物转化法制备胆绿素，获得相对较高的胆绿素收率，为胆绿素的生产提供新方法。

本发明的采用的技术方案是：

本发明提供一株表达胞内活性血红素加氧酶-1基因(ho-1)的重组大肠杆菌(escherichiacoli)zjut-ho1菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

所述大肠杆菌zjut-ho1菌株的构建方法包括以下步骤：

(1)以集胞藻(synechocystissp.)pcc6803总rna逆转录得到的双链cdna为模板，设计引物p1和p2，引入限制性内切酶ndeⅰ和xhoⅰ的酶切位点，pcr扩增获得目的基因ho1序列，所述的基因ho1的核苷酸序列见seqidno:1。

所述的引物p1和p2分别为：

p1：5′-gggaattccatatgagtgtcaacttagc-3′

p2：5′-ccgctcgagctagccttcggag-3′

(2)pcr产物3′端加碱基a后连接pucm-t质粒载体，转化大肠杆菌dh5α菌株，提取阳性克隆的质粒，经双酶切和测序验证，成功构建克隆载体pucm-t-ho1。

(3)pucm-t-ho1与pet-28a质粒分别经ndei和xhoi双酶切后，目的基因ho1和开环pet-28a经t4dna酶连接后，转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，提取阳性克隆的质粒，经双酶切和测序验证，成功构建表达载体pet-28a-ho1。

(4)重组ho1的大肠杆菌bl21(de3)菌株，于50μg/ml卡那霉素的lb培养基中培养2h(od600≈0.8)，加入终浓度为0.5mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导培养20h，收集菌体，经sds-page蛋白电泳分析，重组菌表达了分子量为29kd的蛋白，与ho-1分子量大小一致；经分离纯化获得ho-1，酶活测定表明具有转化血红素为胆绿素活力，表达ho-1的基因重组大肠杆菌构建成功。

本发明还涉及一种重组大肠杆菌zjut-ho1在生物转化血红素制备胆绿素中的应用，具体所述的应用方法为：以重组大肠杆菌zjut-ho1经诱导培养获得的培养液为反应介质，以氯化血红素为底物构成反应体系，于25～40℃、100～200r/min(优选37℃、180r/min)恒温振荡摇床中培养至转化完全，将反应液分离纯化，获得胆绿素；所述培养液od600＝1.40～1.65，所述底物在培养液中的终浓度为100-200mg/l(优选200mg/l)；所述氯化血红素以2g/l氯化血红素水溶液的形式加入，所述2g/l氯化血红素水溶液的配制方法为：100mg氯化血红素微热溶解50ml质量浓度0.25％na2co3水溶液，即得2g/l的氯化血红素水溶液。

进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液经8000～1000g离心5～10min(优选1000g，10min)，收集菌体，菌体用等同反应体系体积的酸性甲醇悬浮，于40℃、100khz、200w条件下超声30min，8000～1000g离心5～10min(优选1000g离心5min)，收集上清液；上清液于45℃下减压蒸干后，加入原反应体系1/4～1/5体积的酸性甲醇溶解残留物，用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，即得胆绿素；所述的酸性甲醇是在体积浓度95％甲醇水溶液中，加入1/1000体积比的质量浓度36％浓盐酸制成。

进一步，所述重组大肠杆菌zjut-ho1诱导培养方法为：

(1)将重组大肠杆菌zjut-ho1接种于含50μg/ml卡那霉素的lb斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体；所述的lb斜面培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph7.4，121℃灭菌15min；

(2)挑取斜面菌体2环，接种到含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，于30～35℃、150～200r/min的恒温振荡摇床培养10～12h(优选30℃、180r/min、12h)，获得种子液；所述的lb培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.4，121℃灭菌15～20min；

(3)按体积浓度1％～5％(优选3％)的接种量，将步骤(1)种子液接种至含50μg/ml卡那霉素甘油培养基(gy)，35～37℃、100～200r/min(优选37℃、180rmp)培养至菌浓od600＝0.5～1.2时，加入终浓度为0.1～0.5mmol/l(优选0.5mmol/l)的iptg，25～30℃、100～150r/min培养4～8h(优选30℃、100rpm、6h)，至od600＝1.40～1.65，获得培养液；所述的gy培养基终浓度组成为：甘油15～20g/l，酵母浸出粉15～20g/l，nh4so43～5g/l，nacl3～5g/l，na2hpo410～15g/l，kh2po43～5g/l，mgso40.3～0.5g/l，溶剂为去离子水，ph自然，121℃灭菌15～20min；优选所述的gy培养基组成为：甘油20g/l，酵母浸出粉20g/l，nh4so45g/l，nacl5g/l，na2hpo415g/l，kh2po43g/l，mgso40.5g/l，溶剂为去离子水，ph自然。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明克隆了集胞藻的ho-1编码基因，与表达载体连接，构建得到含该基因的重组质粒pet-28a-ho1，再转入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌表达胞内活性的ho-1，可以利用重组大肠杆菌为ho-1酶源，以氯化血红素为底物，生物转化法制备胆绿素，为胆绿素的生产提高新途径。相比于现有的同类技术，本发明将原核生物来源的ho1在原核生物的大肠杆菌中表达，具有ho-1活性高、培养周期短等优点，并以氯化血红素为底物，使胆绿素的产率有大幅度提高，是重组大肠杆菌全细胞合成法的2.6倍。

(四)附图说明

图1血红素生物转化为胆绿素的反应式示意图。

图2pcr扩增ho1的电泳图(m：marker；1,2：pcr产物)。

图3阳性克隆载体pucm-t-ho1经ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后电泳图(m：marker；1：载体经双酶切)。

图4阳性表达载体pet-28a-ho1经ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后电泳图(m：marker；1：载体经双酶切)。

图5zjut-ho1菌株诱导表达ho-1的sds-page电泳图(m：marker；1：bl21(de3)/pet-28a；2：bl21(de3)/pet-28a-ho1)。

图6氯化血红素的质量浓度-a610标准曲线。

图7zjut-ho1菌株在优选条件下表达ho-1的sds-page电泳图(m：marker；1：阴性对照；2：细胞裂解液；3：经ni-nta柱分离的ho-1)。

图8zjut-ho1菌株生物转化氯化血红素为胆绿素的hplc分析图谱。

图9制备的胆绿素样品紫外吸收光谱图。

图10制备的胆绿素的ls-ms分析图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

下列实施例中，如未说明具体的实验方法，均按照常规分子生物学实验方法操作，如f.m.奥斯伯主编《精编分子生物学实验指南》(马学军译，第五版，科学出版社，2008)中所述的方法，或按照试剂盒生产商建议方法操作。

实施例1表达ho-1的基因重组大肠杆菌构建

本发明所述的表达ho-1的重组大肠杆菌zjut-ho1菌株，按以下步骤构建：

(1)用“trizoluniver总rna提取试剂”，提取集胞藻pcc6803的总rna后，用“amv第一链cdna合成试剂盒”，rt-pcr法合成第一链cdna。

(2)以步骤(1)获得的cdna为模板，设计引物p1和p2，引入限制性内切酶ndeⅰ和xhoⅰ酶切位点，pcr扩增ho-1的基因(ho1)序列，pcr产物经“sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒”纯化，获得目的基因ho1序列，所述的基因ho1的核苷酸序列见seqidno:1。

所述的引物p1和p2分别为：

p1：5′-gggaattccatatgagtgtcaacttagc-3′

p2：5′-ccgctcgagctagccttcggag-3′。

所述的pcr扩增目的基因ho1的体系见表1。

表1扩增ho1基因的pcr体系

所述的prc扩增反应过程为：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环后，72℃延伸10min。

pcr扩增产物经电泳检测(图2)，在750bp左右可以观察到单一的条带，与目的片段(723bp)大小一致。

(2)因primestarmaxdna聚合酶扩增出的pcr产物为平末端，用“平端dna片段添da试剂盒”为pcr产物3′端加碱基a后，连接pucm-t载体，转化大肠杆菌dh5α菌株，提取阳性克隆的质粒，经ndei和xhoi双酶切鉴定，电泳图见图3，可以观察到在750bp处切下了条带单一明显的片段，经测序验证，成功构建了克隆载体pucm-t-ho1。

(3)pucm-t-ho1与pet-28a质粒分别经ndei和xhoi双酶切后，目的基因ho1和开环pet-28a经t4dna连接酶连接，转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，提取阳性克隆的质粒，电泳图见图4，可以观察到在750bp处切下了条带单一明显的片段，经测序验证，成功构建表达载体pet-28a-ho1，获得重组大肠杆菌bl21(de3)菌株(表示为bl21(de3)/pet-28a-ho1)。

(4)重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-28a-ho1菌株，用lb培养基37℃培养2h(od600为0.767)，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，30℃诱导培养20h，收集菌体，经sds-page蛋白电泳分析(图5)，重组菌表达了分子量为29kd的蛋白，与ho-1分子量大小一致。经分离纯化获得ho-1，酶活测定表明其具有转化血红素为胆绿素活力，比活力为2.68×10⁴u/mg蛋白，说明表达ho-1的基因重组大肠杆菌构建成功。

表达ho-1的基因重组大肠杆菌编号为zjut-ho1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmccno:60372，保藏日期2018年5月18日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

所述的trizoluniver总rna提取试剂、amv第一链cdna合成试剂盒、t载体pcr产物克隆试剂盒、平端dna片段添da试剂盒、限制性内切酶ndeⅰ和xhoⅰ、t4dna连接酶、质粒载体pucm-t和pet-28a、大肠杆菌dh5α菌株和bl21(de3)菌株、primestarmaxdna聚合酶、sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒、dna凝胶回收试剂盒、质粒小量制备试剂盒等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

所述的ho-1分离方法，按以下步骤操作：

(1)重组大肠杆菌bl21(de3)/pet-28a-ho1的培养液，于4℃、8000g离心10min，弃上清，用pbs缓冲液(20mmol/l)悬浮菌体，再次离心收集菌体，重复2次。

(2)每100ml培养液的菌体用5ml结合缓冲液(20mmol/lpbs缓冲液，ph8.0，添加500mmol/lnacl和10mmol/l咪唑)，冰浴条件下超声破碎细胞(工作2s，间隔3s，共进行200次，功率200w)。细胞破碎后4℃、10000g离心5min，上清经millex-hv0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液，作细胞裂解液。

(3)ni-nta柱(1cm×5cm)经蒸馏水冲洗后，用平衡缓冲液(20mmol/lpbs缓冲液，ph8.0，添加500mmol/lnacl)平衡30min，确定流出液a280为0开始上样(步骤(2)滤液)，流速为1ml/min。

(4)上样结束后，用洗脱缓冲液(20mmol/lpbs缓冲液，ph6.5，添加500mmol/lnacl和200mmol/l的咪唑)洗脱，收集流出峰，在ph6.5的pbs缓冲液(20mmol/l)中透析除去咪唑(透析袋截留分子量3.5kda)，即得纯化的ho-1酶液。

所述的ho-1酶活测定方法为：在ep管中加入2g/l氯化血红素水溶液120μl，加入浓度为1g/lnadph水溶液200μl和大肠杆菌bl21(de3)细胞裂解液300μl(按照步骤(2)方法收集的大肠杆菌bl21(de3)滤液)，加入经纯化的ho-1酶液1ml，补ph8.0的pbs缓冲液(20mmol/l)至3ml，轻轻混匀，以不加氯化血红素溶液的相同处理为参比，测定a610(a1)。ep管37℃避光水浴15min后，立刻测定a610(a2)，a＝a1-a2，依据氯化血红素质量浓度-a610的标准曲线，由a值计算被转化的氯化血红素质量，依据ho-1活力定义计算其酶活。所述的氯化血红素质量浓度-a610标准曲线以氯化血红素水溶液浓度为横坐标，以a610为纵坐标制成，见图6。

ho-1的活力定义：在上述条件下，以1min转化1μmol氯化血红素所需的酶量(ml)为一个活力单位(u)。

实施例2：重组大肠杆菌zjut-ho1菌株表达ho-1的优选条件

在实施例1获得能表达ho-1大肠杆菌zjut-ho1菌株的基础上，对该菌株表达ho-1的培养条件进行了优化，包括培养基的种类、诱导剂添加的时间、诱导培养的时间、诱导剂添加的浓度、诱导培养的温度。经过优化，ho-1的表达量显著提高，优选的zjut-ho1菌株表达ho-1工艺步骤如下：

(1)冷冻干燥或甘油冷冻保藏的zjut-ho1菌种，接种于含50μg/ml卡那霉素的lb斜面培养基，于37℃恒温培养24h，获得斜面菌体；所述的lb斜面培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，琼脂20g/l，溶剂为去离子水，ph7.4，121℃灭菌15min。

(2)挑取zjut-ho1菌株斜面培养的菌体2环，接种到含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，于30℃、180r/min的恒温振荡摇床培养12h，获得种子液。所述的lb培养基终浓度组成为：酵母浸出粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，溶剂为去离子水，ph7.4，250ml三角烧瓶装50ml培养基，八层纱布扎口，121℃灭菌20min。

(3)按体积分数3％的接种量，将步骤(2)种子液接种至含50μg/ml卡那霉素甘油(gy)培养基，37℃、180r/min培养时间2h，菌浓od600＝0.8±0.3时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，于30℃、100r/min继续培养6h，至od600＝1.40～1.65，获得含重组大肠杆菌zjut-ho1湿菌体的培养液(即zjut-ho1培养液)。所述的gy培养基组成为：甘油20g/l，酵母浸出粉20g/l，nh4so45g/l，nacl5g/l，na2hpo415g/l，kh2po43g/l，mgso40.5g/l，溶剂为去离子水，ph自然(实测7.2)，250ml三角烧瓶装100ml培养基，八层纱布扎口，121℃灭菌20min。

按实施例1中所述的方法，采用ni-nta柱分离纯化重组大肠杆菌zjut-ho1表达的ho-1，培养液的ho-1活力为65.0u/ml。蛋白收率占细胞总蛋白的10.9％，表明zjut-ho1菌株，在上述优选的培养条件下，能高效地表达ho-1，sds-page分析图见图7。

实施例3大肠杆菌zjut-ho1应用于生物转化血红素制备胆绿素

在实施例2的基础，培养表达ho-1的zjut-ho1菌体，用于生物转化血红素制备胆绿素，具体步骤如下：

(1)按实施例2方法，经ho-1表达培养的zjut-ho1培养液(od600＝1.40～1.65)中，加入2g/l的氯化血红素水溶液使氯化血红素终浓度为200mg/l，继续于37℃、180r/min恒温振荡摇床中培养5h。氯化血红素水溶液的配制方法为：100mg氯化血红素微热溶解50ml质量浓度0.25％na2co3水溶液，即得2g/l的氯化血红素水溶液。

(2)步骤(1)的反应体系经1000g离心10min，收集菌体，此时菌体呈深绿色。菌体用等同反应体系体积的酸性甲醇悬浮，于40℃、100khz、200w条件下超声30min，再1000g离心5min，收集上清液。

(3)上清液于45℃下减压蒸干，加入原反应体系1/4～1/5体积的酸性甲醇溶解残留物；酸性甲醇溶液经滤纸过滤后，再于45℃下减压干燥，即得胆绿素。

所述的酸性甲醇是在95％甲醇中，加入1/1000体积比的质量浓度36％浓盐酸。

按上述方法，zjut-ho1菌株生物转化血红素为胆绿素，单位反应液获得胆绿素的得率为61.7mg/l，氯化血红素的摩尔转化率为34.5％。

制备的胆绿素样品hplc分析图谱见图8，紫外吸收光谱图见图9，lc-ms分析图谱见图10。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>723

<212>dna

<213>集胞藻(synechocystissp.)

<400>1

atgagtgtcaacttagcttcccagttgcgggaagggacgaaaaaatcccactccatggcg60

gagaacgtcggctttgtcaaatgcttcctcaagggcgttgtcgagaaaaattcctaccgt120

aagctggttggcaatctctactttgtctacagtgccatggaagaggaaatggcaaaattt180

aaggaccatcccatcctcagccacatttacttccccgaactcaaccgcaaacaaagccta240

gagcaagacctgcaattctattacggctccaactggcggcaagaagtgaaaatttctgcc300

gctggccaagcctatgtggaccgagtccggcaagtggccgctacggcccctgaattgttg360

gtggcccattcctacacccgttacctgggggatctttccggcggtcaaattctcaagaaa420

attgcccaaaatgccatgaatctccacgatggtggcacagctttctatgaatttgccgac480

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