一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用与流程

本发明涉及一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用，属于生物降解领域和基因工程领域。

背景技术：

多环芳烃是指分子中含有2个或2个以上苯环的碳氢化合物，如萘、蒽、菲、芘、联苯、三联苯等。多环芳烃广泛存在于土壤、水体和空气中，水溶性差、具有热稳定性，而且其中相当的一部分都具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人类健康和生态环境造成了巨大危害，是环境中一类危险而需重点研究的化合物。多环芳烃在环境中的归宿包括挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸附及微生物降解等，研究表明，微生物降解在该污染物的迁移转化乃至最终从环境中消失的过程中占有重要的地位，是环境中多环芳烃去除最主要的途径。随着多环芳烃带来的环境污染问题日益突出，相关研究不断深入，研究的重点已经从一般寻找降解污染物的微生物转入以基因工程技术为基础构建高效降解多环芳烃的基因工程菌株。

假单胞菌拥有极为复杂的酶系统，具有降解利用多种复杂有机物的潜力，假单胞菌的菌株几乎可以降解现有的任何复杂有机物，降解这类物质的基因多数是在质粒上的，通常的过程是由质粒编码的酶，通过脱氢、加氧、水解、脱羧等作用，将复杂的有机物降解为相对简单的物质，最终转变为短链的脂肪酸进入三羧酸循环，产生能量、二氧化碳和水。但是多环芳烃污染物降解存在两个限速步骤，初步开环和最后一步环裂解，所以在野生菌中通常这一降解过程进行缓慢，难以满足环境保护的需要。为改善假单胞菌降解多环芳烃的能力，可以通过强化该菌限速步骤的酶，来实现较高的降解能力。但假单胞菌的转化较困难，利用热激转化率较低，为获得高的转化效率更多的研究者倾向于使用接合或者电击转化的方法将质粒引入受体菌。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用，使得菌株可以对多环芳烃污染物进行更高效率地降解。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种多环芳烃降解工程菌，其特征是pbbr1mcs-5-oprl-cata2表达载体通过在广宿主质粒插入编码环裂解双加氧酶的降解基因和相关启动子oprl基因构建得到，再将表达载体导入受体菌株铜绿假单胞菌sa1得到一种多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌ph2。

所述的铜绿假单胞菌sa1筛选自石油污染土壤，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年2月18日，保藏编号cgmccno.12142，保藏名称铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述的多环芳烃编码基因的序列，设计特异性引物：

cataf：5’-atgaccgtgaagatatctcacac-3’，

catar：5’-ttagatttcttgcaaggctctcg-3’。

本发明的多环芳烃降解工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)从铜绿假单胞菌sa1中克隆得到编码环裂解双加氧酶的降解基因——cata2基因，核苷酸序列如seqidno.1所示；特异性oprl启动子核苷酸序列如seqidno.2；选择广宿主质粒pbbr1mcs-5为载体；cata2基因和oprl启动子分别克隆至pbbr1mcs-5载体中，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2；

(2)利用铜绿假单胞菌sa1作为宿主，将重组载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2通过电击法转化入铜绿假单胞菌种，构建得到多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌ph2。

本发明的多环芳烃降解工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用。

具体说明如下：

本发明提供了一种多环芳烃降解工程菌，该工程菌株包括铜绿假单胞菌sa1、转入假单胞菌的表达载体、相关启动子和参与多环芳烃降解过程的关键基因。作为优选，多环芳烃降解的关键基因为编码多环芳烃环裂解双加氧酶的基因。

pbbr1mcs-5质粒购买自淼灵生物科技有限公司。

本发明还提供了所述基因工程菌在多环芳烃污染物降解中的应用，所述应用方法：

(1)将铜绿假单胞工程菌株ph2活化后，将菌液接种到含有多环芳烃的培养基中进行降解。

(2)降解5-9天后，分析工程菌株对多环芳烃污染物的降解情况。

本发明的优点表现为：铜绿假单胞菌本身就具有对多环芳烃的降解能力，构建的基因工程菌具有更好的降解能力，且具有如下特性：能够表达较高的多环芳烃环裂解双加氧酶活性；降解基因和特异性启动子的导入提高了菌株对多环芳烃的降解能力。这为以后多环芳烃污染物的降解修复提供了新方法，为菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。

附图说明

图1是重组载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2构建示意图；

图2是从铜绿假单胞菌中克隆得到cata2特异性条带。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明：

本发明还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)从铜绿假单胞菌sa1中克隆得到编码环裂解双加氧酶的降解基因——cata2基因，核苷酸序列如seqidno.1所示；作为优选，特异性oprl启动子核苷酸序列如seqidno.2；作为优选，选择广宿主质粒pbbr1mcs-5为载体。cata2基因和oprl启动子分别克隆至pbbr1mcs-5载体中，转入受体细胞中克隆扩增，筛选阳性克隆得到目标重组载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2(如图1所示)：①将降解基因cata2，通过pcr方法在片段两端分别加上hindⅲ和xbaⅰ酶切位点，同样将pbbr1mcs-5质粒使用fastdigest内切酶hindⅲ和xbaⅰ进行酶切，连接转化提质粒得到表达载体pbbr1mcs-5-cata2；②将合成得到的oprl基因，通过pcr方法在片段两端分别加上kpnⅰ和hindⅲ酶切位点，同样将pbbr1mcs-5-cata2质粒使用fastdigest内切酶kpnⅰ和hindⅲ进行酶切，连接转化提质粒得到表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2；

(2)利用铜绿假单胞菌sa1作为宿主，将重组载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2通过电击法转化入铜绿假单胞菌种，构建得到多环芳烃降解工程菌——工程铜绿假单胞菌ph2。

实施例1从铜绿假单胞sa1中克隆cata2基因

(1)提取铜绿假单胞sa1的全基因组和质粒；

(2)根据编码多环芳烃环裂解酶的降解基因序列，设计特异性引物以特异性性引物cataf和catar。

cataf：5’-atgaccgtgaagatatctcacac-3’

catar：5’-ttagatttcttgcaaggctctcg-3’

以基因组和质粒为模板，扩增得到一段900bp左右特异性条带，如图2所示，大小符合cata2基因大小；

(3)将扩增产物送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果见seqidno.1所示。将测序结果和编码多环芳烃环裂解酶的cata2基因进行比对，结果表明两者序列完全一致，则可以确定从菌株sa1中克隆得到了cata2基因。

实施例2重组表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2的构建

(1)将降解基因cata2，通过pcr方法在片段两端分别加上hindⅲ和xbaⅰ酶切位点，使用fastdigest内切酶hindⅲ和xbaⅰ进行酶切，反应体系为：5μl10*fdbuffer，2.5μlhindⅲ、2.5μlxbaⅰ、30μl加酶切位点的cata2基因和10μl超纯水。反应条件为：37℃，1h。同样将pbbr1mcs-5质粒使用fastdigest内切酶hindⅲ和xbaⅰ进行酶切，pcr纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的cata2基因和pbbr1mcs-5质粒进行连接反应。反应体系为：1μl10*t4dnaligasebuffer，1μlt4dnaligase，6μl酶切后的核苷酸片段和2μl酶切后的prsfduet质粒。反应条件为：22℃，10min。酶切连接后转化感受态细胞e.colidh5α，菌落pcr筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到表达载体pbbr1mcs-5-cata2；

(2)将合成得到的oprl基因，通过pcr方法在片段两端分别加上kpnⅰ和hindⅲ酶切位点，使用fastdigest内切酶kpnⅰ和hindⅲ进行酶切。同样将pbbr1mcs-5-cata2质粒使用fastdigest内切酶kpnⅰ和hindⅲ进行酶切，pcr纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的oprl基因和pbbr1mcs-5-cata2质粒进行连接反应。酶切连接后转化感受态细胞e.colidh5α，菌落pcr筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2。

实施例3重组载体转化至铜绿假单胞菌sa1中

重组表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2转化到铜绿假单胞底盘菌株sa1中的详细构建步骤如下：

(1)将重组表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata22.5μl，加入到50μl铜绿假单胞菌sa1感受态细胞中，轻轻吹打混匀；

(2)将混合物加入2mm的电转杯中，2.5kv电击5-6ms。然后迅速加入1ml无抗lb培养基中，37℃，200rpm复苏2h后涂布庆大霉素抗性的lb固体培养基平板，37℃过夜培养；

(3)挑选菌落pcr验证的阳性转化子到5mllb培养基中过夜培养，得到工程铜绿假单胞菌ph2，保存菌株。

实施例4工程铜绿假单胞菌酶活检测验证

为检验工程铜绿假单胞菌是否按照预期表达酶活，测定其多环芳烃环裂解双加氧酶活性，具体步骤如下：

(1)将铜绿假单胞菌接种到5ml液体lb培养基中，30℃，220rpm培养过夜。培养液在4℃条件下，12,000rpm高速离心15min，弃去上清液将离心管中沉淀使用冰冷的浓度为0.1mm磷酸缓冲液(ph＝7.5)清洗两次并进行重悬。在冰水浴中超声破碎悬浮液。超声破碎条件为：99次循环，每次3s，振荡3s，功率为120w。经超声破碎处理后的悬浮液在4℃条件下，12,000r/min离心30min，离心后得到的上清液即为粗酶提取液。

(2)多环芳烃环裂解双加氧酶活性的测定通过分光光度法测定。500μl酶活测定体系：粗酶提取液50μl，1mmedta20μl，20mm邻苯二酚10μl，30mmna2hpo4缓冲液420μl，在2ml体系中进行酶分析。反应开始后每过15秒进行读数。测定多环芳烃环裂解双加氧酶活时，紫外可见光分光光度计选择波长为260nm，通过对其催化产物顺-粘糠酸的产量进行测定以获得酶活。

(3)通过bradford法用小牛血清白蛋白作为标准蛋白质测定粗蛋白质的浓度。酶活以每毫克蛋白每分钟引起顺-粘糠酸氧化的μmol表示，并且活性以(u/mg)单位表示。

多环芳烃环裂解双加氧酶活性测定结果为：铜绿假单胞sa1的多环芳烃环裂解酶活性为6.53u/mg，工程铜绿假单胞菌的多环芳烃环裂解酶活性为3.34u/mg是未改造之前酶活的2.66倍。这些结果表明，以上结果表明，携带含有oprl启动子和cata基因的表达载体pbbr1mcs-5-oprl-cata2的工程铜绿假单胞菌株具有更高的多环芳烃环裂解酶双加氧酶活性，说明oprl启动子有效增强了cata2基因在工程菌株的表达。

实施例5利用工程铜绿假单胞菌对多环芳烃菲进行降解修复

(1)在含有100mg/l菲的100ml无机盐培养基中进行假单胞菌对多环芳烃菲的降解实验。将2ml新鲜菌液加入到摇瓶中，在35℃，200rpm摇床中培养9天。

(2)培养9天后，用正己烷萃取培养基中底物，在萃取前，在每个摇瓶中加入芘作为内标，每瓶萃取2次，萃取液取至烧杯中，烧杯放在通风橱中等待正己烷挥发完全。待正己烷完全挥发，用色谱纯二氯甲烷稀释至1000-5000ppm，无水na2so4干燥，并通过0.22μm有机系膜过滤，之后装入2ml进样瓶中，待测。

(3)使用气相色谱测定工程铜绿假单胞菌对多环芳烃菲的降解率。

降解率测定结果为：铜绿假单胞菌sa1在菲的无机盐培养基中对菲的降解率为40.32％，而工程铜绿假单胞菌对菲的降解率提升到58.32％。这些结果表明，铜绿假单胞菌sa1具有降解多环芳烃污染物的能力，且改造后的工程铜绿假单胞菌降解能力有了大幅地提升。

实施例6模拟多环芳烃污染自然环境利用工程铜绿假单胞菌对菲进行降解修复

因为石油污染经常伴随多环芳烃污染，因此通过石油和多环芳烃菲模拟多环芳烃污染自然环境。在含有100mg/l菲+2％(w/v)石油的100ml无机盐培养基中进行工程铜绿假单胞菌对多环芳烃菲的降解实验。具体操作方法类似实施例5，使用气相色谱测定工程铜绿假单胞菌对多环芳烃菲的降解率。

降解率测定结果为：铜绿假单胞菌sa1在菲和石油的无机盐培养基中对菲的降解率为42.14％，而工程铜绿假单胞菌对菲的降解率提升到65.73％，为未改造之前降解率的1.56倍。这些结果表明，铜绿假单胞菌sa1在模拟的多环芳烃污染自然环境中，也具有降解多环芳烃污染物的能力，且改造后的工程铜绿假单胞菌降解能力有了大幅地提升。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

seqidno.1

ttagatttcttgcaaggctctcggacgagagctgcgctgctcagcggtcgcttctggagctgcttgcagctggaaatcaaaattcagctctgcgtaacggcctggcacaccacgcgcaccatcctctcggaagacaatctctccaaccaacccatcacgagtggcataggcgaaatcgtcccagaggtatttctctccagacaagttgatttgtgtagtcaggtggcggtgaccaggtgccgagatgaagaagtgaatatgcgccggtcgctgcccatgccggccaagcagatccagacactcctgggttggcccttgaggatcgcacccatagccggatggcacaatggagcgggcacggtagcgtccctccgcatctgtgatgattcgccgacgcagattgtattcagattggctctgatcgaagaacgagtatgtgccacaagtgttggcatgccacagatccacggtagcgccttcaactggcttcccgttcggatccagaacctggccttccaggaacatcactgtggccttgtgctcttccgcgccatcgtccatacgtacttcgccgtgagctatcggcgcacccgcgacatagagtgggccttcaatggtgcgtggcgtgccaccagtgtggccagcctgagcatccttggcgtcttgcaacaggtcgaggaagtgctcaatgccaagccctgcaaccagaagaccagcttctccacggccacctagacgattcagataatcaactgcgaaccagaattcatcttctgtgatttccaggtcttcgatcagtcgcgcggtgtcttgcaagacccgtaggatgatacttttgatgcgagggttgccttcagcgttgccgaaaccggcagcctcttcaaaaaatttatgaatatcggcagtgtgagatatcttcacggtcat

seqidno.2

atggaaatgctgaaattcggcaaatttgctgcgctggctctggccatggctgtggctgtgggttgctcctccaagggcggcgatgcttccggtgaaggtgccaatggcggcgtcgacccgaacgcaggctatggcgccaacagcggtgccgttgacggcagcctgagcgacgaagccgctctgcgtgcgatcaccaccttctacttcgagtacgacagctccgacctgaagccggaagccatgcgcgctctggacgtacacgcgaaagacctgaaaggcagcggtcagcgcgtagtgctggaaggccacaccgacgaacgcggcacccgcgagtacaatatggctctgggcgagcgtcgtgccaaggccgttcagcgctacctggtgctgcagggtgtttcgccggcccagctggaactggtttcctatggtaaagagcgtccggtcgctaccggccacgacgagcagtcctgggctcagaaccgtcgcgtcgagctgaagaagtaa

序列表

<110>天津大学

<120>一种多环芳烃降解工程菌及其工程改造方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>927

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttagatttcttgcaaggctctcggacgagagctgcgctgctcagcggtcgcttctggagc60

tgcttgcagctggaaatcaaaattcagctctgcgtaacggcctggcacaccacgcgcacc120

atcctctcggaagacaatctctccaaccaacccatcacgagtggcataggcgaaatcgtc180

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cgagatgaagaagtgaatatgcgccggtcgctgcccatgccggccaagcagatccagaca300

ctcctgggttggcccttgaggatcgcacccatagccggatggcacaatggagcgggcacg360

gtagcgtccctccgcatctgtgatgattcgccgacgcagattgtattcagattggctctg420

atcgaagaacgagtatgtgccacaagtgttggcatgccacagatccacggtagcgccttc480

aactggcttcccgttcggatccagaacctggccttccaggaacatcactgtggccttgtg540

ctcttccgcgccatcgtccatacgtacttcgccgtgagctatcggcgcacccgcgacata600

gagtgggccttcaatggtgcgtggcgtgccaccagtgtggccagcctgagcatccttggc660

gtcttgcaacaggtcgaggaagtgctcaatgccaagccctgcaaccagaagaccagcttc720

tccacggccacctagacgattcagataatcaactgcgaaccagaattcatcttctgtgat780

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atggaaatgctgaaattcggcaaatttgctgcgctggctctggccatggctgtggctgtg60

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aaccgtcgcgtcgagctgaagaagtaa507