扩大T细胞的方法与流程

本申请要求美国临时申请序号61/569,577的优先权，其被引入本文作为参考。本发明涉及扩大t细胞——如自体t细胞、其衍生的细胞群——的新方法、包括所述细胞群的药物组合物和该细胞和组合物用于治疗——特别是治疗或预防病毒感染和/或癌症，例如，免疫抑制或免疫活性人患者——的应用。
背景技术：
：虽然病毒被广泛公认是感染性疾病的病因，某些病毒也与人癌症有关。人免疫系统是控制病毒感染以及显示与致癌性病毒相关的恶性肿瘤的中心。在构成人免疫系统的细胞、抗体和免疫调节分子的复杂排列中，胸腺起源的淋巴细胞(t细胞)对于控制病毒感染和癌症具有中心作用。因此，一种预防或治疗病毒感染和癌症的方法已被采用，从这些患者采集t细胞，并将其在体外刺激和/或扩大，然后将其输回患者体内。体内t细胞激活和抗原特异性扩大通常被认为源自两个信号过程，其中第一信号通过t细胞受体/cd3复合物与递呈肽抗原的主要组织相容性复合物i类或ii类分子(mhci类或mhcii类)的连接而产生。mhci类或mhcii类和肽复合物在细胞(抗原递呈细胞或apc)表面上表达。肽抗原源自进行内生过程的细胞中的分子，并且可以是(1)体内天然存在的“自身”抗原；(2)源自癌症相关突变的肿瘤抗原；或(3)与感染或癌症相关的病毒抗原；等等。t细胞受体识别抗原被认为是第一信号，而第二信号产生自t细胞上另外的表面分子与apc上另外的分子的连接所造成的共同刺激。可能需要t细胞和apc之间的这些共同刺激分子的上调和连接来引起或促进t细胞激活，因为单独的第一信号可能不足以将此实现。这两种信号激活可导致t细胞扩大，使得更大量的抗原特异性t细胞可被利用，以控制引起免疫应答的病原或癌症。对这两种信号激活的权威理解基于相同的apc，其为响应t细胞提供第一信号和第二信号，使得共同刺激与抗原识别直接相关。t细胞的体外激活和扩大一直是漫长的、复杂的和资源密集型的过程。一般的方法可例如耗时8-12周，并且通常利用活“靶”病毒和/或病毒载体来实现抗原递呈细胞(apc)的抗原递呈。通常，t细胞激活/扩大需要静态条件，而非搅拌或物理搅动培养系统。培养识别eb病毒(epsteinbarrvarus，ebv)的lmp1和lmp2抗原的抗原特异性t细胞的一个现有技术方法可概括如下：预备步骤·为了以可控方式实现两信号t细胞激活和扩大方法，通过取自患者的b细胞的转染生成抗原递呈细胞是可用的。这被称为建立自体类淋巴母细胞细胞系，并且通过用ebv(ebv-lcl)感染细胞进行。其耗时约6-8周以建立该细胞系，因此其是作为依赖于ebv-lcl以进行抗原递呈的培养方法的一部分必须开始的初始阶段之一。其如下制备：在环胞素a存在派生副产物(outgrowth)和lcl消除。ο在利用ebv-lcl的扩大步骤前，培养系统包括，通过已转导有病毒载体ad5f35-lmp1-lmp2(编码ebv蛋白lmp1和lmp2)的自体树突细胞，初始激活和扩大lmp-1和lmp-2特异性t细胞(第0至8天)。ο第9至12天，收集溶细胞性t淋巴细胞(ctl)，并将其再悬浮于新制培养基中，并用转导有ad5f35-lmp1-lmp2的ebv-lcl再刺激。ο第13至16天，向溶细胞性t淋巴细胞供给新制培养基和重组人il-2。ο然后是利用ctl:lcl每周再刺激，和每周两次添加il-2，持续4至8周时间。·用于该方法的树突细胞也必须通过如下制备：从患者样品获取pbmc，并用il-4和gm-csf将其激活，以提供粘附pbmc。然后使这些细胞转导有病毒载体ad5f35-lmp1-lmp2(即，编码ebv蛋白lmp1和lmp2)。最后，通过添加il-1β、il-6、pge-1和tnf-α使得树突细胞成熟。t细胞扩大步骤概述(也被称为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的制备)·在制备后，将转导的树突细胞与来自患者的新制pbmc一起培养约10天时间。·然后将得自此步骤的t细胞与转导的ebv-lcl一起培养约1周时间。·然后在il-2存在的情况下将得自后者步骤的t细胞与转导的ebv-lcl一起再培养10天，以提供自体t细胞抗原特异性产物。·反复此过程，直到已扩大足够的t细胞。jimmunothervol33，number3，2010年4月描述了更快速并且更有效的培养细胞的方法，其经23天时间，利用来自wilsonwolf的被称为grextm系统的系统。但是，这种快速方法仍然对细胞应用传统病毒刺激。现有技术策略具有多个问题：(i)活病毒如ebv和病毒载体的应用有可能引起抗载体免疫显性应答，其可干扰靶病毒特异性ctl’s的有效生成；(ii)活病毒的应用由于安全顾虑是进展至3期试验的障碍；(iii)b细胞制备ebv-lcl的要求，既然利妥昔单抗(rituxan)(其减少b细胞)已成为大多数淋巴瘤患者的标准治疗，意味着该技术无法用于多数患者；(iv)生产期(最少6周以建立ebv-lcl和另外5至7周以用于ctl扩大)非常不便，不现实并且经济困难；(v)细胞调控的复杂性提供很多产物错误和污染机会，因此，良好生产规范(gmp)的准则难以符合，和(vi)用于刺激t细胞扩大的自体抗原递呈细胞可表达靶抗原之外的抗原，其可降低治疗性t细胞产物所需的抗原特异性t细胞的纯度。然而，技术人员一直不愿从偏离已建立的方法，因为每个步骤都被认为是生成具有治疗性特征的产物，特别是生成适于在体内识别被活病毒感染的细胞和癌症表达病毒抗原的t细胞群所必需的。本公开提供快速和有效生产对靶抗原具有特异性的抗原特异性t细胞的方法。技术实现要素：本公开提供体外扩大(扩张)抗原特异性t细胞如自体抗原特异性t细胞的方法，包括如下步骤：a)在存在下列的情况下，培养自体pbmc群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞或与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的树突细胞，或已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽/肽混合物脉冲的自体抗原递呈t细胞(t-apc’s)细胞，和人造共同刺激因子，和ii)任选地，细胞因子，并且其特征在于，该方法在相关t细胞群的扩大中，不应用活病毒和/或病毒载体，或编码抗原的dna或rna。在一个实施方式中，提供体外扩大自体抗原特异性t细胞的方法，包括步骤：a)在存在下列的情况下，培养自体pbmc群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽混合物脉冲的树突细胞，和ii)至少一种细胞因子，和b)在存在下列的情况下，培养得自步骤a)的细胞群：i)已用与靶抗原(一种或多种)相关的肽混合物脉冲的自体抗原递呈t细胞(t-apc’s)细胞和人造共同刺激因子，ii)细胞因子，和其特征在于，该方法在相关t细胞群的扩大中不应用活病毒和/或病毒载体或编码抗原的dna或rna。在本公开的方法中，步骤a)的pbmc或树突细胞和步骤b)的抗原递呈细胞通常用肽脉冲(也被称为负载)，该肽被选择以显示来自靶抗原的表位。这些肽在下文中得到更详细的讨论。我们通过如下克服了现有技术的问题：·消除生成ebv-lcl’s的需要，因此避免活病毒用于抗原递呈(这允许来自此前b细胞已耗尽——例如利妥昔单抗治疗导致——的患者的抗原特异性t细胞生成)·消除利用病毒载体-或dna-或rna-编码的抗原实现抗原表达和在抗原递呈细胞中的递呈的需要·提供消除dc对于抗原递呈应用的选择·提供t细胞激活方法，其中通过自体细胞群提供刺激信号和通过重组细胞系或人造共同刺激复合物提供共同刺激信号·提供有效且稳健的2步培养方法，在三周或更少时间内生成共计例如>10e7的具有适当抗原特异性的cd3t淋巴细胞。·集中对临床相关病毒抗原具有特异性的t细胞的刺激，如另外被在2型潜伏肿瘤(淋巴瘤和npc)中不表达的抗原控制的ebv抗原。本发明对于生产自体t细胞产物具有显著优势，并且有可能致使治疗可用于更广泛的患者群。其还最小化生产治疗性产物所需的时间、干预和资源量，并且还有利地最小化污染的可能。此外，获得的治疗性产物的特异性和性质至少等同于通过现有技术方法生产的产物，并且在多个方面可具有改善的性质。某些患者如癌症患者的自体细胞不同于得自健康个体的细胞，因为患者细胞被发现是无反应性的，即，不能递送针对与感染或癌症相关的抗原的免疫应答。免疫抑制通常被认为是全身性的，而无反应性通常在抗原特异性基础被描述，其中t细胞的具体克隆不再能够递送针对靶抗原的免疫应答。癌症微环境例如可产生无反应性，使得识别癌症抗原的t细胞不再具有功能性。免疫无反应性或抑制的证据是，例如，不能清除病毒感染和/或病毒相关癌症细胞的存在。在健康个体中，这些细胞被免疫系统清除(teague,r.m.,b.d.sather,j.a.sacks,m.z.huang,m.l.dossett,j.morimoto,x.tan,s.e.sutton,m.p.cooke,c.ohlen和p.d.greenberg.2006.interleukin-15rescuestolerantcd8+tcellsforuseinadoptiveimmunotherapyofestablishedtumors.nat.med.12:335-341，和chemnitz,j.m.,d.eggle,j.driesen,s.classen,j.l.riley,s.bey-pascher,m.beyer,a.popov,t.zander和j.l.schultze.2007.rnafingerprintsprovidedirectevidencefortheinhibitoryroleoftgfbetaandpd-1oncd4+tcellsinhodgkinlymphoma.blood110:3226-3233)。此外，在患有鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，npc)的患者体内，利用抗原特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)进行自体t细胞免疫治疗的结果一直是相对无效的。在一个试验中，11个患者中仅1个具有完全应答，这可由不能再激活这些患者的lmp特异性t细胞来解释。事实上，发明人假设npc使具有病毒肿瘤抗原特异性的t细胞无反应性。因此，在一些患者中，现有技术方法不能足够地再激活适当的抗原特异性t细胞。注入的t细胞的效力不仅取决于其识别靶肿瘤抗原的能力，还取决于识别那些抗原中的多个表位以防止肿瘤由于表位损失、病毒株变异和t细胞引起的突变而逃脱。因此，需要研发可再现地再激活和扩大识别抗原的广谱表位——如在npc和ebv阳性淋巴瘤中表达的lmp1-、lmp2-、ebna1和barf1-——的ctl的生产策略。在发明人——本领域的引领者——的工作前，并不知道肽是否可用于生成预防和治疗病毒感染和病毒相关癌症的自体抗原特异性t细胞群。也不知道可使用于本方法的树突细胞或t-apc能够有效用作应用所述肽的抗原递呈细胞。而且，t细胞对肽的应答似乎与免疫系统识别的天然加工肽的环境相关。本发明显示出在(自体)抗原特异性t细胞制剂的制备中非常重要的进步，并且这很可能导致对患者和医师的实践效益。在本公开的扩大t细胞群中重要的因素是：·t细胞对各被识别表位的亲合力，·各抗原中被识别表位的数量，·被识别抗原的数量，·t细胞的扩大倍数和具有预期特异性的t细胞的频率。附图说明图1显示生成evb特异性t细胞的现有技术方法的图示。该方法需要生产用于第一轮激活/扩大的自体树突细胞(dc)和用于随后几轮激活/扩大的类淋巴母细胞细胞系(lcl)。dcs和lcl均转染有腺病毒载体，该腺病毒载体包含选择的ebv抗原，以刺激ebv特异性t细胞生长。图2显示本发明不同实施方式的图示。图中通过显示利用肽生成ebna1、lmp1和lmp2特异性t细胞显示本发明的方法。在所有新方法中，腺病毒载体的应用作为提供抗原(一种或多种)的方式被替换为外源肽(一种或多种)的添加。而且，lcl对于第二轮激活/扩大的应用被取消，而替换为肽负载的自体dc或肽负载的抗原递呈自体t细胞(t-apc)和ak562细胞。另一实施方式显示，第一刺激可在不使用dc的情况下进行，并且利用pbmc群中存在的抗原递呈细胞。pbmc、dc和t-apc的生成分别在本文的方案1、2和3中得到描述。图3该系列中的图显示利用本发明权利要求1的步骤b)中的t-apc、通过ak562对t细胞扩大的刺激。这证实了新系统的应用实现第二轮激活/扩大的有效抗原特异性t细胞刺激。其基于惊人的发现：可通过两种独立的组分提供第一(抗原特异性的，刺激)信号和第二(共同刺激)信号。在所示实例中，第一信号由肽负载t-apc提供，并且第二信号由经修饰递呈共同刺激分子的ak562细胞提供，而非mhc。其如本发明权利要求1的步骤b)的说明。图3a显示根据本发明权利要求1的步骤b)利用ak562和t-apc的t细胞扩大。该图显示在方法第二刺激期间采用不同ctl:t-apc:ak562比的6个正常供体的结果和所得的细胞扩大。显示1:1:5的比在大部分供体中是最佳的。图3b显示本发明权利要求1的步骤b)中t细胞扩大的最佳ctl与ak562与t-apc的比。结果通过如下产生：比较(c)扩大倍数(如图3a单独证实)，(d)培养物中cd56+、cd3-细胞的百分比，和(e)采用不同细胞与细胞的比生成的最终细胞产物的干扰素-γ(ifng)elispot中的应答(scf＝斑点形成菌落)。图3c显示在采用ctl与t-apc与ak562细胞的不同比和不同抗原的ebv特异性t细胞的培养中的干扰素γ分泌细胞的比较。显示在elispot分析中生成ifng的最终培养物中的细胞数量——在2个单独供体中，在第二刺激后，处于不同培养比。这显示的是3种单独的目标ebv抗原和无抗原对照。图3d显示t-apc可充当hlai和ii类限制抗原的抗原递呈细胞。a.在用okt3和cd28抗体(t-apc)激活pbmc后，t细胞将开始上调hlaii类以及共同刺激分子如cd80、cd83、cd86和4-1bbl。虽然hlaii类在一周结束时达到100％，但共同刺激分子的水平是暂时的，并且保持低迷。b.ak562是hla(-)ve白血病细胞系，其已经改造以表达稳定高水平的cd80、cd83、cd86和4-1bbl。图4该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大来自健康供体的ebv特异性细胞的结果。图4a是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显示现有技术——阴影框中——和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作apc的细胞类型，然后是递送抗原的方式(ad载体或肽–px)。关于利用t-apc和ak562+肽的实施方式，在数据中缩写为atc。图4b显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞的扩大。该图显示9个健康供体的结果概括。在利用现有技术和图4a所示的3种其他方法扩大ebv特异性t细胞后，在第9、16和23天计数细胞，并且结果在下方以百万细胞显示。利用ak562结合dc或t-apc的两种方法均显示明显优于现有技术的扩大。图4c显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞培养物中干扰素γ分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和本发明不同实施方式培养后，在eelispot分析中用肽再刺激细胞群。来自三种目标抗原(ebna-1、lmp1和lmp2)的肽被用于分析，并且与现有技术相比，应答相同或增强。显示了一个代表性实例(共9健康供体)，然后是核对利用atc的实施方式的所有正常供体的信息的图。图4d显示通过现有技术和本发明不同实施方式扩大的ebv特异性t细胞的t细胞受体亲和力。利用图4a所示不同方法将细胞培养至第16天，然后其在elispot分析中经渐增稀释度的肽再刺激，以确定本发明的新实施方式是否不利于t细胞受体与肽的亲合力。事实上，对于各个ebv肽而言，新方法显示类似的亲合力，并且在ebna1的案例中显示显著增加的亲合力。图4e显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大的细胞的不同t细胞标记的分布。在第16天，收集利用4种不同方法生成的t细胞，并利用流式细胞术使之免疫显型。这显示，在现有技术方法和本发明实施方式之间细胞产物的组成不变。现有技术和新实施方式之间在cd62l表达方面存在差异。其在天然和中枢记忆t细胞中表达，并且通过效应记忆t细胞被下调。因此，这再次可视作本发明实施方式的优势。图4f显示利用现有技术的细胞培养致使应答偏向lcl细胞中表达的抗原，而非淋巴瘤和npc患者的ebv+癌细胞中存在的潜伏2型抗原。利用现有技术和本发明实施方式生成细胞。这些细胞然后在elispot分析中用多种ebv肽再刺激。这显示，现有技术方法致使应答偏向特异性lcl显性表位，而新方法显示抗癌症相关抗原如ebna1的活性增加。图5该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大npc患者的ebv特异性细胞的结果。图5a是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显示现有技术——阴影框中——和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作apc的细胞类型，然后是递送抗原的方式(ad载体或肽–px)。关于利用t-apc和ak562+肽的实施方式，在数据中缩写成atc。图5b显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞的扩大。在利用现有技术和图5a所示3种其他方法扩大ebv特异性t细胞后，在第9、16和23天计数细胞，并且结果在下方以百万细胞或扩大倍数显示。这分别代表3和4个npc供体。利用ak562组合dc或t-apc的两种方法均显示显著优于现有技术的扩大。图5c显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞培养物中的干扰素γ分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和不同实施方式培养后，细胞群在elispot分析中用肽再刺激。应用来自三种目标抗原的肽，-ebna-1、lmp1和lmp2，并且与现有技术相比，npc患者的应答增强。显示一个代表性实例。图5d显示通过现有技术和本发明不同实施方式扩大的ebv特异性t细胞的t细胞受体亲和力。利用图5a所示不同方法将细胞培养至第16天。然后其在elispot分析中经渐增稀释度的肽再刺激，以确定本发明的新实施方式是否不利于t细胞受体与肽的亲合力。事实上，对于各个ebv肽而言，新方法显示类似的亲合力，并且在ebna1的案例中显示显著增加的亲合力。图5e显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大的细胞的不同t细胞标记的分布。在第31天，收集利用图5a所示4种不同方法生成的t细胞，并利用流式细胞术使之免疫显型。这显示，现有技术方法和本发明实施方式之间细胞产物的组成不变。现有技术和新实施方式之间在cd62l的表达方面存在差异。其在天然和中枢记忆t细胞中表达，并且通过效应记忆t细胞被下调。因此，这再次可视作本发明实施方式的优势。关于图5a所示方法有一定变化。这是因为npc患者细胞经历多于一次的再刺激步骤。但是每次刺激的命名保持相同。该数据代表4个npc患者。图5f显示比起通过现有技术扩大的t细胞，利用本发明的新实施方式扩大的npc患者的t细胞(cd3+/cd19-)在共同培养4和10天中更优地杀死lcl(ebv+癌细胞系，cd3-/cd19+)。t细胞和lcl以1:1的比温育。图6该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大淋巴瘤患者的ebv特异性细胞的结果。图6a是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。该图显示现有技术——阴影框中——和用于指代第一和第二刺激的命名。首先显示用作apc的细胞类型，然后是递送抗原的方式(ad载体或肽–px)。关于利用t-apc和ak562+肽的实施方式，如前述在数据中缩写成atc，但在本部分数据中也可选地缩写成katpx和atpk。图6b显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞的扩大。在利用现有技术和图6a所示3种其他方法扩大ebv特异性t细胞后，在第9和16天计数细胞，并且结果在下方以百万细胞或扩大倍数显示。这代表4个淋巴瘤患者的细胞的结果。图6c显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞培养物中的干扰素γ分泌细胞的比较。在利用现有技术方法和不同实施方式培养后，细胞群在elispot分析中用肽再刺激。应用来自三种目标抗原的肽，-ebna-1、lmp1和lmp2，并且与现有技术相比，淋巴瘤患者的应答增强。显示一个代表性实例。这些结果显示，当肽脉冲的pbmc或dc用于第一扩大时，抗原特异性t细胞的数量在9天后相对于应用现有技术的培养显著增加。图6d显示利用本发明新实施方式扩大的淋巴瘤患者的t细胞(cd3+/cd19-)在共同培养2或4天中与通过现有技术扩大的t细胞同等优异地或更优地杀死lcl(ebv+癌细胞系，cd3-/cd19+)。t细胞和lcl以1:1的比温育。图7该系列中的图显示利用现有技术和本发明不同实施方式扩大健康供体的vzv特异性细胞的结果。将pbmc在il-4和il-7存在的情况下用横跨vzv蛋白、ge、orf10、ie61、ie62和ie63的重叠肽库(15mers重叠11个氨基酸)(混合肽(pepmixes))脉冲。在第9、16和23天，在表达共同刺激分子cd80、cd83、cd86和4-1bb配体(k562-cs)的ak562细胞存在的情况下，将其用自体激活t细胞(aatc，t-apc)再刺激。该自体激活t细胞用相同的混合肽脉冲，ctl与t-apc与k562-cs的比为1:1:5。其增至速率通过计数测量，并且抗原特异性在γ干扰素elispot分析中测量。图7a是现有技术方法和本发明不同实施方式的步骤及其命名的示意图。图7b显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞的扩大。应用上述方案扩大的t细胞的生长速率。>500倍扩大可经22天实现。图7c显示利用现有技术和本发明不同实施方式的ebv特异性t细胞培养物中的干扰素γ分泌细胞的比较。来自6至9个健康vzv-血清阳性供体的t细胞的频率，该供体在第0天用混合肽脉冲的pbmc或dc和在第9，16和23天用混合肽脉冲的自体激活t细胞(t-apcs)+k-562-cs细胞激活后响应于vzv肽的刺激而分泌γ干扰素。每个符号表示一个供体。本发明的实施方式——在第一扩大期间利用肽脉冲的pbmc或dc和在随后扩大中利用t-apc组合ak562——对于所有使用的不同vzv抗原而言均导致靶ctl显著扩大。具体实施方式自体t细胞是来自患者的细胞，即，患者本生(natural)的细胞，与来自供体的细胞相反。某些与病毒感染相关的肿瘤已在患者体内建立生长的途径，不论病毒特异性t细胞是否存在。这涉及抑制t细胞的分子的表达和病毒基因表达的调控。因此，这些患者的t细胞可能降低对癌细胞的作用，其可以无反应性形式描述。在自体t细胞治疗中，从患者移除t细胞样品，用于离体激活和扩大。在制备抗原特异性t细胞群后，将其注入患者体内，在此t细胞细胞会进一步扩大，并将通过直接(细胞毒性)和间接(免疫调节)机制消除递呈其靶抗原的细胞。“t细胞”是本领域常用的术语，意图包括胸腺细胞、未成熟t淋巴细胞、成熟t淋巴细胞、休眠t淋巴细胞或激活t淋巴细胞。t细胞可以是t辅助(th)细胞，例如，t辅助1(th1)或t辅助2(th2)细胞。t细胞可以是cd4+t细胞、cd8+t细胞、cd4+cd8+t细胞、cd4-cd8-t细胞或任何其他t细胞亚组。本文所用的抗原特异性t细胞意图指代这样的的t细胞：识别具体抗原并对其响应，例如，通过对其响应而增殖和/或生成细胞因子。在一个或多个实施方式中，方法不使用促进特异性的重组靶抗原。本文的重组抗原指代通过重组技术制备的抗原的整体或大片段。相反，所用肽是抗原小片段，并且通常是合成的。本发明涉及细胞离体处理和由其获得的t细胞产物。通常本发明不包括从患者获得样品的步骤。从患者获得样品的步骤是采集血液样品的常规技术(其可经处理和任选地作为物单采血液成分术(apheresis)产物提供)。此方法对患者呈现极小风险，并且无需由医师实施，而可由适当培训的支持人员实施。在一个实施方式中，来自患者的样品为约200ml血液或更少，例如，150ml或更少，如100-150ml的范围内。通常，需要至少约60ml血液。一般，用于t细胞扩大、dc生成和t-apc生成的pbmc得自血液或单采血液成分术产物——通过本领域技术人员已知的ficoll密度梯度分离。ficoll密度梯度分离采用合成的蔗糖聚合物——其浓度在方案过程中不同，以在沉淀期间发挥不同细胞的分离。适当的反应剂可来自，例如，gehealthcare，如ficollpaquetmplus。在一个实施方式中，负责采集血液样品或运送血液样品的中心在运输前通过ficoll密度梯度分离处理样品。在一个实施方式中，血液样品或处理后的血液样品在环境温度下运输，例如，在4℃以上并且约30℃以下。在一个实施方式中，血液样品或处理后的血液样品被充入容器，如袋，其包括两室，其中一室包含添加剂，如防腐剂和/或抗凝剂，并且血液或处理后的血液被充入第二室，然后打破第一和第二室之间的密封，并将两室的内含物混合。本文所用的培养细胞意图指代体外激活和扩大和/或分化细胞。技术人员已知，t细胞的扩大通常在适当的t细胞扩大培养基中进行。通常，步骤a)的方法可在不改变培养基的情况下进行。通常，步骤b)的方法可在不改变培养基的情况下进行。但是，如果血糖仪指示，例如，即如果系统中的葡萄糖降至100mg/dl以下，则应改变培养基。因此，本公开的方法是有效之处在于其最小化扩大t细胞所需的干预量。t细胞扩大可通过计数存活cd3+细胞来评价。可通过细胞染色来测试存活细胞，用例如下列染色：台盼蓝(和光学显微镜)或7-氨基-放线菌素d，在670nm下放出的活体染料(或viaprobe，7aad的商品备用溶液)和流式细胞术——应用本领域技术人员已知的技术。当染色剂渗透到细胞中时，细胞被认为是非存活的。不摄取染料的细胞被认为是存活的。示例性方法可利用每约100μl细胞悬浮液约5μl的7aad和约5μl的annexin-v(磷脂结合蛋白，其结合凋亡期间暴露的外部磷脂磷脂酰丝氨酸)。可在没有光的情况下环境温度下将这种混合物温育约15分钟。然后可利用流式细胞术进行分析。参见例如，mgwing,ampmontgomery,s.songsivilaiandjvwatson.animprovedmethodforthedetectionofcellsurfaceantigensinsamplesoflowviabilityusingflowcytometry.jimmunolmethods126:21-271990。t细胞扩大培养基通常包括相关扩大步骤(即，步骤a)或步骤b))使用的血清、培养基和任何细胞因子。在一个实施方式中，所用血清是例如15％血清或更少如10％血清，具体地使用人血清。在一个实施方式中，培养基是高级rpmi或rpmi1640，可来自lifetechnologies。在一个实施方式中，所用细胞因子在下文讨论。在一个实施方式中，细胞扩大培养基包括10％人ab血清，200mml-谷氨酰胺，45％earle’sham’s氨基酸(ehaa或click培养基)和45％高级rpmi或rpmi-1640。在一个实施方式中，所用培养基无需应用血清。本文所用的细胞扩大指代基于细胞分裂增加细胞群中靶细胞的数量。在一个实施方式中，在步骤a)中，用肽/肽混合物直接处理pbmc。非常惊讶的是，自体pbmc可在肽存在的情况下以类似于自体树突细胞存在时的方式激活t细胞，具体地因为来自文献的信息是树突细胞是最佳的抗原递呈细胞。chenml,wangfh,leepk,lincm.immunollett.2001jan1；75(2):91-6。在另一实施方式中，在本方法的步骤a)中，使用从患者pbmc制备的树突细胞。血液样品不是普遍要经历最初的细胞物理选择，例如，从单采血液成分术群选择亚细胞群(或t细胞)。在一个实施方式中，1至2×107pbmc在30ml培养基中的grex40中细胞因子存在的情况下用0.5至1×106肽-脉冲的dc刺激。9至14天培养后，细胞的收集，例如，在50至80×107抗原特异性响应t细胞的范围内。但是，这可在无反应性t细胞的患者体内较低。如果指示葡萄糖降至100mg/dl以下(在血糖仪上)，则培养基(45％高级rpmi、45％ehaa、10％fcs和200mml-谷氨酰胺)将被改变。树突细胞通常被本领域技术人员称为专业抗原递呈细胞。该术语指代如下事实：树突细胞在向t细胞递送两信号激活过程中是最佳的，即，除在细胞表面上递呈抗原外，树突细胞还提供强共同刺激信号。两种信号，通过抗原递呈刺激和共同刺激，均是实现t细胞激活所需的。用于本发明方法的树突细胞可通过用肽混合物脉冲(或负载)由患者pbmc样品生成，其详细内容在下文讨论。本文所用的脉冲或负载意图仅指代在适当培养基中使相关t细胞如pbmc或树突细胞暴露于肽混合物。用于本方法的树突细胞可如下制备：从患者样品采集pbmc，并将其粘附于塑料。通常，单核细胞群粘着并且所有其他细胞可被洗脱。然后将粘附群用il-4和gm-csf分化，生成单核细胞衍生的树突细胞。可通过添加il-1β、il-6、pge-1和tnf-α(其上调树突细胞表面上重要的共同刺激分子)使这些细胞成熟，然后如本文描述用肽混合物转导，以提供所需的树突细胞。以这种方式生成和成熟化dc的参考可在如下中找到：jonuleith,kuhnu,mullerg,etal.pro-inflammatorycytokinesandprostaglandinsinducematurationofpotentimmunostimulatorydendriticcellsunderfetalcalfserum-freeconditions.eurjimmunol.1997；27:3135–3142。各肽库/混合肽的肽可以1至100ng肽/15×106pbmc或atc(参见下文讨论)或1至100ng肽每2×106dc添加。在一个实施方式中，用il-4和gm-csf刺激pbmc3至5天，然后用gm-csf、il-4、tnf-a、il-1b、pge-1或pge-2和il-6成熟1或2天，然后用所述肽脉冲。因此在一个实施方式中，步骤a)的树突细胞是自体的。在一个实施方式中，产生的树突细胞应答是平衡的cd4和cd8应答。本文所用的平衡的cd4和cd8应答意图指代如下事实：cd4细胞或cd8在扩大方法中不耗尽。但是本文所用的平衡群仍可倾斜，在于cd4细胞可多于cd8细胞，或反之亦然。在一个实施方式中，步骤a)中pbmc与树突细胞的比率在10:1至50:1范围内，例如、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、如约20:1。树突细胞提供有效t细胞激活，并且当培养中的抗原特异性t细胞频率低(100t细胞中小于1可对目标抗原具有特异性)时，例如，在步骤a)中应用树突细胞是有效的。但是，随着抗原特异性t细胞扩大的数量和频率以及特异性t细胞与树突细胞的比增加，树突细胞的激活效率降低，除非树突细胞的数量可增加。抗原特异性t细胞将向激活后的树突细胞频繁递送细胞毒性应答。树突细胞的杀死则将减少可用于继续激活和扩大靶抗原特异性t细胞的激活信号。虽然树突细胞非常有效地刺激t细胞扩大成对靶抗原具有特异性的群，但其难以生成大量树突细胞。因此虽然在实践中步骤b)可应用树突细胞，但在步骤b)中应用不同抗原递呈细胞和人造共同刺激或因子具有优点。在一些实例中，当树突细胞的数量相对于t细胞过小时，观察不到t细胞激活。这将在下文得到更详细讨论。有利地，认为树突细胞能够激活记忆t细胞和原初t细胞。根据本发明细胞群中记忆t细胞的存在可能是非常重要的。本文所用的小群意图指代如下事实：小群中细胞的绝对数量显著低于预期群中的细胞数量，例如，总群的30％或更少。下文描述的肽混合物可用于选自树突细胞脉冲、抗原递呈细胞脉冲的一个或多个目的，或可与pbmc一起直接用于步骤a)。肽混合物来自相关病毒抗原，例如，ebv病毒抗原。eb病毒，常被称为ebv，是疱疹病毒家族的成员，并且慢性感染超过95％的世界人口。在一个实施方式中，肽来自乳头瘤病毒的抗原。在一个实施方式中，肽来自丙肝病毒的抗原。在一个实施方式中，肽来自牛痘病毒(vv)的抗原。在一个实施方式中，肽来自水痘带状疱疹病毒(vzv)的抗原。在一个实施方式中，肽来自人免疫缺陷病毒的抗原。在一个实施方式中，肽来自乙肝、hhv-8、cmv、htlv-1、sv40和/或梅克尔细胞(merckelcell)病毒的抗原。在一个实施方式中，肽来自病毒组合，例如，本文描述的任意两种或更多种，如ebv和vzv，ebv和vv，vzv和vv，或ebv、vzv和vv。代替在感染有相关病毒如ebv的细胞存在的情况下或在编码病毒蛋白质的腺病毒载体存在的情况下培养自体t细胞，细胞在用肽或肽混合物脉冲的抗原递呈细胞存在的情况下进行培养。这减少了最终产物被病原污染的风险，这是非常重要的，因为无法使将要注入患者的t细胞产物灭菌。在一个实施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆盖抗原lmp1(潜伏膜蛋白1，uniprot编号p03230)的序列的部分或全部。在一个实施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆盖抗原lmp2(潜伏膜蛋白2，uniprot编号q1hvj2)的序列的部分或全部。在一个实施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆盖抗原ebna1、2、3、4、5或6或其组合，特别是ebna1，的序列的部分或全部。eb核抗原1(ebna1)是与eb病毒相关的多功能二聚病毒蛋白质。其是在所有ebv相关恶性肿瘤中发现的唯一ebv病毒蛋白，因此是重要的靶向抗原。其在建立和保持细胞感染ebv时采取的变化状态中是非常重要的。ebna1具有甘氨酸-丙氨酸重复序列，其将蛋白质分成氨基和羧基端结构域。该序列还似乎稳定蛋白质，防止蛋白酶体分解，以及削弱抗原处理和mhci类限制性抗原递呈。因此，这抑制针对病毒感染细胞的cd8限制性细胞毒性t细胞应答。ebna1转录区域起始于潜伏阶段i和ii期间的qp启动子。其是第一潜伏阶段期间表达的唯一病毒蛋白质。ebna1混合肽激活hlaii类限制性细胞毒性cd4t细胞。在一个实施方式中，肽混合物或混合物中一些肽覆盖抗原barf1(bamhia向右阅读框1，uniprot编号q777a5)的序列的部分或全部。barf1是221个氨基酸的蛋白质，其由位于ebv基因组的bamhi-a片段中的barf1基因编码。barf1在不同ebv相关类上皮恶性肿瘤中表达，例如，在nk/t淋巴瘤中和burkitt淋巴瘤中。其他可能的ebv抗原包括lp和bhrf1。牛痘病毒的主要病毒体/包膜蛋白被描述于pnasjanuary7,203vol100no.1，第217-222页(drexler等)。这些包括a10l(主要核心蛋白p4a)、h3l(肝素结合蛋白)、c7l(宿主范围蛋白2)、d8l(细胞表面结合蛋白)、b22r(未知功能)和g5r(未知功能)。水痘带状疱疹病毒免疫原包括ge、orf10、ie61、ie62和ie63。来自上文列举的具体靶抗原中每一种的肽可被独立地用于方法的步骤a)和/或步骤b)。通常，在步骤a)和步骤b)中为提供t激活第一信号使用或表达的表位/抗原/肽的一些或全部在两个步骤中的通用的。肽可覆盖靶抗原的部分或全部，例如可重叠，以增加以免疫学相关方式递呈表位氨基酸的机会。可选地或另外地，已知表位的肽可被包括在内，并且如需，被过度呈现，也就是说，可以是更大百分比的递呈肽。hiv中的抗原包括gag、pol、env、nef、gp180、gp120及类似物。本文所用的“覆盖抗原序列的部分或全部”意图指代如下事实：肽和全长抗原的相关部分之间存在同一性或显著相似性，例如，肽与抗原的连续区域基本上相同。本文所用的被选择递呈的表位意图指代如下事实：表位的线性序列是已知的并且被包括在肽混合物中(即，选择编码已知表位的肽)，或者，例如，其中抗原序列已被绘制表位，然后肽被设计以重叠方式覆盖序列的部分或全部，从而最大化递呈一个或多个适当表位的机会。当然，如需，被应用这两种策略的混合，例如，可在较大程度上呈现肽混合物中的已知表位。在一个实施方式中，混合物中的肽来自一种或多种相关病毒抗原，例如，一种、两种、三种、四种或更多种。在一个实施方式中，肽混合物至少包括lmp1和lmp2的序列或至少由lmp1和lmp2的序列组成。另外，在一个实施方式中，ebna1和/或barf1被加入抗原混合物，以减少通过突变或下调病毒抗原免疫而逃脱的机会。本文所用的肽意图指代通过肽键连接的氨基酸短聚合物，其中肽包含至少2个，通常不多于50个氨基酸。所用肽足够长以存在一个或多个线性表位，例如，平均7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。在一个实施方式中，混合物中一些肽重叠(关于单抗原序列)，也就是说，其来自单个抗原并且排列，使得来自母体序列的片段部分和某些氨基酸序列存在于混合物的一个以上肽片段中。肽重叠意味着氨基酸序列冗余。但是，此方法最大化以适当的方式递呈母体抗原表位的机会，特别是当母体抗原的表位绘制信息不可获得时。在一个实施方式中，每个肽中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸重叠。在一个实施方式中，各蛋白质库中的肽为15个氨基酸长并且重叠11个氨基酸，使得来自蛋白质的所有可能的hlai类表位可被递呈。肽可更长，例如20个氨基酸，重叠15个，或30个氨基酸，重叠25个。适当肽序列的实例在随附提交的序列表中包括。在一个实施方式中，肽混合物包括2-1000个肽或由2-1000个肽组成，更具体地2-500，例如，2-400、2-300、2-200或2-100，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200个或更多肽。步骤a)的肽或步骤a)或b)中用于生成抗原特异性树突细胞或用于制备方法步骤b)的抗原递呈细胞的肽被独立地基于上述标准选择。但是，其中所用肽或所用材料如树突细胞和/或抗原递呈细胞的一些或全部用相同表位的一些或全部脉冲的方法是最有效的。在这种情况下，然后步骤b)加强和增加步骤a)生成的应答。上述肽混合物还可用于生成抗原递呈t细胞(t-apcs)，该抗原递呈t细胞用于方法步骤b)的一些实施方式。为制备抗原递呈t细胞，如下文描述其由pbmc生成，并用相关肽混合物脉冲，例如以1至100ng肽/15x106t-apc添加各肽库的肽。每个本文所用的库可指代针对每种抗原制成的肽。在一个实施方式中，抗原递呈细胞是自体的。激活的t细胞表达hlai类和上调ii类抗原以及cd80和cd86(暂时)。在一个实施方式中，在用肽脉冲以提供特异性t-apc后，辐射后者以确保在其用于步骤b)时其不再进一步扩大。辐射可利用γ辐射源或x射线源进行。在一个实施方式中，在第9至14天，用400ml包含il-15的培养基中的grex500中的5×107辐射后的t-apc和5×107ak562刺激约5×107的步骤a)的响应t细胞上至14天。us2003/0147869公开了其中描述的ak562细胞可被改造，使其成为抗原递呈细胞。这些细胞在理论上可大量表达。有人可认为这些可以用作步骤b)的t-apc的替代。然而，这些ak562抗原递呈细胞不表达hla，并且即使其表达hla，hla表型也不匹配效应t细胞限制图谱，并且其会激活异源抗原特异性t细胞。本发明人发现，在不存在hla表达细胞的情况下，相关靶t细胞群的激活很弱。虽然理论上这些ak562细胞可被改造以表达hla，但将需要使其匹配每种情况的患者，因此使该方法不必要地复杂和昂贵。存在7,196hla等位基因。每个个体的这些等位基因可分成6hlai类和6hlaii类等位基因(在2染色体上)。其可被混合和以任何方式匹配，因此，将hla等位基因的适当组合引入ak562细胞——从而(1)再激活全部可能的t细胞和(b)不诱导异源反应性——在此时将会是可能的。根据本发明的t-apc平均递呈至少一个来自靶抗原的表位，并且例如可递呈2、3、4、5、6或更多个表位。在一个实施方式中，t-apc递呈来自一种以上靶抗原的表位，例如，2、3、4或更多种靶抗原。在一个实施方式中，得自步骤a)的细胞(或ctl)与t-apc的比在4:1至1:2范围内，例如，1:1。高比例的t-apc使扩大效力最大化。通常难以生成如此高比例的树突细胞，这意味着用树突细胞扩大相关t细胞群耗费的时间可长于用抗原递呈细胞扩大所耗费的时间。在一些实例中——其中树突细胞的数量很低，可根本不发生扩大。因此，在步骤b)中利用抗原递呈细胞的方法可具有优势，原因在于扩大耗费的时间较短，因此提供更有效过程。因此，在一个实施方式中，t-apc用于本方法的步骤b)。在本方法中t-apc的应用代替现有技术方法中lcl的应用。lcl细胞系通过感染活ebv病毒被永生化。在本方法中避免使用lcl具有巨大优势。通过感染腺病毒载体或脉冲肽改造以递呈其他病毒抗原的lcl可提供有效第二刺激，但对于弱抗原而言，来自载体的腺病毒和ebv蛋白和lcl分别产生强竞争，使得最终ctl产物的主要组分通常对在lcl中表达但不在2型潜伏肿瘤(淋巴瘤和npc)中表达的腺病毒或显性ebv抗原具有特异性。步骤b)中简单肽的应用看起来不是存活的，因为发明人的经验是，向来自步骤a)的ctl递呈肽混合物仅“扰乱”细胞，并导致其在其表面上递呈肽。然后这导致ctl相互成为靶，并且其开始自己破坏自己。这造成显然不需要和与实施方法的目的相悖的细胞减少。在一个实施方式中，步骤b)进行一次以上，例如，2、3、4、5或更多次，直到获得足够数量的相关抗原特异性t细胞群。足够数量可例如是足以持续体内扩大和刺激患者对靶病毒感染和/或靶相关癌症免疫应答的细胞至，如1至90×103，1至90×104，1至90×105，1至90×106，1至90×107，1至90×108或更多细胞，如80×107细胞。在一个实施方式中，提供这样的方法：其中如果细胞在步骤b)后未充分扩大，其可受到另外的刺激，该刺激利用如下：(1)肽脉冲的、辐射后的自体激活t细胞和辐射后的共同刺激ak562细胞，(2)辐射后的pbmc，来自血库认可的异源供体，和/或(3)次促有丝分裂(submitogenic)剂量的抗cd3；1至100ng/ml，例如，50ng/ml。t-apc不是专业抗原递呈细胞。因此，除t-apc提供的抗原递呈外，还需要共同刺激因子以刺激t细胞扩大和分化。本文所用的人造共同刺激因子是外源因子，其被加入培养物以提供t细胞激活信号，从而补充t-apc抗原递呈信号，例如其中共同刺激因子和t-apc抗原递呈信号一起刺激或促进自体t细胞以特定方式扩大，即，刺激靶细胞群，使得在其扩大时对靶抗原具有特异性，其中特异性方面由t-apc引起。外源因子是不添加就不存在于pbmc培养物中或其中细胞培养物中存在的天然存在量低并且通过添加外源因子量而增加的因子。承载cd80/86的小珠可用作辅因子。带有抗cd28(cd80/86的配体)和抗4-1bb的小珠是可用的，但其还包含抗cd3，抗cd3消除所需的抗原介导的扩大特异性。因此在不存在抗cd3的情况下带有抗cd28(cd80/86的配体)和抗4-1bb的小珠构成本公开的一方面。在一个实施方式中，人造共同刺激因子是经改造在其表面上或关联其表面(参见us2003/0147869，关于细胞表面上某些抗体的关联)表达具体蛋白质(一种或多种)的细胞或细胞系，例如ahla阴性细胞系，并且该细胞或细胞系已经过遗传修饰以表达共同刺激分子，如us7,745,140公开的ak562细胞系。如后者的细胞系可用于本发明的方法以提供延长的共同刺激信号。因此在一个实施方式中，细胞系，如ak562，不表达hla。因此在一个实施方式中，细胞系，如ak562，不表达抗原。本文所用的ak562细胞可指代us7,745,140描述的原始细胞系。但是，基于本方法的目的，总体上，抗cd3抗体不通常被负载于其表面上的fcγ受体上。优选地，本文所述的ak562细胞是原始ak562细胞系的衍生体，其表面上包括至少一种，如一种、两种、三种或四种共同刺激因子，其具体地独立地选自抗cd28抗体、抗cd80抗体、抗cd86抗体和4-1bbl。一种或多种辅因子可具有减少t细胞凋亡和诱导增殖循环——例如，约7至10次细胞分裂——的作用。细胞经改造在其表面上表达共同刺激因子，其提供在t细胞刺激(激活或分化)或存活中的重要信号，并且补充抗原在抗原递呈细胞表面的递呈所生成的信号。可在细胞系表面上表达的分子实例选自cd80、cd86、cd83，4-1bb配体及其组合，例如，其1、2、3、或4种。这四种元件一起提供强共同刺激信号。在一个实施方式中，ak562细胞在其表面上进一步表达ox-40配体。这些细胞与上述t-apc一起作用，提供t细胞激活所需的全部信号。cd80和cd86结合cd28——表面糖蛋白，存在于人体约80％的外周t细胞上。结合t细胞受体的激活，该结合提供有效的t细胞刺激。另外，cd28(在t细胞上)结合其配体与t细胞受体的接合联合，诱导il-2的产生。在一个实施方式中，步骤b)的培养仅包括内生il-2。可选地，人造共同刺激因子可以是相关受体——如靶向例如cd28的抗体——的激动抗体。这些抗体可被直接提供在培养基中，或粘附于小珠，或可粘附于细胞系(如ak562)表面。这被详细描述在us2003/0147869中，其被引入本文作为参考。在小珠上提供辅因子不能导致最有效的抗原特异性扩大。因此在一个实施方式中，辅因子在细胞如ak562细胞上或关联细胞如ak562细胞被表达。用于本发明步骤b)的这种人造共同刺激细胞(如ak562)细胞似乎通过崭新的并且令人惊讶的机制发挥作用。本公开的方法是可在一个细胞上提供抗原递呈并且可通过不同细胞提供共同刺激以刺激和激活t细胞的首次证据。在生成抗原特异性t细胞的背景下，这是非常令人惊讶的，因为在过去的实践中通常ak562细胞被改造以表达hla分子或靶向t细胞受体的抗体和建模体内系统——其中t细胞受体介导的信号和共同刺激信号由一个细胞提供(即，两个细胞之间接触，并且例如，t细胞上的cd28连接与tcr接合联合诱导il-2的产生，该il-2触发持续的增殖；june等1994，jenkins等1993和schwartz1992)。因此，已建立某些ak562细胞系，其表达mhc分类1a2和a3，britten，c.m.；meyer，r.g.；kreer，t.；drexler，i.；t.；herr，w.(2002)，"theuseofhla-a*0201-transfectedak562asstandardantigen-presentingcellsforcd8(+)tlymphocytesinifn-gammaelispotassays",journalofimmunologicalmethods259(1–2):95–110，和clark，r.e.；dodi，i.a.；hill，s.c.；lill，j.r.；aubert，g.；macintyre，a.r.；rojas，j.；bourdon，a.等(2001)，"directevidencethatleukemiccellspresenthla-associatedimmunogenicpeptidesderivedfromthebcr-ablb3a2fusionprotein",blood98(10):2887–93。因此，在某些实施方式中，共同刺激细胞如ak562细胞实际上是自主共同刺激因子(第三方共同刺激因子)，其与t-apc一起刺激靶t细胞群的抗原特异性扩大。虽然在理论上表达fc受体和可负载有抗cd3抗体(如okt3抗体)以提供抗原不相关激活信号的ak562细胞可用于本方法，但在至少一个实施方式中，ak562(或改造的细胞)不负载有抗cd3抗体，因为通常非特异性信号是不期望的。本公开还扩展至改造细胞系如ak562细胞对于提供与t细胞如自体t细胞的扩大中的抗原递呈不相关的人造共同刺激信号的应用。因此，在一个实施方式中，方法进一步的特征在于，步骤b)中扩大细胞群的方法在如下背景下是令人惊讶的：仅依赖(1)t-apc；(2)肽，脉冲/负载后者，和(3)ak562细胞，被转导以仅表达共同刺激分子，而无抗原特异性递呈特性。所述这种方法实现了在抗原特异性基础上的扩大(通过扩大过程中抗原特异性t细胞的增加百分比测量)，尽管事实上ak562细胞未被改造以递呈特异性抗原。在不在此步骤(例如dc)中添加其他apc的情况下，扩大方法因此依赖t-apc来实现关于靶抗原递呈的第一信号激活。这是不常见的，因为关于抗原递呈和共同刺激，t-apc均被认为是次佳的。ak562细胞提供共同刺激和增强扩大的作用此前已被描述，但此前的论证显示一般cd3+t细胞扩大的代价是抗原特异性降低，因为ak562细胞未被改造以递呈特异性抗原。在本发明中，抗原特异性随扩大增加，这表明第一信号抗原识别步骤通过t-apc来实现，该t-apc与来自ak562细胞的第二信号共同刺激协同作用。这种抗原递呈和共同刺激信号的二分背离当前接受的抗原特异性t细胞扩大的模式——其中第一信号和第二信号由相同的apc递送。在一个实施方式中，本发明提供利用在第一细胞(或细胞群)上的抗原递呈和人造共同刺激因子即第二不同细胞来刺激和激活抗原特异性t细胞扩大的方法。在一个实施方式中，改造细胞系，如ak562细胞系，被辐射后用于本公开方法前，例如，用γ辐射源或x射线源。改造细胞系，如ak562细胞系，可以冷冻形式提供，在这种情况下，细胞的辐射可在冷冻后进行。在一个实施方式中，ctl与共同刺激因子(例如，其中辅因子是细胞系)的比在分别2:1至1:10的比内，如1:5。适当的ctl:抗体:共同刺激细胞比在1:1:0.2至1:1:10范围内，如1:1:5。有利地，利用t-apc和人造共同刺激因子如改造细胞的方法，与现有技术方法相比，可提供提高水平的抗原特异性t细胞扩大。用于步骤a)和任选地步骤b)的细胞因子(一种或多种)必须适于刺激和/或激活t细胞生长或分化或发挥一些其他有用的功能，如促进t细胞存活或类似功能。可用于本公开方法的细胞因子包括il-1、il-2、il-4、il-6、il-7、il-12和il-15。在一个实施方式中，用于根据本公开的方法的细胞因子独立地选自il-4、il-7和il-15，如其组合。在一个实施方式中，在步骤a)中，所用细胞因子是il-4和/或il-7。虽然不希望被理论束缚，但发明人认为这些细胞因子对于病毒抗原特异性细胞的频率、全谱(repertoire)和扩大具有影响。在一个实施方式中，如果il-2用于步骤a)，则其在培养约第3或4天被添加，而非在开始。t细胞全谱可通过elispot分析确定——在用肽库刺激后，该肽库被等份成池，使得每种肽被独特显示在在两个池中(kern,f.,n.faulhaber,c.frommel,e.khatamzas,s.prosch,c.schonemann,i.kretzschmar,r.volkmer-engert,h.d.volk和p.reinke.2000.analysisofcd8tcellreactivitytocytomegalovirususingprotein-spanningpoolsofoverlappingpentadecapeptides.eurjimmunol.30:1676-1682，以及straathof,k.c.,a.m.leen,e.l.buza,g.taylor,m.h.huls,h.e.heslop,c.m.rooney和c.m.bollard.2005.characterizationoflatentmembraneprotein2specificityinctllinesfrompatientswithebv-positivenasopharyngealcarcinomaandlymphoma.j.immunol.175:4137-4147)。在一个实施方式中，在步骤b)中，所用细胞因子是il-15。虽然不希望被理论束缚，发明人认为il-15对相关t细胞群具有促存活作用。在一个实施方式中，用于步骤b)的细胞因子是il-15。细胞因子如il-15可在培养过程中更换，例如每周两次。在一个实施方式中，仅使用本文任一个实施方式中描述的具体细胞因子。il-12具有th1集中的作用，并且如需平衡的th1/th2，可省略外源il-12。在一个实施方式中，本公开的方法不使用外源il-12。但是，在当前t细胞产物的背景下，cd4+群的th1应答被认为是理想的。如适当，可在方法的任何阶段添加外源细胞因子，包括在细胞被转移到培养系统时或在给定步骤开始时伴随添加。后者适用于步骤a)和/或步骤b)。步骤a)和/或步骤b)中外源细胞因子的存在可选地可以贯穿该步骤以部分方式添加，例如，在步骤开始后1、2、3、4天或更多天。在一个实施方式中，本公开的方法用于提供细胞群，包括cd4+t细胞群，例如，th1群。本文所用的ath1群意图指代cd4+群，其中5％的细胞或更多，如10、20、30、40、50、60、70、80、90％或更多被归类为th1。th1细胞，除其他功能外，通常最大化巨噬细胞的杀死效力和细胞毒性cd8+细胞的增殖。记忆t细胞是th1细胞的亚类。在一个实施方式中，得自本方法的细胞群包括记忆t细胞的亚群。虽然不希望被理论束缚，但认为大部分得自本方法的t细胞将衍生自起始群的记忆部分。在一个实施方式中，il-2不用于步骤(a)，因为该细胞因子促进的扩大可能过于非特异性并且导致nk细胞、具有不需要的功能/特异性的t细胞和可在细胞中生成一定量无反应性的t调节细胞扩大。因此在一个实施方式中，唯一存在于培养物中的il-2是内生il-2，即，其是被细胞分泌的。在一个实施方式中，il-2不用于步骤(b)，因为其可比il-15促进更加分化的表型。本文所用的无反应性意图指代缺乏细胞对抗原刺激的应答性。无反应性可利用功能分析来测量，例如，相关细胞群的干扰素γ分泌。与全功能(非-无反应性)细胞相比较低水平的干扰素γ分泌可指示无反应性程度。当然，细胞的无反应性程度越大，具体(标记)功能性将越低。如上所述，扩大产物背景下的无反应性意指上位术语，其指代细胞功能以一种或多种相关方式减少。该术语包括细胞衰竭，例如，其中细胞不再能够分裂。于是，细胞被称为衰老。细胞停止分裂是因为端粒——复制所需的染色体末端的dna保护位——随着每次复制而变短，最终被耗尽。认为pd-1(程序性细胞死亡蛋白1；uniprotq15116)——在细胞表面上被表达，是无反应性的标记。在一个实施方式中，小于10％，例如，9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％或更少的相关扩大t细胞群表达pd-1，如约1％。在t细胞高水平无反应性的患者如复发性npc的患者体内，lmp/ebna1特异性t细胞的频率可在pd-l1或pd-1的封闭抗体存在的情况下增加，即，其阻止来自结合受体的配体的信号传导。这种现象未被发现于健康供体中，这表明2型潜伏抗原特异性t细胞可能在npc患者中是无反应性的。本文所用的靶抗原意图指代用于在t细胞中生成对治疗性靶——如具体病毒，例如，ebv——的特异性的抗原。因此，被靶病毒感染的细胞或癌细胞通常表达靶抗原，因此本身会变成被免疫系统清除的靶。在一个实施方式中，扩大的t细胞群是平衡cd4+和cd8+群，也就是说，细胞群包括cd4+和cd8+细胞，但不必等量。本说明背景下的平衡用于意指群cd4+或cd8+其中一个在扩大过程中不减少(耗尽)。利用本公开的方法扩大的细胞群包括预期的t细胞群，并且通常不仅仅由预期群组成。给予患者的最终产物可包括多种其他细胞——方法不靶向其扩大。在一个实施方式中，预期的cd4+和cd8+细胞群占总细胞群约60％或更少。细胞群的频率可利用γ-ifnelispot分析或利用multimer(例如tetramer)染色测量，二者均是本领域技术人员已知的。在一个实施方式中，得自该方法的t细胞群在通过光谱分析时是多样的，但无优势克隆出现。也就是说，起始样品中的t细胞多样性基本上表现在扩大t细胞中，即，扩大通常不提供单克隆或寡克隆靶细胞群。显著比例——例如，30％至60％的扩大细胞通常表达效应记忆标记，包括cd27、cd28、cd62l和/或cd45ro。预期50％或更多，如60、70、80、90或95％，的根据本公开所述的抗原特异性t细胞可能够杀死扩大方法中使用的表达抗原的靶细胞。我们认为足够的细胞，甚至患者治疗所需的最高细胞剂量，可利用本公开的双刺激应用方法来制备——与利用ad载体和lcl的28至63天lmp-t细胞培养相比，花费16至24天范围的t细胞培养。此外，通过本发明的方法生成的细胞可具有优势在于，与通过现有技术方法制备的细胞相比，其更具特异性，生产较高水平的γ干扰素和/或表达较低水平的无反应性标记。在一个实施方式中，癌症患者的无反应性t细胞可不良生长，并且需要三种刺激。第三刺激可包括另外的刺激性组分。由于此时大部分细胞应当具有特异性，不存在关于不需要的细胞的扩大的忧虑。在一个实施方式中，第三刺激培养包括(1)肽脉冲的、辐射后的自体激活t细胞，(2)辐射后的共同刺激的细胞系如ak562细胞，(3)来自血库认可的异源供体的辐射后的pbmc，和(4)次促有丝分裂剂量的抗cd3；1至100ng/ml，例如，50ng/ml。在一个实施方式中，进行一个或多个测试以建立细胞用于治疗的适应性，例如，干扰素γics(胞内细胞因子染色)和/或干扰素γelispot分析。在一个实施方式中，适应性测试被组合在单次流式细胞术分析中。在一个实施方式中，进行非特异性杀死的51cr释放分析，但这通常不构成适应性分析的部分。在一个实施方式中，批释放测试显示在表1中：本公开的方法可在孔或容器中进行，但最适宜在透气性系统中进行。本文所用的容器意图指代任何类型的适于容纳细胞、培养基等的容器，例如，袋，如灌注型袋(配置有透气性部分)，或刚性容器，如grextm系统。透气层有助于细胞快速扩大并且最小化所需的培养基变化量。在一个实施方式中，步骤a)在grextm10系统中进行。grextm10系统适于培养上至1×108个t细胞。在一个实施方式中，步骤b)在grextm100系统中进行。wo2005/035728，被引入本文作为参考，描述了如何制备透气性容器。在一个实施方式中，使用硅氧烷透气性材料。在一个实施方式中，所用系统是来自wilsonwoolf的grextm系统。在一个实施方式中，该系统适于提供无菌制剂，如美国临时申序号61/550,246所述，其被引入本文作为参考。通常该系统每cm2表面积接种有约50万细胞。在表面积10cm2的grex-10中，接种最少500万并且上至2000万细胞。在一个实施方式中，在步骤(a)中，2000万细胞可被接种在grex-10中。在pbmc中，小于1％的细胞对肽具有特异性，因此接种至多20万特异性细胞。其余pbmc充当供给细胞。在一个实施方式中，在步骤(b)中，5000万辐射后的ak562细胞加1000万肽脉冲的、激活的并且辐射后的t细胞和1000万效应t细胞被接种在grex-100中(100cm2)。在这种情况下，仅效应t细胞会增殖。在一个实施方式中，本公开扩展至直接由该方法获得的细胞组合物。在一个实施方式中，根据本公开的方法生成足够cd3+细胞，以为患者提供至少两个单独剂量。本发明还扩展至与通过本文公开的方法制备的细胞群具有相同预期特征的组合物。因此，一方面，本公开提供自体t细胞群，其经体外扩大以包含对靶抗原如病毒具有特异性的t细胞群，其中该群基本上不含靶病毒污染，并且响应病毒载体。本方法还涉及用肽混合物脉冲的树突细胞的制备和由其获得的细胞群，用于抗原特异性t细胞群的扩大，具体如本文描述。本方法还涉及制备用肽混合物脉冲的t-apc的方法和由其获得的细胞群。本公开还涉及本文描述的自体t细胞群，例如，包括cd4+和cd8+抗原特异性t细胞群，其中抗原与病毒感染细胞或癌细胞相关。在一个或多个实施方式中，与通过现有技术方法制备的细胞相比，根据本公开的细胞群具有一个或多个优势性质。在一个实施方式中，相关t细胞群中的细胞的平均细胞直径是10至14μm。有利地，本发明的细胞培养在灌注后通常生成低毒性，例如，与极少毒性不耐受响应相关，例如，炎性应答、细胞破坏、流感样症状、恶心、脱发或类似症状。根据本公开的细胞群还提供有利性质，例如，高水平的干扰素γ表达。本文所用的高水平的干扰素γ表达意图指代如下事实：相对于通过现有技术方法制备的细胞，通过本方法制备的细胞群平均可表达较高水平的干扰素γ，并且相对于得自患者的原始无反应性细胞必定表达较高水平的干扰素γ。在一个实施方式中，本公开的细胞显示增强的抗原特异性，例如，在本文公开的分析中，例如，与通过现有技术方法制备的细胞相比，本公开的细胞包含较高频率的、响应抗原刺激分泌细胞因子的细胞。该特征通常是平均值，其是由得自细胞群的值除以存在的细胞数量而得到的每个细胞的值。在一个实施方式中，本公开的细胞群显示与通过现有技术方法制备的细胞群相当的亲合力(非显著不同)。为确定亲合力，可将自体激活的t细胞用肽稀释液液脉冲，用51铬标记，并用作标准细胞毒性分析中的靶。最渴望的t细胞是杀死用最低浓度的肽脉冲的靶细胞的那些t细胞。可选地，ifnγ生成可利用elispot分析、通过肽稀释液测量。在一个实施方式中，与通过现有技术方法制备的细胞群相比，本公开的细胞群显示杀死靶细胞的能力增加。在一个实施方式中，本公开提供的t细胞群有效体内扩大，以对被靶病毒感染的细胞和/或与靶病毒相关的癌细胞提供适当的免疫应答。本发明还扩展至包括根据本发明的自体t细胞群的组合物。这些组合物可包括稀释剂、载体、稳定剂、表面活性剂、ph调节剂或在主要方法步骤后添加至细胞群的任何其他药学上可接受的赋形剂。赋形剂通常具有稳定化制剂，延长半衰期，使组合物与患者体内系统或类似物更具有相容性的功能。在一个实施方式中，蛋白质稳定剂在生产后被添加至细胞培养物，例如，白蛋白，具体地人血清白蛋白，可充当稳定剂。用于制剂的白蛋白量可以为10至50％w/w，如约12.5％w/w。在一个实施方式中，制剂还包含冷冻保存剂，如dmso。dmso的量通常为20％或更少，如约12％，具体地10％w/w。在实施方式中，本发明的方法包括进一步的步骤：制备药物制剂——通过添加药学上可接受的赋形剂，具体地本文描述的赋形剂，例如，稀释剂、稳定剂和/或防腐剂。本文所用的赋形剂是上位术语，涵盖添加至t细胞群、不具有生物学或生理学功能的所有成分。在最终制剂被制备后，其将被填充到适当的容器中，例如，灌注袋或冷冻小瓶。在一个实施方式中，根据本公开的方法包括进一步的步骤：将t细胞群或其药物制剂填充到适当的容器中，如灌注袋，并将其密封。在一个实施方式中，充有本公开的t细胞群或包括该t细胞群的药物组合物的容器被冷冻储存和运输，例如，在约-135℃下储存，例如，在液氮的蒸气相中储存。在一个实施方式中，本公开的方法包括进一步的步骤：冷冻本公开的t细胞群或包括该t细胞群的药物组合物。在一个实施方式中，通过控速冷冻方法冷冻“产物”，例如，每分钟降低温度1℃，以确保形成的晶体很小并且不扰乱细胞结构。该方法持续进行，直到样品已达到约-100℃。根据本公开的产物意图指代培养的本公开的细胞群或包括该细胞群的药物组合物。在一个实施方式中，产物以冷冻形式被转移、运送、运输至患者的位置。在一个实施方式中，以适于胃肠外给药的形式提供根据本公开的产物，例如，灌注，缓慢注入或弹丸注射。在一个实施方式中，以适于静脉内灌注的形式提供制剂。一方面，本公开提供从生产地点或方便的收集点至目标患者附近运输根据本公开的产物的方法，例如，其中t细胞产物在运输过程中储存在0℃以下，如-135℃。在一个实施方式中，在储存和/或运输期间监测t细胞产物的温度波动。在一个实施方式中，提供用于治疗的本公开的产物，例如，治疗病毒相关疾病或恶性肿瘤，如ebv感染、cmv感染、腺病毒感染、hiv感染、丙肝或乙肝感染、细小病毒感染、流感病毒感染或病毒起源的癌症，例如，ebv相关淋巴瘤或癌、hhv8相关肉瘤、乳头瘤病毒相关癌或sv40相关癌。其他病毒病包括水痘带状疱疹病毒感染、牛痘病毒感染和其中任一种的并发症。在一个实施方式中，治疗免疫抑制患者。在一个实施方式中，患者无免疫损害。在一个实施方式中，提供利用根据本公开的产物治疗患者的方法，包括步骤：给予治疗有效量的本文所述产物。治疗有效量，不一定意为直接治疗有效量，而且包括能够用于体内扩大(给予后)从而提供治疗效果的剂量。因此，提供给予患者治疗有效量的方法，该治疗有效量是扩大后t细胞的亚治疗剂量，其例如能够用于体内扩大从而提供预期治疗效果的。在一个实施方式中，生成的抗原特异性t细胞群对ebv病毒具有特异性，并且防止、减轻或消除感染ebv的细胞和/或其相关临床病理，例如，ebv相关癌症。感染的症状包括发热，咽喉痛和淋巴腺肿大。有时，可发生肿大脾脏或肝脏牵连。心脏问题或中枢神经系统的牵连仅少有发生。ebv在人余生中保持休眠或潜伏在血液的少数细胞中，并且可被再激活，例如，在免疫抑制患者中，当免疫控制减少或不存在时。虽然感染在健康免疫系统的个体中不是致命的，但感染可在免疫抑制患者中导致严重并发症和死亡。ebv最被了解的是作为感染性单核细胞增多症的病因。其还与具体癌症形式相关，具体地霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌和与hiv相关的中枢神经系统淋巴瘤。最后，存在如下证据：病毒感染与较高风险的某些自身免疫性疾病相关，特别是皮肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征和多发性硬化症。在一个实施方式中，治疗的目标患者群患有鼻咽癌。在一个实施方式中，治疗的目标患者群患有胃癌。因此，根据本公开所述对ebv具有特异性的t细胞群可用于治疗或预防一种或多种上述病症。在一个实施方式中，提供治疗或预防水痘带状疱疹病毒感染和/或其相关并发症——包括脑炎、肺炎、带状疱疹后神经痛、带状疱疹、多路带状疱疹(zostermultiplex)、脊髓炎、眼疱疹和无疹性带状疱疹——的方法，包括给予治疗有效量的根据本公开的t细胞群，包括vzv特异性t细胞。在一个实施方式中，提供治疗或预防牛痘病毒感染和/或其相关并发症的方法。在一个实施方式中，应用至少1×107细胞/m2或2×105/kg的剂量。在一个实施方式中，应用约2×107/m2的第一剂量和2×107或1×108t细胞/m2的第二剂量。在一个实施方式中，本公开提供覆盖病毒或癌症抗原(一种或多种)的肽混合物对于生成适用于自体抗原特异性t细胞扩大的自体树突细胞的应用。在一个实施方式中，本公开提供覆盖病毒或癌症抗原(一种或多种)的肽混合物对于生成适用于抗原特异性t细胞扩大的自体t-apc的应用。在一个实施方式中，本公开提供ak562细胞或用作共同刺激因子的其他人造共同刺激因子——而在抗原特异性t细胞(具体地，自体t细胞扩大)扩大中其上无伴随递呈抗原——例如与t-apc联合用于抗原特异性t细胞——特别是抗原特异性t细胞，如自体抗原特异性t细胞——的扩大的应用。在一个实施方式中，提供试剂盒，包括覆盖病毒或癌症抗原(一种或多种)的肽混合物和人造共同刺激因子如ak562细胞，具体地用于t细胞扩大，如自体抗原特异性t细胞扩大。在一个实施方式中，试剂盒进一步包括il-15。在一个实施方式中，试剂盒包括覆盖病毒或癌症抗原(一种或多种)的肽混合物和il-4和il-7，用于抗原特异性t细胞例如自体抗原特异性t细胞的扩大。方案和实施例缩写apcs抗原递呈细胞atc激活的t细胞ctls溶细胞性t淋巴细胞dcs树突细胞ebveb病毒(来自疱疹病毒家族的病毒)lcl类淋巴母细胞细胞系ebv-lcl感染ebv的类淋巴母细胞细胞系lmp1潜伏膜蛋白1，uniprot编号p03230lmp2潜伏膜蛋白2，uniprot编号q1hvj2barf1bamhi右方阅读框编码的蛋白质，uniprot编号p03228ebna1ebv核抗原1，uniprot编号p03211pbmc外周血液单核细胞cmv巨细胞病毒方案1：处理样品以获得pbmc以下步骤应在经过认证的生物安全柜中利用无菌技术和遵循一般防护措施进行。在环境温度(室温)下，将血液样品或单采血液成分术样品或棕黄层样品(其是密度梯度离心后抗凝血液样品中包含大多数血液白细胞和血小板的部分)用等体积dulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基(例如，rpmi1640可来自lifetechnologies)稀释。在50ml离心管中，将15ml淋巴制剂小心地用约30ml稀释血液覆盖。该步骤可被调整以利用到全部可利用的细胞。在环境温度、400×g下离心材料约40分钟。可将等份，例如，3×1ml的血浆等份储存在-80℃下。将pbmc界面收集到等体积的dulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基(例如，rpmi1640可来自lifetechnologies)中。在室温、约450×g下离心约10分钟，然后吸出上清液。使获得的小球松散并将其再悬浮于约20mldulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基(例如，rpmi1640可来自lifetechnologies)中。如果该方法进行多次，则可将细胞组合在单一离心管中，并充分再悬浮。通常通过如下计数细胞：移除20μl细胞并添加20μl的50％红细胞溶解缓冲液，并根据生产指令利用血细胞计数器计数。pbmc可用于扩大抗原特异性t细胞、扩大cd3和cd28激活t细胞和制备树突细胞。注意：由于制备的pbmc细胞最终意在灌注到患者体内，附加于患者样品的确定和处理的程序是至关重要的。一次应仅处理一个患者的样品。通常回收的pbmc的数量处于每ml血液0.5至2.0×106个pbmc的范围内。可从棕黄层回收上至1×109个。参考文献：siliu等large-scaleexpansionofdendriticcell-primedpolycolonalhumancytotoxict-lymphocytelinesusinglymphoblastoidcellsforadoptiveimmunotherapy.j.immuother.2003may-jun:26(3):241-56。leenam等contact-activatedmonocytes:efficientantigenpresentingcellsforthestimulationofantigen-specifictcells.jimmunother.2007jan:30(1):96-107。bollardcm等thegenerationandcharacterizationoflmp2-specificctlforuseasadoptivetransferfrompatientswithrelapsedebv-positivehodgkindiseasej.immunother。方案2：树突细胞的生成树突细胞可通过在gm-csf和il-4中培养从cd14选择的pb单核细胞(pbmc)的粘附分化。然后可利用gm-csf、il-4、il-1β、il-6、tnf-α和pge-1或pge-2(pge＝前列腺素e)使树突细胞成熟化。负载有肽的树突细胞可通过tcr在hlai类和ii类分子上向抗原特异性t细胞递呈肽。粘附pbmc的制备-在环境温度(室温)下将肝素化外周血液，例如，30ml，在等体积的dulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基(例如，rpmi1640可来自lifetechnologies)中稀释。可选地，解冻此前冷冻的pbmc，在cellgenixdc培养基中洗涤两次，和计数细胞。在50ml离心管中，将15ml淋巴制剂小心地用约30ml稀释血液覆盖。可调整该步骤以利用全部可利用的细胞。在环境温度、400×g下离心材料约40分钟。将pbmc界面收集到等体积dulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基(例如，rpmi1640可来自lifetechnologies)中。在室温、约450×g下离心约10分钟，然后吸出上清液。使获得的小球松散，并将其再悬浮于约20mldulbecco磷酸缓冲溶液中。上述步骤与实施例相同，然后将材料在室温、400×g下离心约5分钟。然后移除上清液，并将小球再悬浮于20mldc培养基中。如实施例1所述计数细胞。如果浓度大于5×106/ml，则通过添加cellgenixdc培养基调节至5×1066/ml。如果浓度小于5×106/ml，则将小球以5×106/ml再悬浮于cellgenixdc培养基中。转移10ml细胞/75cm2烧瓶，或2ml细胞/孔的6孔板。转移至37℃和5％二氧化碳约2小时。冲洗烧瓶三次，10mldulbecco磷酸缓冲盐水或rpmi培养基组合包含pbmc非粘附部分的上清液。向t-75培养瓶(可来自falcon)添加10ml包含1000单位/ml的il-4和800单位/ml的gm-csf的dc培养基，至粘附细胞。向6孔板添加2ml包含1000单位/ml的il-4和800单位/ml的gm-csf的dc培养基，至粘附细胞。转移烧瓶或板至37℃和5％二氧化碳的温育箱。如此前未被冷冻保存，可冷冻保存非粘附细胞以备响应t细胞制备中的后续应用。在第3或4天，添加1000单位/ml的il-4和800单位/ml的gm-csf。添加的细胞因子概述被提供在表1中：然后在37℃和5％二氧化碳下温育培养物约2天，然后将树突细胞准备好作为刺激剂制备自体pbmc。收集和计数树突细胞。注意，细胞在洗涤数次时损失，因此当限制树突细胞数量时可省略洗涤步骤。树突细胞不分裂，并且辐射的省略不重要。如果收集到大于5×105的转导树突细胞，则将约105连同非转导的树突细胞送去表型分析——如果后者是可获得的。如果收集到小于5×105的转导树突细胞，则进行肽负载。离心后吸出上清液，并每1×106树突细胞添加5μl(5ng)各肽库(即，各抗原)。然后将混合物在5％二氧化碳温育箱中温育30至60分钟，然后在30gy下辐射。将细胞再悬浮于20ml培养基中，并在400×g下离心约5分钟。用ctl培养基以105/ml再悬浮细胞。树突细胞现准备好用作pbmc的刺激剂。如同实施例1，由于这些细胞将被注入患者，必须遵循适当的程序。总树突细胞回收率应为起始群的1至8％。参考文献：gahnb等adenoviralgenetransferintodendriticcellsefficientlyamplifiestheimmuneresponsetothelmp2a-antigen；apotentialtreatmentstrategyforebvvirus-positivehodgkin’slymphoma.int.j.cancer2001sep1；93(5):706-13。bollardcm等thegenerationandcharacterisationoflmp2-specificctlsforuseinadoptivetransferfrompatientswithrelapsedebv-positivehodgkindiseasej.immunother(1997).2004jul-aug；27(4):317-327。gottschalks等generatingctlsagainstsubdominantepstein-barrviruslmp1antigenfortheblood2003mar1；101(5):1905-12。方案3：t-apc的生成1.用cd3和cd28抗体(miltenyi)涂覆非组织培养处理的24孔板或t-75非组织培养处理的烧瓶1.1基于以1×106细胞/孔或30-50×106细胞/t-75烧瓶铺板的pbmc数量，计算所要涂覆的孔/烧瓶数量1.2对于孔，板0.5ml包含1ngcd3的h2o(5μl/mlh2o中0.2mg/ml原液)和1gcd28(2l/mlh2o中0.5mg/ml原液)每孔。1.3对于t-75烧瓶，在用18mlh2o预洗涤后；每烧瓶在18mlh2o中应用90μlcd3(原液0.2mg/ml)和36μlcd28(原液0.5mg/ml)。1.4在37℃温育箱中温育至少3小时。1.5任选的：cd3-cd28涂覆板可在4℃下温育过夜。2.洗涤孔或烧瓶2.1移除cd3/28溶液，并且每个孔用1mlpbs或培养基冲洗一次或每个t-75烧瓶用10mlpbs或培养基冲洗一次。3.在30mlt细胞培养基(10％人ab血清、45％rpmi1640(或高级rpmi)、45％ehaa和200mml-谷氨酰胺)中以2×106再悬浮pbmc3.1每个cd3/28涂覆孔等份2ml，或每个t-75烧瓶等份15至25ml。3.2转移至温育箱2天，其中烧瓶放平。4.在第2天添加100单位/ml的il-2。5.在第4至5天细胞再悬浮细胞和计数。6.根据获得的细胞数量划分细胞6.15×106细胞/grex106.25×107/grex100。7.3至4天后，收集细胞和计数7.1如步骤4进一步扩大7.2或冷冻保存8.冷冻保存8.1离心细胞，并吸出上清液8.2轻弹小球以再悬浮，并转移至冰10至30分钟8.3以5×106至10×106细胞/ml冰冷的冷冻保存培养基(10％dmso、50％人ab血清、40％rpmi1640)再悬浮8.4转移至冷冻容器(冷冻袋或冷冻小瓶)8.5在冷冻容器中以～-1℃/分钟冷冻至少90分钟，然后转移至液氮9.在抗原递呈细胞应用前，t细胞必须在cd3/28抗体涂覆板上如步骤3被再刺激2至4天，以上调共同刺激分子9.1该步骤是关键的，因为如果t细胞具有休眠表型，则其可诱导t调节细胞。方案4:应用本发明的优选实施方式扩大自体抗原特异性t细胞1.以2×106/ml包含il-4和il-7的t细胞培养基，再悬浮pbmc。t细胞培养基是10％人ab血清、45％高级rpmi、45％ehaa和200mml-谷氨酰胺。il-4以20ng/ml(10ng/ml最终稀释液)，并且il7以3332单位/ml(1666u/ml最终稀释液)添加2.以1×105至2×105/ml再悬浮肽涂覆的树突细胞3.以1：1比混合pbmc和dc4.每个grex-10转移20ml(20×106pbmc)，并添加10ml另外的包含il-4(1666单位/ml)和il-7(10ng/ml)的培养基。转移至温育箱7天5.在第7天移除20ml培养基再悬浮细胞并计数。如果>50×106细胞，在两个grex-10之间划分。如果<50×106，留置在一个grex-10中。每个grex-10添加包含il-4和il-7的培养基至30ml(il-4的最终浓度为1666单位/ml，并且il-7的最终浓度为10ng/ml)再转移至温育箱2至3天6.在第9或10天，用肽涂覆的t-apc和ak562细胞再刺激从grex收集响应t细胞并计数以1×106细胞/ml再悬浮转移至温育箱6.1制备ak562-cs细胞以提供5:1的ak562-cs与t细胞的比6.1.1用100gy(grays)辐射ak562-cs细胞6.1.2离心5分钟和400g6.1.3再悬浮在完全t细胞培养基中6.1.4计数并估测所需ak562-cs细胞数量6.1.4.1响应t细胞数量x56.2制备肽脉冲的、辐射的激活自体t细胞(t-apc)6.2.1自体t细胞(atcs)应在使用前已用cd3/28刺激或再刺激2至4天6.2.2收集足以刺激的数量的atc，另加～30％用于处理过程中的损失6.2.3以400g离心细胞5分钟并吸出上清液6.2.4通过手指轻弹，松散细胞小球6.2.5每10×106atc添加10ng各肽6.2.6在37℃、空气中5％co2下温育30至90分钟6.2.7再悬浮在～20ml培养基中6.2.8辐射30gy6.2.9以400g离心5分钟并吸出上清液6.2.10以106细胞/ml再悬浮6.3每个grex-100组合1×107响应t细胞和1×107t-apc和5×107辐射后的ak562-cs细胞6.3.1添加培养基至400ml6.3.2添加10ng/mlil-7(2mg)和6.6×105单位的il-46.3.3转移至温育箱3至4天7.添加il-2(50至100单位/ml)或il-1510ng/ml7.1返回培养3至4天7.2每3至4天添加细胞因子8.从第7天开始测量葡萄糖8.1移除1滴培养基并在标准手持血糖仪中测试8.2小于100的葡萄糖水平将引发培养基/细胞因子变化8.3当已获得足够数量时，应冷冻保存响应t细胞9.如获得不足量的细胞，可进行第三刺激(步骤7、8和9)实施例1：健康供体和鼻咽癌和淋巴瘤患者的ebna1、lmp1&lmp2特异性t细胞的生成。子实验：淋巴瘤患者1的ebna1，lmp1&lmp2特异性t细胞的生成。d1涂覆okt3/cd28板通过添加5ugokt3和cd28抗体中的每一种至5ml无菌水，制备okt3和cd28抗体。添加0.5ml该混合物到非组织培养物处理的24孔板(24-w-p)的各孔中。在4℃下温育过夜。注意：这是培养第(-)8天。d2通过粘附&由非粘附pbmc群生成okt3母细胞，由冷冻pbmc生成树突细胞–培养第(-)7天淋巴瘤患者1的外周血液单核细胞(pbmc)冷冻原液取自gmp库，继而在pi允许(cathbollard)的情况下取样：4瓶pbmc，在2010年2月和3月之间全部冷冻，每瓶500万，共2000万。将pbmc在2瓶40ml温cellgenix培养基中解冻并旋降。患者pbmc计数为1：2250万旋降患者1的pbmc并再悬浮在总计6ml的温cellgenix培养基中，然后将pbmc平铺在24-w-p的3个孔中，其中2ml/孔。3小时后，将非粘附部分用无菌pbs轻轻洗脱两次，并用具有il4和gm-csf的cellgenix代替培养基。在37℃下温育。利用非粘附部分生成okt3母细胞。okt3母细胞生成：将在前一天用okt3和cd28涂覆并储存在4℃下的板每孔用0.5mlt细胞培养基洗涤一次。将pbmc的非粘附部分平铺到～10孔中。在37℃下温育d3通过用具有100单位的il2/ml的ctl培养基代替孔中1/2的培养基，向okt3母细胞供应以il2，使得最终培养物浓度为50单位/mld4通过用具有il4&gmp-csf的新制培养基代替每孔1ml培养基，向dc供应以il4&gmp-csf。将okt3母细胞移入新组织培养物处理的24-w-p。在37℃下温育。d7通过刮削收集细胞，计数，旋降，然后以5000的moi添加ad-lmp1-lmp2，用ad-lmp1-lmp2转导1孔的各患者dc。患者1：50万dc，因此添加在5×1012vp/ml浓度下的0.5ul病毒每～15分钟轻弹小管，同时在37℃下温育1.5hrs。将细胞再悬浮回包含gm-csf、il4、il1b、il6、tnfa、和pge2的培养基中，并且各自铺板回24-2-p的具有2ml培养基的1孔中。对于无腺病毒载体的情况，取出1/2培养基，然后将具有2×gmp-csf、il4、il1b、il6、tnfa和pge2的cellgenix培养基添加回孔中。在37℃下温育通过更换培养基或将细胞划分到额外的孔，持续供应okt3母细胞。d9d0建立第一刺激。收集并计数树突细胞：患者1：非转导dcs：20万；转导dc：5万从gmp(在2009冷冻的细胞)移除一冷冻小瓶的患者1pbmc进行刺激，然后利用具有30％fbs的温ctl培养基解冻细胞：患者1：1瓶冷冻pbmc，1000万每瓶，回收800万用混合肽脉冲dc和全部pbmc通过各添加1ul混合肽原液(在dmso中)到200ul无菌pbs中，稀释ebna1、lmp1和lmp2混合肽。从两供体旋降全部非转导dc，并吸出除～50ul培养基外的全部。通过轻弹小管，松散小球。添加～10ul稀释混合肽至小球，在37℃下温育30min，并且间或轻弹。从供体1各取出300万pbmc至新的干净小管，旋降，并吸出除～50ul培养基外的全部。添加～3ul稀释混合肽到小球中。在37℃下温育30min，并且间或轻弹。建立患者1的第0天t细胞培养：当前gmp情况：温育后旋降和再悬浮dc到0.5ml培养基中；取出100万pbmc，旋降并再悬浮于0.5ml完全ctl培养基(200万每ml)中。添加两者到48-w-p的孔中。添加5ugil15，得到最终浓度5ng/ml。此情况的dc:pbmc比为1:20。在37℃下温育。dc(px)情况：用20mlpbs洗涤混合肽脉冲的dc。再悬浮于2ml完全ctl培养基，24-w-p的每孔平铺1ml。取出400万pbmc，旋降并以200万/ml再悬浮。以2×浓度(20ng/ml)添加il4&il7至pbmc。添加1ml到已载有dc的各孔中，使il4和il7的最终浓度降至10ng/ml。此情况的dc:pbmc比为1:20。在37℃下温育px情况：再悬浮pbmc小球于2ml完全ctl培养基中，以10ng/ml添加il4和il7，平铺到24-w-p的1孔中。在37℃下温育。d10患者1的okt3母细胞扩大至2完全24-w-p。计数：6500万。在4小瓶中冷冻，其中每个小瓶～1500万细胞。d15涂覆okt3/cd28板通过添加5ugokt3和cd28抗体中每一种至5ml无菌水，制备okt3和cd28抗体。添加0.5ml该混合物到非组织培养处理的24孔板(24-w-p)的各孔中。在4℃下温育过夜。d16用ad-lmp1-lmp2转导lcl从供体1培养物取出～300万lcl，旋降，然后以5×1012vp/ml浓度添加3ul病毒，得到5000的moi。在37℃下温育1.5hr，并且间隔轻弹小管。温育后，再悬浮细胞于～5ml完全rpmi中。在37℃下温育激活okt3母细胞：在具有30％fbs的温ctl培养基中解冻每瓶1000万的来自供体1的okt3母细胞的每个小瓶。旋降细胞，并再悬浮于20mlctl培养基中。洗涤涂覆有ctl培养基的okt3&cd28板，然后平铺细胞到24-w-p的10孔中。在37℃下温育。d18培养第10天收集并计数第10天的患者1的t细胞：gmp情况：2.1300万dc(px)情况：240万px情况：304万收集患者1的okt3母细胞，并在30gy下辐射。计数：1340万收集ak562cs并在100gy下辐射。计数：440万。洗涤，旋降并再悬浮于11ml中，获得细胞浓度40万/ml收集患者1的转导lcl，在40gy下辐射。计数：570万由于不具有足够的细胞用于通过elispot或淋巴细胞亚型表型分析来测试抗原特异性，我们仅刺激这些培养物。第二刺激：用混合肽脉冲okt3母细胞：-通过各添加1ul混合肽原液(在dmso中)到200ul无菌pbs中，稀释ebna1、lmp1和lmp2混合肽。-旋降okt3母细胞并吸出除～50ul培养基外的全部。通过轻弹小管，松散小球。添加～20ul稀释混合肽至小球，在37℃下温育30min，并且间或轻弹。用20mlpbs洗涤，旋降。-以100万/ml的浓度再悬浮okt3母细胞gmp情况：旋降lcl并再悬浮于14.25mlctl培养基中，得到浓度40万/ml。平铺0.5ml或20万lcl到24-w-p的4孔中。旋降d9t细胞，用于gmp情况，再悬浮于4ml，得到每孔约60万t细胞，并添加1ml至具有lcl的4孔中的各孔。t细胞与lcl的比为约3:1。在37℃下温育。dc(px)情况：旋降dc(px)第9天的t细胞，再悬浮于4ml——其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml的t细胞培养基中。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后添加0.5mlak562cs到各孔中，得到每孔最终体积2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c的比为1:1:1(由于可用的ak562c总量低，所以ak562c比低)。在37℃下温育。px情况：旋降px第9天的t细胞，再悬浮于6mlt细胞培养基——其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后添加0.5mlak562c到各孔，得到最终体积每孔2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c的比为1:1:1(由于可用的ak562c总量低，所以ak562c比低)。在37℃下温育。d21通过用1ml具有100单位il2/ml的培养基替换各孔中1ml培养基，在第14天添加il2至培养物，得到最终il2浓度50单位/ml。d22涂覆okt3/cd28板通过添加5ugokt3和cd28抗体的每一种至5ml无菌水，制备okt3和cd28抗体。添加0.5ml该混合物到非组织培养处理的24孔板(24-w-p)的各孔中。在4℃下温育过夜。d23通过解冻具有2000万细胞的冷冻小瓶，激活患者1okt3母细胞，然后将其平铺在okt3/cd28涂覆板上。通过悬降200万lcl、留置～50ul培养基来转导患者1的lcl，然后以5×1012vp/ml添加2ulad-lmp1-lmp2，得到5000的moi。每～15min轻弹小管，并且1.5hrs后再悬浮于5ml完全rpmi培养基中。d24培养第16天：用无任何细胞因子的新制培养基代替培养基。在37℃下温育。涂覆板，用于elispot分析，在d17：-以每孔50ul的35％etoh预湿96-w稳定素-p膜板。用pbs洗涤。-通过添加100ug纯化的鼠抗人ifnγ1-d1k抗体至10ml涂覆缓冲液，制备ifnγ溶液。每孔添加100ul至涂覆板。在4℃下储存过夜。d25培养第天17收集并计数患者1第17天的t细胞：gmp情况：8.2百万dc(px)情况：5.5百万px情况：15.6百万收集，在30gy下辐射并计数okt3母细胞：1360万收集，在40gy下辐射并计数患者1lcl：120万收集，在100gy下辐射并计数ak562c：2250万。建立elispot分析以检测ifnγ释放：-在37℃下用t细胞培养基阻断96-w-板(其中膜在前一天用ifnγ一抗涂覆)1hr。-制备响应细胞：从gmp情况取出～150万t细胞，从dc(px)情况取出80万，和从px情况取出80万，旋降，并以50万/ml再悬浮。-通过添加4ul混合肽在dmso中的原液(0.2ug/ul)到800ul下列抗原的t细胞培养基中，制备混合肽溶液：ebna1、lmp1、lmp2，并添加1.5ul混合肽的dmso原液到300ul下列抗原的t细胞培养基中：ebna3a、ebna3b、ebna3c、bzlf1、ny-eso1(不相关抗原，用于阴性对照)，金黄色葡萄球菌超抗原(staphaureussuper-antigen)(阳性对照)。通过如下制备患者1的lcl：取出～100万细胞，旋降，以100万/ml再悬浮。如下添加这些抗原和靶至响应t细胞，其中每个空间表示2个孔(一式两份)：-添加100ul或50,000细胞到各孔中，其中gmp24孔，dc(px)和px各12孔。-在37℃下温育过夜。任选的步骤第三刺激：用混合肽脉冲okt3母细胞：-通过各添加1ul混合肽原液(在dmso中)到200ul无菌pbs中，稀释ebna1、lmp1和lmp2混合肽。-旋降okt3母细胞和吸出除～50ul培养基外的全部。通过轻弹小管，松散小球。添加～20ul稀释混合肽至小球，在37℃下温育30min，并且间或轻弹。用20mlpbs洗涤，旋降。-以100万/ml的浓度再悬浮okt3母细胞，然后进一步稀释至40万/mlgmp情况：旋降辐射后的lcl，并且再悬浮于10mlctl培养基，得到浓度12万/ml。各平铺10万或1ml到24-w-p的6孔中。旋降300万d17t细胞用于gmp情况，再悬浮于6mllcl和添加1mllcl至6孔的每个孔。t细胞与lcl的比为约4:1。在37℃下温育。冷冻其余t细胞dc(px)情况：旋降200万dc(px)第17天t细胞，再悬浮于10mlt细胞培养基——其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后添加0.5mlak562c到各孔中，得到最终体积每孔2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c的比为2:2:5。在37℃下温育。(增加t细胞和okt3母细胞浓度，因为第二刺激后的生长不多)。冷冻其余t细胞.px情况：旋降200万px第17天t细胞，再悬浮于10mlt细胞培养基——其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后添加0.5mlak562c到各孔中，得到最终体积每孔2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c的比为2:2:5。在37℃下温育。(增加t细胞和okt3母细胞浓度，以匹配dc(px)情况)。冷冻其余t细胞。d29创建elispotifnγ板。通过添加10ul抗体至10mlpbs+0.5％bsa制备ifnγ二抗(7b6-1生物素)，然后通过0.2ul过滤器过滤，以去除结合的抗体团，防止非特异性结合。每孔每次用100ulpbs+0.05％吐温洗涤板6次。添加100ul该二抗溶液至各孔。在37℃下温育2小时。1.5小时后，制备10ml卵白素-过氧化物酶复合物在pbs+0.05％吐温中的溶液，混合，并在室温下温育。在2hr结束时，将板每孔每次用100ulpbs+0.05％吐温洗涤6x。添加100ul卵白素-过氧化物酶复合物溶液至各孔，在室温下温育1小时。在温育结束时，通过如下制备aec底物：先将aec片剂溶解到2.5ml二甲基甲酰胺中，然后添加47.5ml乙酸盐缓冲液(4.6ml0.1n乙酸、11ml乙酸钠、47ml水)，再添加25ul30％过氧化氢，混合&通过0.45ul过滤器过滤。将板用pbs+0.05％吐温洗涤，重复3次，用pbs洗涤，重复3次，添加aec底物，并使其发展上至4分钟。通过水冲洗停止反应。剥离背侧并干燥膜。冲出(punchout)结果并送去计数。d31通过用1ml具有100单位il2/ml的培养基代替各孔1ml培养基，在第20天添加il2至培养物，得到最终il2浓度50单位/ml。d32涂覆okt3/cd28板通过各添加5ugokt3和cd28抗体至5ml无菌水，制备okt3和cd28抗体。添加0.5ml该混合物到非组织培养处理的24孔板(24-w-p)的各孔中。在4℃下温育过夜。d33通过以～100万每孔在okt3/cd28涂覆的板上平铺进行中的患者1的okt3母细胞培养物，激活患者1的okt3母细胞。通过如下转导患者1lcl：悬降200万lcl，留下～50ul培养基，然后以5×1012vp/ml添加2ulad-lmp1-lmp2，得到5000的moi。每～15min轻弹小管，并且1.5hrs后再悬浮于5ml完全rpmi培养基中。d34培养第23天：用无任何细胞因子的新制培养基代替培养基，并划分任何超过～400万细胞的孔。在37℃下温育。涂覆板，用于elispot分析：-用每孔50ul35％etoh预湿96-w稳定素-p膜板。用pbs洗涤。-通过添加100ug纯化鼠抗人ifnγ1-d1k抗体至10ml涂覆缓冲液，制备ifnγ溶液。添加100ul/孔至涂覆板。在4℃下储存过夜。d35培养第24天收集患者1第24天t细胞培养物并计数：gmp情况：2220万dc(px)情况：3980万px情况：1620万收集okt3母细胞，在30gy下辐射并计数：980万收集患者1lcl，在40gy下辐射并计数：230万收集ak562c，在100gy下辐射并计数：2000万建立elispot分析以检测ifnγ释放：-在37℃下用t细胞培养基阻断涂覆的96-w-板1hr。-制备响应细胞：从gmp情况、dc(px)情况和px情况各取出～250万t细胞，旋降，并以100万/ml再悬浮。-通过如下制备混合肽溶液：添加4ul混合肽在dmso中的原液(0.2ug/ul)到800ul下列抗原的t细胞培养基中：ebna1、lmp1、lmp2，并添加1.5ul混合肽的dmso原液到300ul下列抗原的t细胞培养基中：ebna3a、ebna3b、ebna3c、bzlf1、ny-eso1(不相关抗原，用于阴性对照)，金黄色葡萄球菌超抗原(阳性对照)。通过如下制备患者1的lcl：取出～100万细胞，旋降，以100万/ml再悬浮。如下添加这些抗原和靶至响应t细胞，其中每个空间表示2个孔(一式两份)：-添加100ul或50,000细胞到各孔中，其中gmp24孔，dc(px)和px各12孔。-在37℃下温育过夜。建立淋巴瘤患者1t细胞和自体lcl的共培养对于每种情况，添加t细胞和lcl到24-w-p的孔至如下比：t细胞与lcl的比40:120:110:15:11:11:1异源lclt细胞计数(百万)0.50.50.50.50.50.5lcl细胞计数(百万)0.01250.0250.050.10.50.5添加il2至培养物，得到最终浓度50u/ml，并用移液管轻轻混合。第0天通过如下进行表型分析：取出200ul各培养物，用3mlpbs+0.5％fbs洗涤，旋降，吸出上清液，并添加5ul下列抗体的每一种：cd19-pe、cd56-fitc和cd3-percp。在4℃下温育1小时。用3mlpbs洗涤，旋降，吸出上清液，并且每管添加250ulcytofix和50ulcountbright小珠。利用流式细胞仪进行分析。第四刺激：用混合肽脉冲okt3母细胞：-通过各添加1ul混合肽原液(在dmso中)到200ul无菌pbs中，稀释ebna1、lmp1和lmp2混合肽。-旋降okt3母细胞并吸出除～50ul培养基外的全部。通过轻弹小管，松散小球。添加～20ul稀释混合肽至小球，在37℃下温育30min，并且间或轻弹。用20mlpbs洗涤，旋降。-以100万/ml的浓度再悬浮okt3母细胞，然后进一步稀释至40万/ml-以200万/ml再悬浮ak562cgmp情况：旋降辐射后的lcl，并再悬浮于18.4mlctl培养基，得到浓度12万/ml。24-w-p的10孔中各平铺12万或1ml。旋降500万d24t细胞用于gmp情况，再悬浮于10mllcl并且各添加1mllcl至10孔。t细胞与lcl的比为约4:1。在37℃下温育。冷冻其余t细胞dc(px)情况：旋降200万dc(px)第24天t细胞，再悬浮于10mlt细胞培养基，其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后以200万/ml添加0.5mlak562c到各孔中，得到最终体积每孔2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c比为1:1:5。在37℃下温育。冷冻其余t细胞。px情况：旋降200万px第24天t细胞，再悬浮于10mlt细胞培养基，其中2×il4和il7浓度处于20ng/ml。24-w-p的每孔平铺1ml。添加0.5ml混合肽脉冲的okt3母细胞，然后添加0.5mlak562c到各孔中，得到最终体积每孔2ml，其中t细胞:okt3母细胞:ak562c比为1:1:5。在37℃下温育。冷冻其余t细胞。d36创建elispotifnγ板。通过如下制备ifnγ二抗(7b6-1生物素)：添加10ul抗体至10mlpbs+0.5％bsa，然后通过0.2ul过滤器过滤，以去除结合的抗体团块，从而防止非特异性结合。每孔每次用100ulpbs+0.05％吐温洗涤板6x。添加100ul该二抗溶液至各孔。在37℃下温育2小时。1.5小时后，制备10ml在pbs+0.05％吐温中的卵白素-过氧化物酶复合物溶液，混合，并在室温下温育。在2hr结束时，每孔每次用100ulpbs+0.05％吐温洗涤板6x。添加100ul卵白素-过氧化物酶复合物溶液至各孔，在室温下温育1小时。在温育结束时，通过如下制备aec底物：先溶解aec片剂到2.5ml二甲基甲酰胺中，然后添加47.5ml乙酸盐缓冲液(4.6ml0.1n乙酸、11ml乙酸钠、47ml水)，再添加25ul30％过氧化氢，混合&通过0.45ul过滤器过滤。将板用pbs+0.05％吐温洗涤，重复3x，用pbs洗涤，重复3x，添加aec底物，并使其发展上至4分钟。通过水冲洗停止反应。剥离背侧并干燥膜。冲出结果并送去计数。共培养第2天表型分析-用1ml具有100单位的il2的新制t细胞培养基代替1ml培养基。-第2天通过如下进行表型分析：取出各情况的200ul，用3mlpbs+0.5％fbs洗涤，旋降，吸出上清液，并添加5ul下列抗体的每一种：cd19-pe、cd56-fitc和cd3-percp。在4℃下温育1小时。用3mlpbs洗涤，旋降，吸出上清液，并且每管添加250ulcytofix和50ulcountbright小珠。利用流式细胞仪进行分析。d38共培养第4天表型分析取出各情况的200ul，用3mlpbs+0.5％fbs洗涤，旋降，吸出上清液，并添加10ul下列抗体的每一种：cd19-pe、cd56-fitc和cd3-percp(增加抗体量，以匹配增加的细胞计数)。在4℃下温育1小时。用3mlpbs洗涤，旋降，吸出上清液，并且每管加入250ulcytofix和50ulcountbright小珠。利用流式细胞仪进行分析。通过用1ml具有100单位il2/ml的培养基代替各孔中的1ml培养基，添加il2至第20天培养物，得到最终il-2浓度50单位/ml。淘汰汇合孔。d39共培养第5天表型分析取出各情况的200ul，用3mlpbs+0.5％fbs洗涤，旋降，吸出上清液，并添加10ul下列抗体的每一种：cd19-pe、cd56-fitc和cd3-percp。在4℃下温育1小时。用3mlpbs洗涤，旋降，吸出上清液，并且每管添加250ulcytofix和50ulcountbright小珠。利用流式细胞仪进行分析。d41培养第30天：用无任何细胞因子的新制培养基代替培养基和划分任何超过～400万细胞的孔。在37℃下温育。涂覆板，用于elispot分析：-每孔用50ul35％etoh预湿96-w稳定素-p膜板。用pbs洗涤。-通过添加100ug纯化的鼠抗人ifnγ1-d1k抗体至10ml涂覆缓冲液，制备ifnγ溶液。添加100ul每孔至涂覆板。在4℃下储存过夜。d42培养第31天收集患者1第31天t细胞培养物并计数：gmp情况：1720万；dc(px)情况：2060万；px情况：2680万结果表2：整体培养扩大：与当前标准方案(gmp)相比，利用katpx建立的培养到4th刺激结束时的扩大如不是更好也是同等良好。表2：生长，以百万细胞计：d0d9d16d23d30ad-dc12.138.31714361.54686211.7212dc10.61.37527.3625281.8338px11.0133335.26933342.6816571.9334我们已优化新抗原递呈复合物katpx，其产生同等良好或更好的扩大和在淋巴瘤患者体内较高的抗ebna1、lmp1和lmp2的t细胞抗原特异性频率。这些细胞有效消除了共培养物中的肿瘤细胞，并且这种杀伤是hla特异性的。此外，利用此方法消除了对lcl和腺病毒载体的需求，因此减少传代时间以及对lcl和腺病毒载体表达的旁观抗原具有特异性的t细胞的激活。能够考虑到，可组合一个以上本文描述的实施方式，如技术上适宜。在本说明书的背景下，“包含”被解释为“包括”。包含特定要素的本公开方面也意图扩展至可选的实施方式——由相关要素“组成”或“主要(由相关要素)组成”。本文涉及的所有参考文献均被具体引入作为参考。序列表<110>细胞药物有限公司<120>扩大t细胞的方法<130>p000072_wo<150>us61/569,577<151>2011-12-12<160>340<170>patentinversion3.5<210>1<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>1metseraspgluglyproglythrglyproglyasnglyleugly151015<210>2<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>2glyproglythrglyproglyasnglyleuglyglulysglyasp151015<210>3<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>3glyproglyasnglyleuglyglulysglyaspthrserglypro151015<210>4<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>4glyleuglyglulysglyaspthrserglyprogluglysergly151015<210>5<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>5lysglyaspthrserglyprogluglyserglyglyserglypro151015<210>6<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>6serglyprogluglyserglyglyserglyproglnargarggly151015<210>7<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>7glyserglyglyserglyproglnargargglyglyaspasnhis151015<210>8<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>8serglyproglnargargglyglyaspasnhisglyargglyarg151015<210>9<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>9argargglyglyaspasnhisglyargglyargglyargglyarg151015<210>10<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>10aspasnhisglyargglyargglyargglyargglyargglygly151015<210>11<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>11argglyargglyargglyargglyargglyglyglyargprogly151015<210>12<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>12argglyargglyargglyglyglyargproglyalaproglygly151015<210>13<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>13argglyglyglyargproglyalaproglyglyserglysergly151015<210>14<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>14argproglyalaproglyglyserglyserglyproarghisarg151015<210>15<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>15proglyglyserglyserglyproarghisargaspglyvalarg151015<210>16<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>16glyserglyproarghisargaspglyvalargargproglnlys151015<210>17<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>17arghisargaspglyvalargargproglnlysargprosercys151015<210>18<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>18glyvalargargproglnlysargprosercysileglycyslys151015<210>19<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>19proglnlysargprosercysileglycyslysglythrhisgly151015<210>20<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>20prosercysileglycyslysglythrhisglyglyargglyarg151015<210>21<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>21glycyslysglythrhisglyglyargglyargglyglysergly151015<210>22<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>22thrhisglyglyargglyargglyglyserglyglyargarggly151015<210>23<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>23argglyargglyglyserglyglyargargglyargglyargglu151015<210>24<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>24glyserglyglyargargglyargglyarggluargalaarggly151015<210>25<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>25argargglyargglyarggluargalaargglyglyserargglu151015<210>26<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>26glyarggluargalaargglyglyserarggluargalaarggly151015<210>27<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>27alaargglyglyserarggluargalaargglyargglyarggly151015<210>28<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>28serarggluargalaargglyargglyargglyargglyglulys151015<210>29<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>29alaargglyargglyargglyargglyglulysargproargser151015<210>30<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>30glyargglyargglyglulysargproargserprosersergln151015<210>31<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>31glyglulysargproargserproserserglnserserserser151015<210>32<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>32proargserproserserglnserserserserglyserpropro151015<210>33<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>33serserglnserserserserglyserproproargargpropro151015<210>34<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>34serserserglyserproproargargproproproglyargarg151015<210>35<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>35serproproargargproproproglyargargprophephehis151015<210>36<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>36argproproproglyargargprophephehisprovalglyglu151015<210>37<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>37glyargargprophephehisprovalglyglualaasptyrphe151015<210>38<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>38phephehisprovalglyglualaasptyrpheglutyrhisgln151015<210>39<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>39valglyglualaasptyrpheglutyrhisglngluglyglypro151015<210>40<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>40asptyrpheglutyrhisglngluglyglyproaspglyglupro151015<210>41<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>41tyrhisglngluglyglyproaspglygluproaspvalpropro151015<210>42<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>42glyglyproaspglygluproaspvalproproglyalaileglu151015<210>43<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>43glygluproaspvalproproglyalailegluglnglyproala151015<210>44<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>44valproproglyalailegluglnglyproalaaspaspprogly151015<210>45<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>45alailegluglnglyproalaaspaspproglygluglyproser151015<210>46<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>46glyproalaaspaspproglygluglyproserthrglyproarg151015<210>47<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>47aspproglygluglyproserthrglyproargglyglnglyasp151015<210>48<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>48glyproserthrglyproargglyglnglyaspglyglyargarg151015<210>49<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>49glyproargglyglnglyaspglyglyargarglyslysglygly151015<210>50<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>50glnglyaspglyglyargarglyslysglyglytrppheglylys151015<210>51<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>51glyargarglyslysglyglytrppheglylyshisargglygln151015<210>52<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>52lysglyglytrppheglylyshisargglyglnglyglyserasn151015<210>53<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>53pheglylyshisargglyglnglyglyserasnprolyspheglu151015<210>54<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>54argglyglnglyglyserasnprolysphegluasnilealaglu151015<210>55<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>55glyserasnprolysphegluasnilealagluglyleuargala151015<210>56<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>56lysphegluasnilealagluglyleuargalaleuleualaarg151015<210>57<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病毒科(ebv-蛋白ebna1片段)<400>57ilealagluglyleuargalaleuleualaargserhisvalglu151015<210>58<211>15<212>prt<213>病毒疱疹病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