本发明属医药
技术领域：
，具体涉及一种中药材华泽兰提取物及其中苯并呋喃类化合物的制备以及该提取物及其中的化合物在糖尿病及抗炎药物中的应用。
背景技术：
：华泽兰(eupatoriumchinense)为菊科(compositae)泽兰属(eupatorium)植物，多年生草本或半灌木，常生长于山谷、林缘、草地或灌木丛中，主要分布于中国东南部至西南部各省。其干燥根，又名广东土牛膝、多须公、斑骨相思等。具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛的功效，主治白喉、蛾喉、咽喉肿痛等症，有“喉科圣药”之称，对喉部疾病疗效显著，民间使用极为广泛。在广东，民间用华泽兰治疗扁桃体炎、咽喉炎等，疗效显著[梅全喜，吴惠妃.广东土牛膝的药用历史及现代研究概况.中医药学刊，2005,23(11),1995-1997.]；在江浙一带，民间用华泽兰根切成饮片泡茶，可以有效控制血糖升高。目前，国内外对其化学成分及生物活性有过一些研究，发现其中的化学成分种类较多，有萜类化合物、苯并呋喃类化合物、酚酸类化合物、黄酮类化合物、甾体类化合物等[廖彭莹,张颖君,王一飞,王东,杨崇仁.广东土牛膝的化学成分.植物分类与资源学报,2010,32(2):183-188.]，对其抗菌、抗病毒方面也有一些报道[wangwj,wangl,liuz,etal.antiviralbenzofuransfromeupatoriumchinense.phytochemistry,2015,122(1):238-245.；刘梦元,虞丽娟,李燕慈,田珂,李路军,吴正治.华泽兰根的化学成分及其体外抑菌活性研究.天然产物研究与开发,2015(11):1905-1909.]，但对华泽兰抗炎及抗糖尿病相关的物质基础缺乏研究。技术实现要素：本发明的目的是提供一种华泽兰中苯并呋喃类化合物的制备方法，所述华泽兰中苯并呋喃类化合物包括有效部位及其中单体化合物，通过以下制备方法获得：将华泽兰的根制成饮片或适当粉碎后，以8-16倍量水/醇溶剂系统提取2～3次，提取液经减压浓缩得浸膏，将此浸膏上反相柱层析，或用适量水将此浸膏混悬分散，继以有机溶剂萃取，浓缩得浸膏后再经反相层析，可获得含有苯并呋喃类化合物的有效部位；该部位经进一步正/反相层析后可获得各单体化合物。具体通过以下步骤实现：1.将华泽兰根切成饮片或粉碎成粗粉，以8～16倍量水/醇系统提取2～3次，所述的醇选择甲醇或乙醇，其中甲(乙)醇的浓度为50～100％，优选70％；提取方式采用加热回流或渗漉；所述的水/醇溶剂系统指甲醇或乙醇的水溶液，甲(乙)醇的含量为50～100％，优选70％。2.将提取液合并后减压浓缩，除去甲醇或乙醇得到浸膏，浸膏拌样后上反相柱层析，或用适量水将此浸膏混悬分散，继以有机溶剂萃取，浓缩得浸膏后再经反相层析，以水/醇系统洗脱后可获得含有苯并呋喃类化合物的有效部位；采用的反相层析包括大孔树脂吸附层析、mci层析以及c18、c8、c4反相硅胶层析，其中大孔树脂选择dm301、nka-9型、ab-8、d101、dm130、dm-18、d312、da-201、hpd-100、hpd-300、hpd-400、hpd-500、hpd-600型弱极性或中极性大孔树脂。所述的有机溶剂选自石油醚、己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇的一种或几种。3.获得的有效部位经进一步正/反相层析后可获得苯并呋喃类化合物单体，其中正相层析采用硅胶柱层析，流动相系统采用石油醚(己烷)：乙酸乙酯(丙酮)体系，采用梯度洗脱，梯度范围为100:1→0:1；优选80:1→1:1；更优选30:1→5:1。反相层析选用大孔树脂吸附层析或mci层析，或c18、c8、c4反相硅胶层析，溶剂系统采用水：甲醇(乙醇)体系，以水/甲(乙)醇为流动相梯度洗脱，梯度范围为90:10→0:100；优选70:30→10:90。最终获得20个苯并呋喃类化合物，其中3个化合物(2,5,10)具有促进人肌肉细胞c2c12对葡萄糖的转运作用，3个化合物(3,4,6)在raw264.7细胞模型上具有抑制lps诱导的no生成作用，4个化合物(1,7,8,9)兼具二种活性，化合物2、5、7、8、9、10为新化合物。10个活性单体化合物的结构如下：本发明的另一个目的是提供华泽兰中苯并呋喃类化合物有效部位及各单体化合物在制备治疗糖尿病及各种炎症药物中的应用。具有促进人肌肉细胞c2c12对葡萄糖的转运作用，提示临床上可用于糖尿病的治疗。所述的华泽兰提取物及多个苯并呋喃单体，在raw264.7细胞模型上具有抑制lps诱导的no生成作用，提示临床上可用于炎症的治疗。所述有效部位及单体化合物可以加入药剂学允许的赋形剂制备成药物制剂，制剂形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、气雾剂、以及注射剂。本发明的有益之处是：(1)本发明对原料药材中的有效成分进行了充分的提炼、浓缩，得到的苯并呋喃类化合物有效部位仅占药材重量的1.5％左右，大大优于用原药材煎煮或者用粗提物入药，便于制成各种制剂。(2)用本发明方法获得的有效部位及多个苯并呋喃类化合物，具有显著的药理作用，可促进人肌肉细胞c2c12对葡萄糖的转运作用，并在raw264.7细胞模型上具有抑制lps诱导的no生成作用。(3)本发明阐明了华泽兰具有抗糖尿病/抗炎的物质基础，为进一步开发新药奠定了坚实的理论基础。具体实施方式本发明结合具体实施例作进一步说明。实施例1华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根200g左右粉碎，以50％乙醇1600ml回流提取2小时，过滤后滤渣再加50％乙醇1000ml回流1小时，合并两次滤液，减压回收乙醇，得到浸膏。将此浸膏拌样后，以dm301大孔树脂层析，经水洗、40％甲醇洗脱后，以80％甲醇洗脱，收集此部分洗脱液，浓缩成浸膏，得2.98g有效部位。实施例2华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根200g左右粉碎，加95％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，得浸膏。将此浸膏以水混悬分散，水相以正己烷：乙酸乙酯1:1萃取三遍，萃取液浓缩得到浸膏，拌样后上ab-8大孔树脂，以水洗、30％乙醇洗脱3个柱体积后，再以90％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得3.13g有效部位。实施例3华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根200g左右粉碎，加2000ml甲醇，回流提取2小时，过滤后滤渣再加1000ml甲醇回流1小时，合并两次滤液，减压回收甲醇，得到浸膏。将此浸膏用200ml水混悬后以三氯甲烷萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以nka-9大孔树脂层析，经水洗、50％甲醇洗脱3个柱体积后，再以甲醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收甲醇完全后真空干燥，得3.16g有效部位。实施例4华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根200g左右粉碎，加90％甲醇3200ml回流提取2次，提取液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以石油醚：乙醚1:1萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以d312大孔树脂层析，经水洗、50％乙醇洗脱3个柱体积后，以无水乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后真空干燥，得2.96g有效部位。实施例5华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根饮片200g左右，加75％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，剩余水相以正己烷：三氯甲烷9:1萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以dm301大孔树脂层析，经水洗、40％乙醇洗脱3个柱体积后，以95％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后真空干燥，得2.79g有效部位。实施例6华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根饮片200g左右，加80％甲醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以乙醚：乙酸乙酯7:3萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以hpd-100大孔树脂层析，经水洗、35％乙醇洗脱3个柱体积后，以95％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后真空干燥，得3.22g有效部位。实施例7华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根饮片200g左右，加80％甲醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以正己烷：三氯甲烷6:4萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以da-201大孔树脂层析，经水洗、45％乙醇洗脱3个柱体积后，以无水乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后真空干燥，得2.97g有效部位。实施例8华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰根饮片2kg左右，加95％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，得到浸膏。将此浸膏用2000ml水混悬后以石油醚：二氯甲烷：正丁醇8:1:1萃取三遍，合并萃取液浓缩成浸膏，拌样后以hpd-600大孔树脂层析，经水洗、50％甲醇洗脱3个柱体积后，再以甲醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收甲醇完全后真空干燥，得33.6g有效部位。实施例9华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位的制备取华泽兰20kg左右饮片，加75％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，剩余水相以二氯甲烷：正丁醇4：1萃取三遍，萃取液合并后浓缩成浸膏，拌样后以d101大孔树脂层析，经水洗、30％乙醇洗脱3个柱体积后，以95％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后真空干燥，得289.6g有效部位。实施例10华泽兰苯并呋喃类单体化合物的制备取华泽兰有效部位，经硅胶色谱柱以石油醚：乙酸乙酯，150:1→100:1→80:1→50:1→30:1→0:1升级性洗脱，以硅胶薄层板检测，合并后共得到六个流份。6个流份再分别经硅胶色谱柱以正己烷：丙酮，150:1→100:1→60:1→5:1升极性洗脱，以硅胶薄层板检测，分离得到化合物1～10。实施例11华泽兰苯并呋喃类单体化合物的制备取华泽兰有效部位，经大孔树脂吸附层析，以水：甲醇90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80→10:90升级性洗脱，得到九个流份。9个流份再分别经大孔树脂分离纯化，结合重结晶技术，分离得到化合物1～10。实施例12华泽兰苯并呋喃类单体化合物的制备取华泽兰有效部位，经mci吸附层析，以水：甲醇90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80→10:90升级性洗脱，得到九个流份。9个流份再分别经mci分离纯化，结合重结晶技术，分离得到化合物1～10。实施例13华泽兰苯并呋喃类单体化合物的制备取华泽兰有效部位，经mci吸附层析，以水：甲醇90:10→80:20→70:30→60:40→50:50→40:60→30:70→20:80→10:90升级性洗脱，得到九个流份。9个流份再分别经c8分离纯化，以水：甲醇80:20→60:40→40:60→20:80升级性洗脱，结合重结晶技术，分离得到化合物1～10。实施例14各化合物氢谱、碳谱及质谱数据如下：化合物1:1h-nmr(500mhz,cdcl3)δ:2.73(3h,s),2.60(3h,s),7.08(1h,s),8.17(1h,s),7.47(1h,s)；13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:204.2,188.1,166.1,163.5,160.1,127.1,119.8,118.5,113.3,100.5,27.0,26.6.esi-ms(positive)m/z:219.17[m+h]+,esi-ms(negative)m/z:217.21[m-h]-。化合物2:1h-nmr(500mhz,(cd3)2co)δ:1.53(3h,d,j＝6.6hz),2.70(3h,s),4.93(1h,dq,j＝6.6,5.3hz),6.66(1h,s),8.17(1h,s),8.93(1h,s)；13c-nmr(125mhz,(cd3)2co)δ:205.7,163.9,161.8,160.2,125.3,122.2,117.6,102.1,99.6,63.8,26.4,22.1.esi-ms(positive)m/z:219.17[m+h]+,esi-ms(negative)m/z:217.21[m-h]-。esi-ms(negative)m/z:219.15[m-h]-,hresi-msm/z:219.0661[m-h]-。化合物3:1h-nmr(500mhz,(cd)3co)δ:1.73(3h,s),2.59(3h,s),4.91(1h,m),4.96(1h,d,j＝3.4hz),5.04(1h,m),5.09(1h,d,j＝3.4hz),6.32(1h,s),7.92(1h,s),13.06(1h,s)；13c-nmr(125mhz,(cd)3co)δ:203.0,166.7,166.6,142.0,129.4,121.8,114.6,111.6,97.4,95.6,74.6,25.5,16.7.esi-ms(negative)m/z:233.08[m-h]-。化合物4:1h-nmr(500mhz,dmso-d6)δ:2.69(3h,s),3.66(1h,dd,j＝11.0,5.9hz),3.72(2h,dd,j＝11.0,5.9hz),6.73(1h,s),7.04(1h,s),8.13(1h,s),12.02(1h,s)；13c-nmr(125mhz,dmso-d6)δ:204.6,167.0,157.1,147.3,136.1,115.9,113.0,106.6,103.8,74.9,64.3,64.3,27.3.esi-ms(positive)m/z:289.07[m+na]+。化合物5:1h-nmr(500mhz,cd3od)δ:2.55(3h,s),2.78(3h,s),7.06(1h,s),7.93(1h,s),8.40(1h,s),8.63(1h,s)；13c-nmr(125mhz,cd3od)δ:204.7,173.7,169.2,163.0,161.4,157.1,129.5,124.3,122.7,120.5,118.9,117.3,116.5,99.2,25.7,13.6.hresi-msm/z:283.0610[m-h]-；esi-ms(negative)m/z:283.20[m-h]-。化合物6:1h-nmr(500mhz,cdcl3)δ:1.96(3h,s),2.61(3h,s),5.32(2h,m),6.40(1h,s),7.93(1h,s),9.74(1h,s),12.79(1h,s)；13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:203.9,165.9,165.3,137.8,128.1,121.8,114.6,104.2,93.9,84.2,26.5,23.6,6.4.esi-ms(positive)m/z:217.35[m+h]+,esi-ms(negative)m/z:215.22[m-h]-。化合物7:1h-nmr(500mhz,(cd)3co)δ:2.70(3h,s),7.19(1h,s),2.75(1h,m),2.76(2h,m),2.79(3h,s),2.91(1h,m),4.40(1h,dd,j＝11.0,5.3hz),4.53(1h,dd,j＝11.0,6.0hz),4.72(1h,t,j＝5.7hz),6.83(1h,s),7.04(1h,s),8.00(1h,s),8.30(1h,s),11.89(1h,s),12.15(1h,s)；13c-nmr(125mhz,(cd)3co)δ:205.9,205.6,187.8,165.2,159.4,158.6,152.7,149.4,148.8,133.8,137.1,132.7,120.9,117.3,115.7,113.6,110.9,108.3,105.7,66.6,46.1,36.2,32.5,27.4,27.0.hresi-msm/z:447.1083[m-h]-；esi-ms(negative)m/z:447[m-h]-。化合物8:1h-nmr(500mhz,(cd3)2co)δ:2.27(1h,m),2.39(1h,m),2.52(1h,m),2.57(1h,m),2.70(3h,s),2.74(3h,s),3.97(1h,d,j＝3.9hz),3.98(1h,d,j＝3.9hz),4.43(1h,t,j＝6.6hz),6.50(1h,s),6.87(1h,s),6.89(1h,s),7.02(1h,s),7.52(1h,s),7.94(1h,s),8.09(1h,s),12.12(1h,s),12.24(1h,s)。13c-nmr(125mhz,(cd3)2co)δ:205.6,205.0,159.7,159.4,163.6,162.2,148.9,148.1,145.1,138.2,136.9,117.3,116.5,113.8,112.5,108.3,107.1,105.9,105.8,100.2,80.4,67.5,27.1,26.9,25.7,18.3.hresi-msm/z:461.1248[m-h]-。化合物9:1h-nmr(500mhz,(cd3)2co)δ:1.83(3h,s),1.96(3h,s),2.07(1h,m),2.15(1h,m),2.42(1h,m),2.47(1h,m),2.73(3h,s),2.77(3h,s),4.40(1h,d,j＝10.9hz),4.46(1h,d,j＝10.9hz),4.78(1h,d,j＝11.3hz),4.84(1h,d,j＝11.3hz),6.55(1h,s),7.00(1h,s),7.09(1h,s),8.02(1h,s),8.17(1h,s),12.08(1h,s),12.15(1h,s)。13c-nmr(125mhz,(cd3)2co)δ:205.9,205.9,171.0,170.9,165.6,162.3,159.8,159.3,149.3,149.0,137.3,135.1,118.1,117.6,117.5,114.7,114.0,109.4,108.5,106.3,68.9,68.3,68.0,44.0,32.1,29.2,27.4,27.4,21.1,21.0.esi-ms(negative)m/z:563[m-h]-,hresi-msm/z:563.1554[m-h]-。化合物10:1h-nmr(500mhz,(cd3)2co)δ:2.03(3h,s),1.97(3h,s),2.64(1h,m),2.29(1h,m),2.45(1h,m),2.11(1h,m),2.72(3h,s),2.75(3h,s),4.51(2h,s),4.74(1h,d,j＝11.3hz),4.82(1h,d,j＝11.3hz),6.84(1h,s),6.81(1h,s),7.07(1h,s),8.14(1h,s),8.00(1h,s),12.08(1h,s),12.18(1h,s)。13c-nmr(125mhz,(cd3)2co)δ:205.6,205.6,170.9,170.6,166.0,161.5,159.4,158.8,148.6,148.5,137.1,135.0,117.5,117.2,117.1,114.3,113.6,108.5,108.3,105.2,68.6,67.9,66.8,43.1,31.7,29.2,27.1,27.1,20.8,20.7.esi-ms(negative)m/z:563[m-h]-,hresi-msm/z:563.1555[m-h]-。实施例15片剂制备取上述1～9实施例方法获得的华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50g，粉碎后过80目筛，与淀粉100g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材加入硬脂酸镁1g，干淀粉10g混匀后压制成1000片，即得。每片含华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50mg。实施例16胶囊剂制备取上述1～9实施例方法获得的华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50g，粉碎后过80目筛，加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中。共装1000粒，每粒胶囊含华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50mg。实施例17丸剂制备取上述1～9实施例方法获得的华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50g，粉碎后过80目筛，适量蜂蜜作黏合剂泛制成丸。实施例18颗粒剂制备取上述1～9实施例方法获得的华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位50g，粉碎后过80目筛，加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，分装，密封，包装即得。实施例19喷雾剂制备取上述10～13实施例方法获得的任一华泽兰苯并呋喃类单体化合物1g，加入乙醇30ml及少量非离子表面活性剂、抗氧剂、防腐剂后定量分装成10瓶，制成喷雾剂。实施例20气雾剂制备取上述10～13实施例方法获得的任一华泽兰苯并呋喃类单体化合物1g，加入乙醇50ml溶解，定量分装于10瓶气雾剂耐压容器内，再压入抛射剂四氟乙烷制成气雾剂。实施例21华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位及单体抗糖尿病活性研究采用人肌肉c2c12细胞葡萄糖摄取实验模型，测定了华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位及20个单体化合物对细胞葡萄糖摄取的影响。实验方法：用荧光葡萄糖(2-nbdg)检测细胞的葡萄糖摄取。将细胞接种于96孔板上，每孔约105细胞。待细胞分化完全后，加入待测化合物培养24h，pbs洗涤2次，然后用0.02％bsa的krp(20mmhepes,137mmnacl,4.7mmkcl,1.2mmmgso4,1.2mmkh2po4,2.5mmcacl2,and2mmpyruvate；ph7.4)饥饿处理2h。除空白组外均加入0.1μm胰岛素作用30min，向每组每孔内分别加入100μmol/l2-nbdg，37℃下继续培养30min。用pbs洗涤两次，去除细胞外的2-nbdg。使用微孔酶标仪检测细胞的荧光强度(ex/em＝475nm/550nm)，通过mtt法来矫正每组荧光强度应细胞数量差异而导致的误差。ctrl为空白对照，ins为模型组(加insulin诱导葡萄糖转运)，aicar为阳性对照，所有样品加样浓度为10μm，以阳性对照为标准，增加20％以上的葡萄糖转运被认为有活性。实验结果如下表1所示，可以看出有效部位及化合物1,2,5,7,8,9,10具有较显著的胰岛素增敏作用，可以促进肌肉细胞对葡萄糖的转运。表1comp.10μm2-nbdguptake％ctrl68.90±5.00##ctrl+ins(0.1μm)100±3.441127.29±2.68*2138.16±16.66*3104.81±1.384106.9±3.15141.64±8.66*6109.43±14.987133.33±24.76**8143.28±6.65**9143.31±2.52**10139.49±19.05**11111.41±11.312111.52±8.3513112.77±6.7514112.87±10.7615120.53±4.9116123.42±8.5517116.55±7.1618110.28±6.2219114.39±5.1720102.84±4.89有效部位124.58±6.43*aicar20μm125.64±5.64**实施例22华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位及单体化合物抗炎活性研究通过lps激活raw264.7巨噬细胞来测定华泽兰苯并呋喃类化合物有效部位及单体在抑制no产物的抗炎效果。实验方法：取对数期生长的raw264.7细胞接种于96孔板中，细胞数5×103/孔，培养12h后，设置dmso为空白对照，吲哚美辛组为阴性对照。实验组采用倍增稀释法加入不同浓度样品(20～0.1563μm)，预处理细胞24h，随后加入lps(1μg/ml)孵育24h，收集上清液后，根据no试剂盒的方法，在540nm处测定各组吸光度值，绘制标准曲线，计算各组no含量。结果如下表2，可以看出有效部位及化合物1,3,4,6,7,8,9有较强的抗炎效果，且没有明显的细胞毒性，其活性与阳性药吲哚美辛相当。化合物11,14则既有抗炎活性，又有一定的细胞毒性。表2应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明中获得的华泽兰有效部位，并不仅仅限于以上10个化合物，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12