谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法与流程

本发明涉及酮戊二酸制备技术领域，具体而言，涉及一种谷氨酸氧化酶突变体、核酸分子及应用和制备酮戊二酸的方法。

背景技术：

α-酮戊二酸(α-ketoglutaricacid，α-kg)是一种重要的生物化合物。它是谷氨酸脱氨基的酮酸产物，并且是三羧酸循环的中间产物，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-酮戊二酸在食品、医药、精细化工以及饲料行业有着广泛的用途。特别地，摩尔比为1：1的l-精氨酸α-酮戊二酸盐和摩尔比为2：1的l-精氨酸α-酮戊二酸盐是目前国际市场上销量日益增加的一种氨基酸盐类保健品，作为功能性营养强化剂和护肝药物，主要用作增强体格、促进肌肉的快速增长和恢复、促进肝细胞对营养和能量的吸收、维护肝功能正常等。

现有α-酮戊二酸的生产工艺基本是以化学合成法和生物发酵法为主。化学合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，经缩合、水解合成α-酮戊二酸。例如张国基(中国发明专利申请公开号cn102584568a)以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯为原料，在甲醇钠存在的条件下，合成中间体2,2-二氯戊二酸二甲酯，再与碱溶液反应得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸产品。化学合成法生产α-酮戊二酸，虽然具有收率高、原料易得的特点，但反应过程中大量有机溶剂的使用，以及多步复杂的合成反应过程中会产生大量副产物从而增加分离成本，使得化学合成法总成本偏高、对环境不友好。相对于化学合成法，生物发酵法制备α-酮戊二酸，具有生产条件温和、工艺步骤简单、对环境友好等特点。国内对此研究较多，并申请了一系列的专利。江南大学的陈坚等人(中国发明专利申请公开号cn101245323a)利用重组菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵时长48-72h，α-酮戊二酸产量达到18.6g/l；另一篇专利中(中国发明专利申请公开号cn101717735a)经过工艺和菌种的改进，α-酮戊二酸产量达到31.7g/l；在经过进一步的改进后(中国发明专利申请公开号cn102586128a)，α-酮戊二酸产量达到47.2g/l，发酵时长144h。天津科技大学的陈宁等人(中国发明专利申请公开号cn102391977a)利用谷氨酸棒杆菌发酵生产α-酮戊二酸，发酵32h，α-酮戊二酸产量最高可达47.2g/l。

但是，生物发酵也有其缺点：生产周期长，产量低，产品与发酵液中多种成分混合在一起，导致提取与精制工艺复杂，总成本还是偏高。而生物酶法能很好地弥补发酵法的缺陷，极大地提高产品浓度、简化提取工艺、降低成本。longliu等人(longliu,gshossain,etal.journalofbiotechnology,2013,164:97-104)以l-谷氨酸为底物，利用l-氨基酸脱氨酶脱去氨基生成α-酮戊二酸，但其产量偏低，只有不到12.6g/l，而且反应存在产物抑制作用，目前还难以工业化。

近年来采用全细胞催化剂来生产精细化工产品是非常高效的方法，相比较发酵法，具有生产周期短，效率高，产物相对单一的优点。相比较于酶法来说，工艺简单，无需纯化酶和固定化酶。2014年江南大学的陈坚等人(中国发明专利申请号201410132063.2)，采用全细胞转化生产a-酮戊二酸的方法，但是由于其采用的l-谷氨酸氧化酶的催化性质不够好，且转化率低，在24h内，转化率只有59.6％，产量为7.7g/l。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种谷氨酸氧化酶突变体，该谷氨酸氧化酶突变体可以催化谷氨酸形成酮戊二酸，其相较于野生型的谷氨酸氧化酶具有更高的催化能力。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸分子，其编码上述的谷氨酸氧化酶突变体。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种重组菌。

本发明的另一目的在于提供一种制备谷氨酸氧化酶突变体的方法。

本发明的另一目的在于提供一种制备酮戊二酸的方法。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种谷氨酸氧化酶突变体，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明的发明人发现，上述谷氨酸氧化酶突变体，不仅保留了将谷氨酸催化形成酮戊二酸的活性，且其相较于野生型谷氨酸氧化酶具有更高的催化效率，达到了100％的催化效率。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的谷氨酸氧化酶突变体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子的碱基序列如seqidno.2所示。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述载体为pdk6质粒载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸分子连接在pdk6质粒载体上ecorl和pstl酶切位点之间。

另一方面，本发明提供了一种重组菌，其含有上述的载体。

另一方面，本发明提供了一种制备上述谷氨酸氧化酶突变体的方法，其包括：培养上述重组菌。

从培养产物中分离、纯化得到谷氨酸氧化酶突变体。

得到的谷氨酸氧化酶突变体可以用于催化谷氨酸形成酮戊二酸。当然，在本发明的一些实施例中，也可以直接将培养物用于催化谷氨酸形成酮戊二酸。

另一方面，本发明提供了上述的谷氨酸氧化酶突变体在催化谷氨酸形成酮戊二酸中的应用。

另一方面，本发明提供了一种制备酮戊二酸的方法，其包括：使用上述的谷氨酸氧化酶突变体或上述的重组菌催化谷氨酸形成酮戊二酸。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为含谷氨酸氧化酶突变体编码基因的pdk6质粒图。

图2为实施例中的发酵液经离心后获得去上清和沉淀的凝胶电泳图。

图3为实验例中的酮戊二酸的液相色谱检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建表达谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌

(1)在链霉菌谷氨酸氧化酶野生序列的基础上，进行人工设计，设计后的基因序列如seqidno.2所示，其编码出的谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列如seqidno.1所示。将上述基因序列通过全基因合成的方法合成。

(2)将合成的基因序列通过ecorl和pstl2个酶切位点克隆入pdk6质粒，将如上构建的质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑选阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体，命名为pdk6-12质粒(见图1)。

(3)将重组表达载体pdk6-12质粒转入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，获得可以诱导表达谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌。

实施例2

制备谷氨酸氧化酶突变体

(1)将实施例1制得的用于表达链霉菌谷氨酸氧化酶突变体的基因工程菌在卡那霉素抗性的lb固体培养基上划线，于37℃生化培养箱中培养过夜，挑选较大的菌落接种到含有卡那霉素抗性的lb液体培养基中，于摇床37℃220rpm培养6～8h，或30℃200rpm培养过夜，得到一级种子培养液。

(2)将一级种子培养液按照1％的接种量接种到含有卡那霉素抗性的tb液体培养基中，于摇床37℃220rpm培养4～6h，至目测菌液较浑浊，得到二级种子培养液。

(3)按照1％的接种量，将二级种子接种到发酵罐中进行培养。初始控制：37℃通气保压培养。当溶氧降低，逐步提高通气量、转速、罐压来提高溶氧，罐压不高于0.08mpa。

(4)发酵期间，适当补营养料，以控制溶氧在20-40％，当od600达15-20左右时，分别降温到28℃、30℃和25℃，加入浓度为0.15mm、0.2mm和0.3mm的iptg。

(5)发酵液通过离心或者膜过滤收集菌体，收集到的菌体包含谷氨酸氧化酶突变体，菌体可以直接进行酶催化反应或者放在冰箱冷藏后使用。

(6)取发酵液在4℃下8000rpm离心5分钟，离心后获得的上清和沉淀进行凝胶电泳，结果见图2。

实验例

使用上述菌体催化谷氨酸形成酮戊二酸的实验

酶反应：反应体系为8升

1、称取200克冷冻菌体(大约为转化体系2.5％)，80ml40万单位的过氧化氢酶，自来水定容至5升(ph大约为6.4左右)，35℃保温，400rpm，1vvm，罐压0.05mpa。

2、称取800克一水谷氨酸钠(大约为转化体系10％)，用3升自来水溶解，用蠕动泵流加入转化体系，流加速度为1.2升/小时。期间用1％盐酸控ph在6.5左右。每小时取样检测酮戊二酸，大约3小时左右结束转化。

酮戊二酸检测

1、标准配置：准确称取酮戊二酸标品(98％以上)0.008克，用去离子水定容至10毫升，摇匀，4℃冰箱保存。

2、液相检测：

2.1流动相：称取0.52克浓硫酸，用去离子水溶解至1升，水膜抽滤后超声除气。

2.2检测条件：氨基糖柱，波长215nm，柱温50℃，流速0.6ml/min，进样量20ul，保留时间15min。

结果：

得到酶反应液的体积为8.1l，液相检测酮戊二酸的浓度为77.11g/l，即溶液中共有酮戊二酸624.6g。酮戊二酸检测液相图见图3。

一水谷氨酸钠的分子量为187，酮戊二酸的分子量为146，反应共投入800g的一水谷氨酸钠，理论上100％反应能得到酮戊二酸为624.6g。即酶反应的转化率为100％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>南京红杉生物科技有限公司

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