氢气治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范的制作方法

本发明主要涉及细胞实验中将氢气用于真皮微血管内皮细胞的培养，尤其是减轻真皮微血管内皮细胞的缺血再灌注损伤。

背景技术：

2013年孙学军主编的《氢分子生物学》在第二军医大学出版，其就氢气对人类健康的影响作了详细说明，他指出氢气具有三性，一是有效性：具有抗氧化作用，二是安全性：氢气除有比氮气还低的麻醉作用外，几乎没有任何不良效应，三是经济性：有效剂量并不是特别高，并且氢气穿透性很强，极易穿透细胞膜，到达细胞质、线粒体等细胞器。

缺血再灌注是指对组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应的组织内的细胞造成的，这种损伤，叫做“组织缺血再灌注损伤”。由于缺血再灌注损伤会导致真皮微血管内皮细胞损伤，甚至凋亡，但用药物或者其他方法收效甚微，常常影响细胞正常代谢，因此我们设计一种规范通过激活自噬而抑制凋亡，减轻缺血再灌注损伤，但不影响细胞正常代谢，从而减轻真皮微血管内皮细胞再灌注损伤。

技术实现要素：

本发明人长期研究真皮微血管内皮细胞再灌注损伤的机制，发现缺氧再灌注损伤会通过多种途径导致细胞凋亡，本发明通过多次细胞实验证实，分子氢通过ampk(腺苷一磷酸依赖的蛋白激酶)/mtor(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)信号通路激活自噬而抑制真皮微血管内皮细胞的凋亡，本发明人采用图1的技术路线图实施实验。

本发明所使用的低氧缓冲液由以下物质组成：118mmol/l氯化钠、24mmol/l碳酸氢钠、1.0mmol/l磷酸二氢钠、1.2mmol/l氯化镁、2.5mmol/l二水·氯化钙、16mmol/l氯化钾、20mmol/l乳酸钠、10mmol/l2-脱氧葡萄糖(ph6.2)；低氧舱内气体为三气培养箱(94％n2，5％co2，1％o2)。

本发明所进行的实验中不含氢气处理组方法为：通过让氢气饱和培养基脱气获得，于敞口容器中搅拌4h，之后用氢气测定仪检测其氢气浓度。将细胞加入培养瓶，培养24h。

本发明所采用的技术方案分为三个部分，第一个部分：探索氢气对真皮微血管内皮细胞的影响，用westernblot方法检测蛋白表达情况，图2和表1为其结果，结果可见：与未经过氢气处理组相比，经过氢气处理后，lc3ii/i(自噬相关因子)升高，p-ampk/ampk(磷酸化的腺苷一磷酸依赖的蛋白激酶/腺苷一磷酸依赖的蛋白激酶)升高，p-mtor/mtor(磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)表达减少，可以得出氢气处理后，ampk通路激活，mtor活性被抑制，细胞自噬增加；并用westernblot方法检测自噬相关因子表达，自噬相关因子lc3ii/i的比值与自噬水平相关，其比值越大，自噬水平越高，图3和表2为其结果，结果可见：与未经过氢气处理组相比，经过氢气处理后，lc3ii/i蛋白表达增加，p-mtor蛋白表达减少，m-tor蛋白无明显差异；与氢气处理组相比，经过氢气处理并经过mtor激活剂mhy1485处理后，lc3ii/i表达减少，p-mtor表达增加，mtor表达无明显差异，说明通过mtor激活剂mhy1485可抑制细胞自噬，即氢气处理后，内皮细胞自噬被激活，是通过抑制mtor通路实现对自噬的抑制的。

上述的处理规划的第二个部分：低氧/复氧诱导内皮细胞的凋亡；先通过ldh检测试剂盒检测细胞上清中的ldh(乳酸脱氢酶)活性，确定低氧/复氧能进一步损伤细胞，结果为图4，再用流式细胞术检测各组细胞凋亡确定能够导致细胞明显凋亡的复氧时间：t1，结果为图5和图6，结果可见：通过检测细胞上清中的乳酸脱氢酶活性，发现低氧能造成细胞损伤，增加乳酸脱氢酶活性，低氧/复氧能进一步损伤细胞；通过流式细胞术检测各组细胞凋亡，可以发现导致细胞明显凋亡的复氧时间t1为24h。

上述的处理规划的第三个部分：用westernblot方法检测p-mtor、mtor、lc3、cleavedcaspase3(caspase3是细胞凋亡过程中最主要的剪切酶，其活化形式是cleavedcaspase3)蛋白的表达，结果为图7和表3，结果可见：与h8/r24组相比，经过h2处理后，lc3ii/i蛋白表达增加，p-mtor蛋白表达减少，cleavedcaspase3蛋白表达减少，mtor蛋白表达无明显差异。提示，分子氢处理可能激活内皮细胞自噬，抑制了细胞凋亡，mtor通路被抑制。与h2+h8/r24组相比，经过mtor激活剂mhy1485处理后，lc3ii/i蛋白表达降低，p-mtor蛋白表达增加，cleavedcaspase3蛋白表达增加，mtor蛋白表达无明显差异。结果显示，mtor激活剂处理后，与h2处理组比较，乳酸脱氢酶抑制被解除，细胞凋亡增加，p-mtor表达增加，lc3表达降低，cleavedcaspase3表达量增加。该结果提示，氢气处理能够抑制缺氧/再灌注(h/r)诱导的内皮细胞凋亡依赖于mtor信号通路。

表1各组细胞蛋白相对表达量

表2各组细胞蛋白相对表达量

表3各组细胞蛋白相对表达量

为了减轻在体外培养细胞实验中的缺血再灌注损伤，本发明人采用氢气处理真皮微血管内皮细胞以减轻在培养过程中出现的缺血再灌注损伤，为其提供一种处理规范，提高细胞对缺氧的耐受能力，以便更好的进行细胞实验。

本发明的有益效果是：通过氢气治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规范，便于其他研究人员进行细胞培养的相关操作。

附图说明

图1：氢气治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤处理规划的技术路线图。

图2：各组细胞蛋白表达。

图3：各组细胞蛋白表达。

图4：各组细胞乳酸脱氢酶(ldh)活性检测。

图5和图6：各组细胞凋亡率检测。

图7：各组细胞蛋白表达条带图。

图1、图2及图3中con及control表示不经过h2处理的对照组细胞，h2表示经过h2处理，h2+mhy1485表示经过氢气及mtor激活剂mhy1485处理。

图2、图3及图7中gapdh表示甘油醛-3-磷酸脱氢酶，4ebp1表示4e结合蛋白1，p-4ebp1表示磷酸化的4e结合蛋白1。

图1、图4、图5、图6及图7中control表示对照组细胞，用不含血清的内皮细胞ecm培养基培养18h；h8表示h8组，先用不含血清的内皮细胞ecm培养基培养18h后，加入低氧缓冲液后置于低氧舱内8小时；h8/r12表示h8/r12组：先用不含血清的内皮细胞ecm培养基培养18h后，加入低氧缓冲液后置于低氧舱内8h，然后更换缓冲液，加入等量氧饱和后的含5％fbs的内皮细胞ecm培养基，细胞孵育箱37℃孵育12h，h8/r24表示h8/r24组，先用不含血清的内皮细胞ecm培养基培养18h后，加入低氧缓冲液后置入低氧舱内8h，然后更换缓冲液，加入氧饱和后的含5％fbs的内皮细胞ecm培养基，细胞孵育箱37℃孵育24h。**表示p＜0.01，表示差异有统计学意义。

具体实施方式

下面结合具体实例进一步阐述本发明，应理解，这些实例仅用于阐述本发明，而不应限制本发明的应用。

实施例1

在0.4mpa压力下将氢气溶解于不含血清的ecm培养基2小时，使其过饱和，减压后氢气会释放出来，用同样的办法制造出氧气饱和和二氧化碳饱和ecm培养基，这三种培养基按比例(氢气培养基∶氧气培养基∶二氧化碳培养基＝75％∶20％∶5％)混合，细胞培养时，将混合好的培养基放入培养瓶后立即用氢气测定仪检测氢气的浓度，然后向培养箱通入配比好的混合气体，即氢气占75％，氧气占20％，二氧化碳占5％，以使培养基内各种气体浓度平衡和稳定，然后将细胞加入该培养瓶，封闭培养24小时，在此条件下培养基含氢量约为0.6mpa，通过此种规范，可以将氢气用于治疗真皮微血管内皮细胞再灌注损伤的细胞实验中。