本发明涉及利用拜氏梭菌制备高酯键腐植酸制剂及应用。
背景技术：
拜氏梭菌发酵过程中将碳源转化为丁酸，随着丁酸的积累，会对发酵过程产生抑制作用，导致发酵结束。发酵过程中如果能及时将生成的丁酸移除，则可以保证发酵过程的稳定进行，提高发酵过程效率。
丁酸作为挥发性脂肪酸的一种，在畜禽肠道健康中发挥重要作用，丁酸一方面可以为肠道绒毛供能，促进肠绒毛发育，同时可以抑制肠道有害菌生长，维持肠道微生态平衡。但是值得注意的是，在使用过程中，饲料中添加的少量丁酸会被肠道上部吸收，导致丁酸很难到达肠道后端发挥抑菌及供能作用。因此专利申请号201610999456.2公开了一种微囊包被丁酸钠及其制备方法，利用乙二醇对丁酸等成分进行包被。该方法是通过简单的物理包被的方法，利用包膜材料将丁酸等包裹起来。缺点是包被物在肠道内的释放时间与位置不可控，可能会出现在肠道无法及时打开，导致丁酸等随粪便排出，亦或因为包被不充分，丁酸等仍然无法安全到达肠道后段等问题。
腐植酸是富含酚羟基的网状高分子物质，不溶于水和酸，但能溶于碱。腐植酸在肠道内发挥收敛作用，促进肠道损伤修复。利用脂肪酶将丁酸与腐植酸中酚羟基进行催化生成酯键，一方面减少拜氏梭菌发酵过程中发酵液中丁酸的抑制作用，同时丁酸与腐植酸钠发生酯化反应之后在肠道内只有在胰脂肪酶的作用下才能缓慢打开酯键，使丁酸得以释放；由于酯键打开的过程是生命体的正常生理代谢过程，而且很缓慢，因此高酯键腐植酸随食糜不断移动并被不断打开释放腐植酸与丁酸，保证了整个肠道内都有丁酸存在，实现丁酸的全肠道抑菌与供能作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足（如拜氏梭菌发酵过程会受产物丁酸抑制；丁酸进入肠道后会被肠道上段吸收，导致无法到达肠道后段发挥作用；传统包被工艺无法保证产物在肠道释放的时间与位置可控）而提供一种通过在拜氏梭菌发酵过程中加入腐植酸钠，在脂肪酶作用下，将丁酸与腐植酸发生酯化反应，移除发酵液中丁酸，同时生成的高酯键腐植酸保证了丁酸在肠道内的缓慢释放，实现丁酸的全肠道抑菌与供能作用。
本发明的另一个目的是提供一种在畜禽饲养领域具有重要应用的高酯键腐植酸制剂。
一种高酯键腐植酸制剂，在拜氏梭菌发酵液中按照一定比例加入腐植酸钠，发酵过程中生成的丁酸与腐植酸钠中酚羟基经脂肪酶催化形成酯键，减少发酵液中游离丁酸浓度，最终腐植酸与丁酸通过酯化反应生成成分为腐植酸丁酸酯的高酯键腐植酸制剂。具体是通过脂肪酶将拜氏梭菌发酵形成的丁酸与腐植酸钠中的酚羟基发生酯化反应，降低发酵液中丁酸浓度，减少丁酸积累对拜氏梭菌发酵过程的抑制作用；腐植酸与丁酸形成的高酯键腐植酸进一步被用作饲料添加剂，促进畜禽肠道健康。
发明的目的是这样实现的：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
（1）制作含拜氏梭菌的种子液，其中菌液浓度均为0.5×108-1.0×108cfu/ml；
种子培养基（tya培养基）：牛肉膏2g，酵母粉2g，蛋白胨6g，ch3coonh43g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.2g，feso4·7h2o0.01g，蒸馏水1000ml，ph6.5，121℃高压灭菌15min，用无菌氮气吹5min，驱尽氧气。
（2）发酵培养基：k2hpo40.5g、kh2po40.5g、ch3coonh42.2g、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·h2o0.01g、nacl0.01g、feso4·7h2o0.01g、thiamine(硫胺，维生素b1)0.001g、biotin(生物素)0.00001g、p-aminobenzoicacid(p-氨基苯甲酸)0.001g，加水至1000ml。
（3）将腐植酸钠按照4-10g/l、加入到发酵罐中。
（4）发酵罐中发酵培养基灭菌结束，降至室温后，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:1-5的比例加入发酵罐。
（5）将步骤（1）中获得的含拜氏梭菌的种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到产丁酸发酵培养基中，37-42℃，50-120转/分钟搅拌培养。
（6）将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l，发酵96小时。
（7）发酵结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。
本方案的具体特点还有，脂肪酶为诺维信公司生产的novozym435，酶活为10000plu/g。
拜氏梭菌（clostridiumbeijerinckii）菌种为拜氏梭菌se-2，菌种保藏号为cctccm2014384，保藏日期2014年8月19日。拜氏梭菌se-2，拉丁文学名clostridiumbeijerinckiise-2；该菌株已于2014年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072，保藏号cctccno.m2014384。
一种如上所述的高酯键腐植酸钠制剂的应用，将高酯键腐植酸钠制剂以0.2%重量百分比的比例与饲料混合，直接饲喂畜禽。
本发明产生如下积极效果：1、利用脂肪酶将丁酸与腐植酸中酚羟基进行催化生成酯键，减少拜氏梭菌发酵过程中丁酸的抑制作用，保证发酵过程的顺利进行，提高发酵效率。
2、丁酸与腐植酸钠发生酯化反应之后在肠道内只有在胰脂肪酶的作用下才能缓慢打开酯键，使丁酸得以释放；由于酯键打开的过程是很缓慢的，因此高酯键腐植酸随食糜不断移动并被不断打开释放腐植酸与丁酸，保证了整个肠道内都有丁酸存在，实现丁酸的全肠道抑菌与供能作用。
3、腐植酸收敛肠道损伤，而丁酸不仅可以给肠道绒毛供能，促进肠绒毛发育，而且可以改善肠道微生态平衡，腐植酸与丁酸的协同作用，为肠道健康提供保障。
4、发酵结束后，利用腐植酸不溶于酸与水的特性，通过调整ph，促进高酯键腐植酸在发酵液中形成沉淀，便于后续分离，节约分离成本。
本发明通过将拜氏梭菌发酵产物丁酸与腐植酸酶促形成稳定化合物，一方面促进发酵过程的顺利进行，同时高酯键腐植酸又能够帮助丁酸缓慢在肠道内释放，实现全肠道抑菌与供能，增强了其在畜禽养殖上的效果，使产品具有更强竞争力。
具体实施方式
实施例1：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步，制作含拜氏梭菌的种子液，其中菌液浓度均为0.5×108-1.0×108cfu/ml；拜氏梭菌为保藏号cctccno.m2014384拜氏梭菌se-2。
种子培养基（tya培养基）：葡萄糖40g，牛肉膏2g，酵母粉2g，蛋白胨6g，ch3coonh43g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.2g，feso4·7h2o0.01g，蒸馏水1000ml，ph6.5，121℃高压灭菌15min，用无菌氮气吹5min，驱尽氧气。
第二步，制作产丁酸发酵培养基，具体为：基础发酵培养基：k2hpo40.5g、kh2po40.5g、ch3coonh42.2g、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·h2o0.01g、nacl0.01g、feso4·7h2o0.01g、thiamine(硫胺，维生素b1)0.001g、biotin(生物素)0.00001g、p-aminobenzoicacid(p-氨基苯甲酸)0.001g，加水至1000ml。
第三步，将腐植酸钠按照4g/l、加入到发酵罐中。
第四步，发酵罐中发酵培养基灭菌结束，降至室温后，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:5的比例加入发酵罐。
第五步，将第一步中的拜氏梭菌种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵培养基中，37℃，50转/分钟搅拌培养。
第六步，将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l。
第七步，第96小时发酵结束，取发酵液分析丁酸浓度，丁酸浓度为1.7g/l；发酵过程中共消耗木糖118.7g/l。
第八步，发酵结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。
实施例2：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步，第二步，同实施例1。
第三步，将腐植酸钠按照7g/l、加入到发酵培养基中。
第四步，发酵罐中发酵培养基灭菌结束，降至室温后，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:3的比例加入发酵罐。
第五步，将第一步中的拜氏梭菌种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵培养基中，40℃，80转/分钟搅拌培养。
第六步，将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l。
第七步，第96小时发酵结束，取发酵液分析丁酸浓度，丁酸浓度为0.46g/l；发酵过程中共消耗木糖143.3g/l。
第八步，发酵结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。
实施例3：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步，第二步，同实施例1。
第三步，将腐植酸钠按照10g/l、加入到发酵培养基中。
第四步，发酵罐中发酵培养基灭菌结束，降至室温后，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:1的比例加入发酵罐。
第五步，将第一步中的拜氏梭菌种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵培养基中，42℃，100转/分钟搅拌培养。
第六步，将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l。
第七步，第96小时发酵结束，取发酵液分析丁酸浓度，丁酸浓度为0.90g/l；发酵过程中共消耗木糖129.8g/l。
第八步，发酵结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。
实施例4：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步，第二步，同实施例1。
第三步，将腐植酸钠按照7g/l、加入到发酵培养基中。
第四步，将第一步中的拜氏梭菌种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵培养基中，40℃，80转/分钟搅拌培养。
第五步，将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l。
第六步，第96小时发酵结束，取发酵液分析丁酸浓度，丁酸浓度为21.02g/l；发酵过程中共消耗木糖33.2g/l。
第七步，发酵结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸制剂。
实施例4与实施例2相比只是未添加脂肪酶，由于缺少脂肪酶将催化丁酸与腐植酸的酯化反应，因此发酵液中丁酸积累，同时木糖利用量非常低，只有实施例2的23.2%，说明丁酸的存在导致发酵过程意外终止。同时，二者通过木糖消耗量推算，整个过程中生成的丁酸量易差别很大。
实施例5：一种高酯键腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步，第二步，同实施例1。
第三步，将腐植酸钠按照7g/l、加入到发酵培养基中。
第四步，将第一步中的拜氏梭菌种子液与发酵培养基按照2%的体积比利用蠕动泵加入到发酵培养基中，40℃，80转/分钟搅拌培养。
第五步，将200g/l木糖利用蠕动泵加入到发酵罐中，维持发酵液中木糖浓度为20g/l。
第六步，第96小时发酵结束，取发酵液分析丁酸浓度，丁酸浓度为21.02g/l；发酵过程中共消耗木糖33.2g/l。
第七步，将脂肪酶按照脂肪酶与腐植酸钠质量比为1:3的比例加入发酵罐，40℃，80转/分钟搅拌反应12小时，发酵液中丁酸浓度为0.19g/l。
第八步，反应结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的高酯键腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得高酯键腐植酸产品。
实施例5与实施例4相比在发酵结束后再加入脂肪酶，促使腐植酸钠与生成的丁酸发生酯化反应，形成高酯键腐植酸。
实施例6：一种腐植酸制剂的制备方法，它包括如下步骤：
第一步至第六步与实施例5相同；
第七步，反应结束后通过将发酵液ph调整为2.5，促使酶促反应生成的腐植酸沉降，经板框压滤机压滤、烘干获得腐植酸制剂。
第八步，向第七步获得的腐植酸中按照发酵体积加入21.02g/l丁酸，获得最终产品。
实施例6与实施例5的区别在于，实施例5中的丁酸与腐植酸以酯键连接，而实施例6中丁酸是以丁酸分子单独存在。
实施例7：一种如上所述的高酯键腐植酸钠制剂的应用，将实施例2得到的高酯键腐植酸制剂与饲料按0.2%重量百分比混合，直接喂食。
试验结果：
实验对象为某商品猪的出生仔猪。
实验组：初生仔猪饲喂添加高酯键腐植酸制剂的饲料，不进行抗生素注射剂用药等方法的防控，其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。
对照组：仔猪发生腹泻后注射抗生素及其它药物，并结合猪场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。试验结果如表1：
表1
结果表明：实验组与对照组相比，该高酯键腐植酸制剂可以有效预防仔猪的腹泻，并且降低用药成本。
实施例8：一种如上所述的高酯键腐植酸钠制剂的应用，将实施例4得到的腐植酸制剂与饲料按0.2%重量百分比混合，直接喂食。
试验结果：
实验对象为某商品猪的出生仔猪。
实验组：初生仔猪饲喂添加高酯键腐植酸制剂的饲料，不进行抗生素注射剂用药等方法的防控，其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。
对照组：仔猪发生腹泻后注射抗生素及其它药物，并结合猪场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。试验结果如表2：
表2
结果表明：实验组与对照组相比，可以预防仔猪的腹泻，但是与实施例7相比，实施例8中所用产品（实施例4）由于未添加脂肪酶，因此腐植酸钠只是最终在肠道内发挥一定作用，无法对发酵过程产生作用；而丁酸因为溶于发酵液中，因此最终的腐植酸制剂中并不含有丁酸，最终实施例8（实施例4）虽然与实施例7（实施例2）只有脂肪酶一项不同，但是制品对仔猪腹泻的预防作用却相差甚大。
实施例9：一种如上所述的高酯键腐植酸钠制剂的应用，将实施例5得到的腐植酸制剂与饲料按0.2%重量百分比混合，直接喂食。
试验结果：
实验对象为某商品猪的出生仔猪。
实验组：初生仔猪饲喂添加高酯键腐植酸制剂的饲料，不进行抗生素注射剂用药等方法的防控，其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。
对照组：仔猪发生腹泻后注射抗生素及其它药物，并结合猪场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。试验结果如表3：
表3
实施例10：一种如上所述的腐植酸钠制剂的应用，将实施例6得到的腐植酸制剂与饲料按0.2%重量百分比混合，直接喂食。
试验结果：
实验对象为某商品猪的出生仔猪。
实验组：初生仔猪饲喂添加高酯键腐植酸制剂的饲料，不进行抗生素注射剂用药等方法的防控，其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。
对照组：仔猪发生腹泻后注射抗生素及其它药物，并结合猪场的治疗管理给予一定的其他药物的治疗，日粮、营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。
试验结果如表4：
表4
结果表明：实验组与对照组相比，可以预防仔猪的腹泻，虽然实施例5和实施例6产品中腐植酸与丁酸的含量相同，但实施例5中丁酸与腐植酸以酯键相连，实施例6中的丁酸以丁酸分子形式存在，因此在实施例10中丁酸因为无法像实施例9中丁酸那样缓慢释放，达到全肠道抑菌与促进肠绒毛发育的作用，最终导致实施例10中仔猪腹泻率要高于实施例9。该结果进一步说明，通过添加腐植酸钠，利用脂肪酶将丁酸与腐植酸酶促连接，对于提高产品在肠道中的作用是必要的。