本公开涉及肠道病毒的检测，具体地，涉及一种用于检测肠道病毒的核酸试剂、试剂盒及系统。
背景技术：
：肠道病毒属于小rna病毒科肠道病毒属。能引起人类致病的肠道病毒有多种，包括人肠道病毒a、b、c、d组，有100多个血清型。人类常见的肠道病毒主要包括：柯萨奇病毒a组(coxsackievirusa，ca，常见型别包括2、4、5、6、7、9、10、12、16型)、柯萨奇病毒b组(coxsackievirusb，cb，常见型别包括1、2、3、4、5型)、人肠道致细胞病变孤儿病毒(简称埃可病毒)(echovirusecho)、新肠道病毒等。新肠道病毒为1969年后陆续分离到的，例如新型肠道病毒71型(ev71)等。目前国内对ca16及ev71亚型的分型研究也日趋增多，了解基因分型对手足口疾病的流行和预防有重要意义。ca16主要流行b1b亚型，也有部分区域为b1a亚型；ev71主要为c4a亚型，少数为c4b亚型。肠道病毒的传染源为患者和无症状的病毒携带者。传播途径主要是粪-口途径，也可通过呼吸道传播，夏秋季是一年之中的主要流行期。肠道病毒以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次病毒血症。扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次病毒血症和临床症状。各年龄段人群均可感染肠道病毒。肠道病毒在肠道中增殖，但通常不引起肠道疾病。90％以上肠道病毒感染为隐性感染，或仅出现轻微的上呼吸道感染或流感样症状。不同肠道病毒可以引起相同的临床症状，同一种病毒可引起几种不同的临床疾病。肠道病毒所致的主要疾病有手足口病、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎、疱疹性咽峡炎、流行性胸痛、心肌炎和心包炎和眼病等等。此外，肠道病毒感染可能还与病毒感染后疲劳综合征、糖尿病相关。因此，建立一种快速、准确、一体化的肠道病毒的筛检方案对于快速诊断及指导临床用药和治疗具有非常重要的意义。当前肠道病毒检测方法主要包括三类：病毒分离培养、免疫学方法、分子生物学方法。病毒分离培养是病毒性疾病诊断的金标准，但其操作繁琐，检测时间长，且阳性率较低。免疫学方法为传统分型的主要方法，但抗血清的来源很有限，无法满足临床病原诊断的要求。而基于pcr等相关技术的分子生物学方法以其灵敏、快捷等优势得到极大发展。常用的pcr检测需要前期复杂的样本处理过程、繁琐的试验程序及复杂的结果判断。此外，rt-pcr所能覆盖的检测目标有限，需要通过多体系的设置才能实现多目标的检测，增加了操作的复杂性。技术实现要素：本公开的目的是提供一种快速、准确、一体化的检测多种肠道病毒的核酸试剂、试剂盒及系统。为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种用于检测肠道病毒的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-36所示的引物和seqidno.39-58所示的探针。可选地，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-36所示的引物的含量各自为0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.15～0.35μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.4～0.6μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.3～0.5μm、0.5～1.5μm、0.2～0.4μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.15～0.35μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.4～0.6μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.2～0.4μm、0.5～1.5μm和0.2～0.4μm，分别由seqidno.39-58所示的探针的含量各自为0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.1～0.3μm、0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.1～0.3μm和0.1～0.3μm。可选地，所述核酸试剂还包括阳性内质控；所述的阳性内质控含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针，该引物和探针特异性的扩增人内源性核糖核酸酶基因。可选地，所述核酸试剂包括a管、b管、c管和d管；a管含有seqidno.1-18,37-38所示的引物和seqidno.39-47,59所示的探针；b管含有seqidno.19-32,37-38所示的引物和seqidno.48-54,59所示的探针；c管含有seqidno.33-38所示的引物和seqidno.55-59所示的探针；d管含有seqidno.7-8,13-14,17-18,29-30,37-38所示的引物和seqidno.42,45,47,53,59所示的探针。可选地，seqidno.39-41、seqidno.48-50和seqidno.55-57所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.42-44、seqidno.51-52和seqidno.58所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.45-47和seqidno.53-54所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.59所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、joe荧光标记、hex荧光标记、vic荧光标记、tamra荧光标记、rox荧光标记、cy5荧光标记和quasar670荧光标记中的一种。本公开第二方面：提供一种用于检测肠道病毒的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有逆转录酶、反应体系缓冲液、dna聚合酶、镁离子、rna酶抑制剂、dntp和水中的至少一种。本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测肠道病毒的试剂盒中的用途。可选地，所述肠道病毒包括肠道病毒ca2、肠道病毒ca4、肠道病毒ca5、肠道病毒ca6、肠道病毒ca7、肠道病毒ca9、肠道病毒ca10、肠道病毒ca12、肠道病毒ca16、肠道病毒cb1、肠道病毒cb2、肠道病毒cb3、肠道病毒cb4、肠道病毒cb5、肠道病毒ev71、肠道病毒echo、肠道病毒ca16-a亚型、肠道病毒ca16-b1a亚型、肠道病毒ca16-b1b亚型、肠道病毒ev71-b亚型、肠道病毒ev71-c4a亚型和肠道病毒ev71-c4b亚型。本公开第四方面：提供一种用于检测肠道病毒的系统，该系统包括进样器，具有a管检测器、b管检测器、c管检测器、和d管检测器的pcr仪，计算装置以及输出装置，所述进样器为容纳临床具有手足口症状的样本或核酸的容器，所述检测器为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、joe荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道、tamra荧光通道、rox荧光通道、cy5荧光通道和quasar670荧光通道中的一种，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若a管第一荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca2阳性；a管第一荧光通道有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca4阳性；a管第一荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca5阳性；a管第二荧光通道和d管第二荧光通道分别有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为ca6阳性；a管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为ca7阳性；a管第二荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为ca9阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca10阳性；a管第三荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca12阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca16阳性；b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb1阳性；b管第一荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为cb2阳性；b管第一荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为cb3阳性；b管第二荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb4阳性；b管第二荧光通道有tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为cb5阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71阳性；b管第三荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为echo阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-a亚型阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1a亚型阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1b亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-b亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4a亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4b亚型阳性；a管第四荧光通道、b管第四荧光通道、c管第四荧光通道和d管第四荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。本公开的有益效果在于：本公开通过paradna及hybeacon探针技术检测多种肠道病毒，能够实现形态学、免疫学及rt-pcr检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：(一)较高的多重检测能力近几年关于肠道病毒的检测报道中大多采用rt-pcr的方法进行检测，该方法虽然可以实现多目标的检测，但是受荧光通道数目的限制，需要多个扩增体系联检才能实现，增加了操作的复杂性。本公开可以只需4个体系一次性的检测肠道病毒ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a和ev71-c4b二十二种目标，检测流程简单，结果自动判读且可靠，节省了时间、人力和物力成本。(二)简易的操作环节便悬液样本可通过采样器直接放置于paradna的反应器中直接检测即可获得可靠的结果，避免了昂贵费时的样本提取步骤，实现了除专业实验室外的应急检测。(三)较高程度的检测一体化针对肠道病毒多种病原体检测的需求，提供了一套全面、快速、准确及操作简便的检测肠道病毒的一体化解决方案，包括了核酸的快速提取、荧光pcr扩增及自动化结果的判定。(四)特异性好本公开的核酸试剂中，所有引物探针都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性，经过特异性实验验证能够很好的区分包括诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、星状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、戊肝病毒、b族链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺菌、弧菌等肠道感染的其他病原体。(五)最低检出限最低检出限可达到10拷贝/反应。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。本公开第一方面：提供一种用于检测肠道病毒的核酸试剂，其中，所述核酸试剂包括分别彼此独立存放或互相任意混合存放的seqidno.1-36所示的引物和seqidno.39-58所示的探针。本公开采用hybeacon探针技术结合paradna分析，能够快速、准确、一体化地检测多种肠道病毒。其中，所述肠道病毒可以包括肠道病毒ca2、肠道病毒ca4、肠道病毒ca5、肠道病毒ca6、肠道病毒ca7、肠道病毒ca9、肠道病毒ca10、肠道病毒ca12、肠道病毒ca16、肠道病毒cb1、肠道病毒cb2、肠道病毒cb3、肠道病毒cb4、肠道病毒cb5、肠道病毒ev71、肠道病毒echo、肠道病毒ca16-a亚型、肠道病毒ca16-b1a亚型、肠道病毒ca16-b1b亚型、肠道病毒ev71-b亚型、肠道病毒ev71-c4a亚型和肠道病毒ev71-c4b亚型。hybeacon探针技术对探针的要求较高，探针的tm值尤为重要；此外，探针与引物的组合效果对扩增效果也有重要的影响。上述引物和探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因的引物和探针在一个反应体系内共扩增的问题，即评估tm值、目标对应探针的tm值的差值、gc含量、避免出现发夹结构及二聚体等情况，而且要保证备选引物和探针区段分别能够全面覆盖上述多种肠道病毒，特异性良好并且覆盖度高。其中肠道病毒ev71亚型的分型(ev71-b、ev71-c4a和ev71-c4b)因突变位点产生的tm值不同，可通过hybeacon探针实现一条探针检测3种分型。进一步地，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.2-36所示的引物的含量可以各自可以为0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.15～0.35μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.4～0.6μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.3～0.5μm、0.5～1.5μm、0.2～0.4μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.15～0.35μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.4～0.6μm、0.5～1.5μm、0.1～0.3μm、0.5～1.5μm、0.2～0.4μm、0.5～1.5μm和0.2～0.4μm，分别由seqidno.39-58所示的探针的含量各自为0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.1～0.3μm、0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.1～0.3μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.05～0.15μm、0.2～0.4μm、0.05～0.15μm、0.1～0.3μm和0.1～0.3μm。根据本公开，为做好质量控制，所述核酸试剂还可以包括阳性内质控。进一步地，所述的阳性内质控可以含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针，该引物和探针可以特异性的扩增人内源性核糖核酸酶基因。这时，相对于1μm的seqidno.1所示的引物，分别由seqidno.37-38所示的引物的含量各自可以为0.5～1.5μm和0.2～0.4μm，由seqidno.59所示的探针的含量可以为0.1～0.3μm。所述阳性内质控(internalamplificationcontrol，iac)可以有效提示因为操作失误、pcr抑制物等原因造成的假阴性检测结果。根据本公开，为了增强检测结果的准确性，所述核酸试剂可以分为四管，即所述核酸试剂可以包括a管、b管、c管和d管；a管含有seqidno.1-18所示的引物和seqidno.39-47所示的探针，并可进一步含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针；b管含有seqidno.19-32所示的引物和seqidno.48-54所示的探针，并可进一步含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针；c管含有seqidno.33-36所示的引物和seqidno.55-58所示的探针，并可进一步含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针；d管含有seqidno.7-8,13-14,17-18,29-30所示的引物和seqidno.42,45,47,53所示的探针，并可进一步含有seqidno.37-38所示的引物和seqidno.59所示的探针。为了增强溶解峰效果，上述目标探针均可为双标记探针。这样，利用4组体系即可敏感特异地实现肠道病毒ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a、ev71-c4的系统筛检。进一步地，可以根据探针各自的tm值进行荧光标记的排列组合，使得同一体系中的不同探针的扩增被分别识别。例如，作为一种实施方式，seqidno.39-41、seqidno.48-50和seqidno.55-57所示的探针具有第一荧光标记；seqidno.42-44、seqidno.51-52和seqidno.58所示的探针具有第二荧光标记；seqidno.45-47和seqidno.53-54所示的探针具有第三荧光标记；seqidno.59所示的探针具有第四荧光标记；所述第一荧光标记、所述第二荧光标记、所述第三荧光标记和所述第四荧光标记各不相同，且各自独立地选自fam荧光标记、joe荧光标记、hex荧光标记、vic荧光标记、tamra荧光标记、rox荧光标记、cy5荧光标记和quasar670荧光标记中的一种。作为一种特别优选的实施方式，seqidno.39-41、seqidno.48-50和seqidno.55-57所示的探针具有fam荧光标记；seqidno.42-44、seqidno.51-52、seqidno.58所示的探针具有joe荧光标记；seqidno.45-47、seqidno.53-54所示的探针具有tamra荧光标记；seqidno.59所示的探针具有cy5荧光标记。探针中fam为6-羧基荧光素，joe为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素，tamra为6-羧基四甲基罗丹明，cy5为5h-吲哚菁，hex为六氯-6-甲基荧光素，rox为6-羧基-x-罗丹明，vic为购自abi公司的染料。本公开第二方面：提供一种用于检测肠道病毒的试剂盒，该试剂盒含有本公开第一方面所述的核酸试剂，并且可选地，所述试剂盒还含有逆转录酶、反应体系缓冲液、dna聚合酶、镁离子、rna酶抑制剂、dntp和水中的至少一种。进一步地，所述试剂盒可以用于检测污水、废物或土壤中肠道病毒或者来源于人体样本如水疱液、唾液或粪便中的肠道病毒。其中，所述肠道病毒可以包括肠道病毒ca2、肠道病毒ca4、肠道病毒ca5、肠道病毒ca6、肠道病毒ca7、肠道病毒ca9、肠道病毒ca10、肠道病毒ca12、肠道病毒ca16、肠道病毒cb1、肠道病毒cb2、肠道病毒cb3、肠道病毒cb4、肠道病毒cb5、肠道病毒ev71、肠道病毒echo、肠道病毒ca16-a亚型、肠道病毒ca16-b1a亚型、肠道病毒ca16-b1b亚型、肠道病毒ev71-b亚型、肠道病毒ev71-c4a亚型和肠道病毒ev71-c4b亚型。本公开的试剂盒能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对22种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。本公开第三方面：提供本公开第一方面所述的核酸试剂在制备用于检测肠道病毒的试剂盒中的用途。其中，所述肠道病毒可以包括肠道病毒ca2、肠道病毒ca4、肠道病毒ca5、肠道病毒ca6、肠道病毒ca7、肠道病毒ca9、肠道病毒ca10、肠道病毒ca12、肠道病毒ca16、肠道病毒cb1、肠道病毒cb2、肠道病毒cb3、肠道病毒cb4、肠道病毒cb5、肠道病毒ev71、肠道病毒echo、肠道病毒ca16-a亚型、肠道病毒ca16-b1a亚型、肠道病毒ca16-b1b亚型、肠道病毒ev71-b亚型、肠道病毒ev71-c4a亚型和肠道病毒ev71-c4b亚型。本公开第四方面：提供一种用于检测肠道病毒的系统，该系统包括进样器，具有a管检测器、b管检测器、c管检测器、和d管检测器的pcr仪，计算装置以及输出装置，所述进样器为容纳临床具有手足口症状的样本或核酸的容器，所述检测器为装载有如上所述的核酸试剂的核酸试剂储藏容器，所述pcr仪包括第一荧光通道、第二荧光通道、第三荧光通道和第四荧光通道；所述第一荧光通道、所述第二荧光通道、所述第三荧光通道和所述第四荧光通道各不相同，且各自独立地选自fam荧光通道、joe荧光通道、hex荧光通道、vic荧光通道、tamra荧光通道、rox荧光通道、cy5荧光通道和quasar670荧光通道中的一种，所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下的判别：空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若a管第一荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca2阳性；a管第一荧光通道有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca4阳性；a管第一荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca5阳性；a管第二荧光通道和d管第二荧光通道分别有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为ca6阳性；a管第二荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为ca7阳性；a管第二荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为ca9阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca10阳性；a管第三荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca12阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca16阳性；b管第一荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb1阳性；b管第一荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为cb2阳性；b管第一荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为cb3阳性；b管第二荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb4阳性；b管第二荧光通道有tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为cb5阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71阳性；b管第三荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为echo阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-a亚型阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1a亚型阳性；a管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管第一荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1b亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-b亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4a亚型阳性；b管第三荧光通道和d管第三荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管第二荧光通道有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4b亚型阳性；a管第四荧光通道、b管第四荧光通道、c管第四荧光通道和d管第四荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。本公开建立了检测22种易致病的肠道病毒的核酸试剂、试剂盒及系统，能够实现快速、全面、敏感、特异、自动的检测结果判定，显著提高了对22种肠道病毒同时进行检测的敏感性、特异性和简便性。以下通过实施例进行进一步详细说明本公开，但是本公开并不因此受到任何限制。以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在biosearch(usa)公司合成。实施例1、引物、探针合成按照表1和表2所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中y代表简并碱基t/c；r代表简并碱基a/g；w代表简并碱基a/t；探针中fam为6-羧基荧光素、joe为2,7-二甲基-4,5二氯-6-羧基荧光素、tamra为6-羧基四甲基罗丹明、cy5为5h-吲哚菁。表2的探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。表1表22、模板提取使用与paradna配套的采样器采集鼻咽拭子等临床样本后，直接置于paradna的反应器中即可扩增。3、构建hybeacon探针技术检测体系聚合酶phirehotstartiidnapolymerase(货号f122l)，mg2+、dntps购自thermofisher公司，逆转录酶goscripttm(货号a5001)购自promega；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；荧光检测仪为paradna。反应体系的配制如下：按照如下操作配制反应体系：总体系15μl。5×goscriptbuffer5μl，氯化镁溶液1-3mm，dntps为1.5～2.5mm，上游引物0.8～1.0μm，下游引物0.2～0.5μm，hybeacon探针100～300nm，逆转录酶1～2μl，聚合酶1～2μl，具体引物和探针含量见表3，剩余用水补足。表3seqidno终浓度(μm)seqidno终浓度(μm)seqidno终浓度(μm)11211410.320.2220.2420.131231430.140.25240.2440.351251450.160.2260.25460.271271470.280.5280.2480.191291490.3100.2300.5500.2111311510.1120.4320.2520.3131331530.1140.3340.3540.1151351550.3160.2360.3560.1171371570.2180.2380.3580.2191390.2590.2200.2400.1试剂盒分为a管、b管、c管和d管4个反应管，a管含有上表1中seqidno.1-18,37-38所示的引物和上表2中seqidno.39-47,59所示的探针；b管含有上表1中seqidno.19-32,37-38所示的引物和上表2中seqidno.48-54,59所示的探针；c管含有上表1中seqidno.33-38所示的引物和上表2中seqidno.55-59所示的探针；d管含有上表1中seqidno.7-8,13-14,17-18,29-30,37-38所示的引物和上表2中seqidno.42,45,47,53,59所示的探针。反应条件：选择fam、joe、tamra和cy5作为报告基团，反应程序如下：45℃-55℃，7-10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，30-40个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。4、特异性验证选择诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、星状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、戊肝病毒、b族链球菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺菌、弧菌肠道感染的其他病原的临床样本(上述样本均来源于国家cdc)作为特异性评估样本，人工提取核酸。取上述病原的临床粪便样本，处理方法如下：取约0.2g粪便样本加到ep管中，加入1.5ml的生理盐水，震荡混匀3次，每次10s，然后室温静置10min，以8000r/min离心5min，吸取200μl上清加入到ep管中，制作成便悬液。采用paradna配套的采样器采集便悬液等临床样本，直接放置于体系内。按照如下操作配制反应体系按照如下操作配制反应体系：总体系15μl。5×goscriptbuffer5μl，氯化镁溶液1-3mm，dntps为1.5-2.5mm，上游引物0.8-1.0μm，下游引物0.2-0.5μm，hybeacon探针100-300nm，逆转录酶1-2μl，聚合酶1-2μl，剩余用水补足；反应条件：选择fam、joe、tamra、cy5作为报告基团，反应程序如下：50℃，10min，98℃，60s，(98℃，10s，65℃，10s，35个循环)；溶解曲线分析：98℃，60s，35℃，60s，降率为1.0℃/s；80℃，5s，升率为0.5℃/s，该阶段收集荧光。反应结果判断：空白对照和阴阳性对照成立，则检测结果有效；若a管fam荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca2阳性；a管fam荧光通道有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca4阳性；a管fam荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca5阳性；a管joe荧光通道和d管joe荧光通道分别有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为ca6阳性；a管joe荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为ca7阳性；a管joe荧光通道有tm值为59℃对应的溶解峰曲线判定为ca9阳性；a管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为68℃对应的溶解峰曲线判定为ca10阳性；a管tamra荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca12阳性；a管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ca16阳性；b管fam荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb1阳性；b管fam荧光通道有tm值为63℃对应的溶解峰曲线判定为cb2阳性；b管fam荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为cb3阳性；b管joe荧光通道有tm值为67℃对应的溶解峰曲线判定为cb4阳性；b管joe荧光通道有tm值为62℃对应的溶解峰曲线判定为cb5阳性；b管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71阳性；b管tamra荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为echo阳性；a管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管fam荧光通道有tm值为64℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-a亚型阳性；a管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管fam荧光通道有tm值为69℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1a亚型阳性；a管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为61℃对应的溶解峰曲线且c管fam荧光通道有tm值为60℃对应的溶解峰曲线判定为ca16-b1b亚型阳性；b管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管joe荧光通道有tm值为61℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-b亚型阳性；b管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管joe荧光通道有tm值为65℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4a亚型阳性；b管tamra荧光通道和d管tamra荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线且c管joe荧光通道有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为ev71-c4b亚型阳性；a管cy5荧光通道、b管cy5荧光通道、c管cy5荧光通道和d管cy5荧光通道分别有tm值为66℃对应的溶解峰曲线判定为阳性内质控合格。结果显示在阳性对照成立的条件下，待检目标均无特异性的溶解峰，表明本公开试剂盒能够有效区分检测目标与非检测目标，具有较好的特异性。5、最低检出限验证评估用检测样本：选取初始浓度为105拷贝/μl的肠道病毒ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a、ev71-c4b核酸梯度稀释为104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl，作为最低检出限评估的模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。结果显示本公开试剂盒的最低检出限可达到10拷贝/反应。6、覆盖度验证选择20种来源不同的ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a和ev71-c4b的粪便样本核酸作为覆盖度评估用模板。按照以上所述反应体系及反应程序进行试验。结果显示对所有120株肠道病毒均可覆盖检测出。7、试剂盒的保存期试验以100拷贝/μl的ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a、ev71-c4b临床粪便样本作为评估用样本。在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。结果显示本公开试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，表明该试剂盒的保存期至少为一年。对比例1、引物、探针合成按照表4和表5所示的引物、探针序列，进行序列合成。序列中y代表简并碱基t/c；r代表简并碱基a/g；w代表简并碱基a/t；探针中fam为6-羧基荧光素、joe为2，7-二甲基-4，5二氯-6-羧基荧光素、tamra为6-羧基四甲基罗丹明、cy5为5h-吲哚菁。表5中探针序列中的括号表示括号左侧的t具有荧光标记，括号中的内容表示荧光标记的选择。表4表52、特异性验证按照实施例的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物、探针的反应结果均为阴性。3、最低检出限验证按照实施例的方法进行最低检出限验证。实施例与对比例的最低检出限对比如下表6。表6由表6可知，对于样本中痕量的肠道病毒ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a、ev71-c4b核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。4、覆盖度验证按照实施例的方法进行覆盖度验证。实施例与对比例的覆盖度对比如下表7。表7检测目标实施例对比例ca21010ca41010ca51010ca61010ca7108ca91010ca10109ca121010ca16108cb1109cb2108cb31010cb41010cb5109ev711010echo109ca16-a1010ca16-b1a109ca16-b1b109ev71-b1010ev71-c4a1010ev71-c4b1010由表7可知，本公开的试剂盒检测覆盖度远远大于对比例的检测覆盖度。由实施例和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出包括ca2、ca4、ca5、ca6、ca7、ca9、ca10、ca12、ca16、cb1、cb2、cb3、cb4、cb5、ev71、echo、ca16-a、ca16-b1a、ca16-b1b、ev71-b、ev71-c4a、ev71-c4在内的22种肠道病毒，探针特异性高，且最低检出限更低，覆盖度更广。以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。序列表<110>北京卓诚惠生生物科技股份有限公司<120>用于检测肠道病毒的核酸试剂、试剂盒及系统<130>11659abt-r<160>118<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ggtacgartgccacagggtttaccaa26<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2attgccattgaaaggcttccctacc25<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cagctacagatggcaacttgatagag26<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgcagttgcacaaacgccataat23<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ttcgggtctggcaggaatct20<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6tatgtgaacatttccaacttgcgt24<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ttccgttcatgtcgccagcaa21<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ggatggcaaaatggcccat19<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aagctagccaacatcgtataggctt25<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aagtttgtaatgctggtttcctctg25<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tacgcttggcaaacctccact21<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12tcatagaagttgctgtatgcat22<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ggagtagttaacctcacrgat21<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14atctcgcattttctgcggagtt22<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tcttctctcgatcaggcttagca23<210>16<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cacaaaggtgaattctgcatcaaa24<210>17<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17cgggyacacagaatacagatggt23<210>18<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18aagcgcatgtaggtraataact22<210>19<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19ttcctgtgccggtctgc17<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agaggcagtgctgggttgtt20<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21cacacccagtgatacaatgcaaac24<210>22<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22aacttcctcctcagctgcg19<210>23<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23cccagtaccagataaagtggattcat26<210>24<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24agtgtgttaataccgtacaccccatt26<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25ccaacagaggaagctgtagaaaga24<210>26<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26ctctacagatgactctgatctggagt26<210>27<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27agaacttcctgtgtagatcrg21<210>28<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28tgcttgtgatcacaaaagttagctc25<210>29<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gcytatcaatggttttatgacgga24<210>30<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30gttattaggrcatgccccgtatt23<210>31<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31cagtgtagatcaggtcgatgag22<210>32<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32tatctgctccgcagttaggatt22<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33tacgttaactgggacattga20<210>34<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gacatacatgtactgca17<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gagaaagatcttgaatacgg20<210>36<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36cgcatcgggcgaggtatcca20<210>37<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37agatttggacctgcgagcg19<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gagcggctgtctccacaagt20<210>39<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39ctggagatgttcacctacatgcgct25<210>40<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40cctttccagcagtgcctgtatcatcc26<210>41<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41taaccctttgtggaagctccagag24<210>42<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42ttatgatggctaccccacatttggtg26<210>43<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43ctgagacaggatcgtcttcgctcgtt26<210>44<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44cgcaccagcrcgcatgtcaatcccat26<210>45<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>45tgtagcatacccagtrgtgtccgtcc26<210>46<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>46atcgacgttatgggattcgcccagctgc28<210>47<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>47ccgccgcagctgagcatatcc21<210>48<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>48tcaacactagacaagtggctcagct25<210>49<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>49cttgcacgatcagcatgtgtgtwttaca28<210>50<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>50ccaagtgtgttctggacagagggtaatgc29<210>51<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>51cagccgttgaaactgggcatacctct26<210>52<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>52agcttgcgccgtagttgagccacctg26<210>53<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>53cccacattcggagaacacaaacaggag27<210>54<211>26<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>54tgggacgcttcaatactgacatggtg26<210>55<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>55caaatgaggcgtaagtgtga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