用于富集低频DNA突变的DNA探针及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，本发明涉及用于富集低频dna突变的dna探针及其应用，更具体地，本发明涉及用于富集低频dna突变的dna探针、探针在制备试剂盒中的用途、试剂盒、富集低频dna突变的方法以及检测低频dna突变的方法。
背景技术：
：肺癌有很高的发病率和死亡率，它的发病率在美国是第二位，在中国是第一位，死亡率在美国和中国都是第一位。除了吸烟者，很多从未吸烟的人因为遗传和环境的因素也患有肺癌。肺癌患者中有85-90％的病例是非小细胞肺癌。近年来经大量研究，科学家对于这一类肺癌患者所携带的基因突变情况也有了更为清楚的认识。研究表明，肺癌患者的egfr基因编码区，主要是在外显子18-21上会发生突变，85％-90％的突变都是外显子19上的缺失突变和外显子21上l858r的点突变，这些突变与埃克替尼和吉非替尼等药物的临床疗效有关，即小分子酪氨酸激酶抑制剂能够竞争性抑制atp与egfr胞内酪氨酸激酶结构域的结合，进而影响酪氨酸残基的磷酸化，抑制egfr下游信号转导。此外，一些在肺癌患者人群中低频出现的驱动突变，如egfr基因20外显子上的s768i突变，21外显子上的l861q突变，braf基因v600e突变，这些肺癌患者都能够从靶向药物的治疗中获益。对这些基因突变位点的检测能够使得肺癌患者有机会接受更好的治疗方案，从而提高其生活质量和存活机会。因而，关于这些低频出现的驱动突变的检测方法的发展迫在眉睫。技术实现要素：本发明目的是至少在一定程度上解决相关的技术问题之一。为此，本申请的发明人设计了一组dna探针，这组dna探针可以同时或者分别对肺癌患者外周血游离dna(cfdna/ctdna)中的egfrs768i，egfrl861q，brafv600e进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤dna变异。同时，发明人还提出了富集低频dna突变的方法，应用该方法通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，实现了无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的dna，从而可进一步对肺癌患者靶向用药指导，以及在肺癌患者靶向治疗期间提供动态监控等。在本发明的第一方面，本发明提出了一种富集低频dna突变的dna探针。根据本发明的实施例，所述探针具有如下序列的至少之一：1)seqidno:1～4所示的核苷酸序列，2)与1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的核苷酸序列。gccatcgtg(seqidno:1)。aacagctgg(seqidno:2)。gatttctctgta(seqidno:3)。tacagagaaatc(seqidno:4)。根据本发明的实施例，上述探针可以同时或者分别对待测核酸样品中变异频率极低的突变egfrs768i，egfrl861q，brafv600e进行特异性的富集，进而实现上述低频突变的特异性检测。根据本发明的实施例，上述探针还可以包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述探针具有lna修饰。lna可以与互补单链核苷酸杂交，亲和性比相应的寡核苷酸高得多，形成的杂交物的解链温度都很高。根据本发明实施例的探针具有更好的热稳定性和生物学活性。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:1所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述lna修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸以及和第八位核苷酸上。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:2所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述lna修饰位于所述探针的第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸以及第八位核苷酸上。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:3所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述lna修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第四位核苷酸、第五位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:4所示的核苷酸序列，从探针的5’端到3’端的方向，所述lna修饰位于所述探针的第二位核苷酸、第三位核苷酸、第五位核苷酸、第六位核苷酸、第七位核苷酸、第九位核苷酸、第十位核苷酸以及第十一位核苷酸上。根据本发明的实施例，所述探针5’端具有生物素标记。结合有生物素的探针可后续与链霉亲和素磁珠结合，进而进行磁珠纯化，进一步提高对低频dna突变的富集的特异性。根据本发明的实施例，所述探针3’端具有磷酸修饰。探针的3’端进行磷酸修饰能阻止该探针在pcr过程中进行错误的延伸。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:1所示的核苷酸序列，所述探针用于富集egfr基因20号外显子发生s7681突变的样本。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:2所示的核苷酸序列，所述探针用于富集egfr基因21号外显子发生l861q突变的样本。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:3或seqidno:4所示的核苷酸序列，所述探针用于富集braf基因发生v600e突变的样本。在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的富集低频dna突变的dna探针在制备试剂盒中的用途，所述低频dna突变为癌症相关突变，所述试剂盒用于诊断肺癌或指导用药。如前所述，前面所述的探针可以同时或者分别对待测核酸样本中低频dna突变中的egfrs768i，egfrl861q，brafv600e进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤dna变异。进而利用上述探针制备获得的试剂盒能通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的dna，进而判定肺癌患者是否有上述egfr突变，进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。根据本发明的实施例，上述用途还可以包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，所述癌症相关突变为egfr基因20号外显子发生s7681突变、egfr基因21号外显子发生l861q突变或braf基因发生v600e突变。在本发明的第三方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的dna探针。如前所述，前面所述的探针可以同时或者分别对待测核酸样本中低频dna突变egfrs768i，egfrl861q，brafv600e进行特异性的富集，能够检测到血液或其他体液中变异频率极低的肿瘤dna变异。进而包含上述探针的试剂盒能通过检测患者外周血或其他体液，在基因突变频率较低的情况下，无创、高灵敏性、高特异性地检测患者血液或其他体液中的基因突变的dna，进而判定肺癌患者是否有上述egfr突变，进而对肺癌患者的精准治疗提供指导以及能为肺癌患者在靶向治疗期间提供动态监控等。在本发明的第四方面，本发明提出了一种富集低频dna突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)对dna片段进行第一pcr扩增处理，以便获得第一pcr扩增产物；2)对第一pcr扩增产物进行变性处理，以便获得变性产物；3)将所述变性产物与前面所述的dna探针进行杂交处理；4)将杂交处理产物进行第二pcr扩增处理，以便获得第二pcr扩增产物，所述第二pcr扩增产物构成低频dna突变集。根据本发明实施例的富集低频dna突变的方法，可实现对低频dna突变-egfrs768i，egfrl861q，brafv600e的特异性富集，进而用于对上述低频突变位点的科学研究，如相关功能或作用机制研究或用于对上述低频突变位点的特异性检测，实现对上述低频突变位点相关疾病的检测。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，在步骤3)之后、步骤4)之前，进一步包括：将所述杂交处理产物进行纯化处理。进而可进一步提高杂交处理产物的纯度，提高低频dna的富集效率。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:1或seqidno:3或seqidno:4所示的核苷酸序列，所述杂交处理是在31℃的条件下进行30min。由此，富集效果更佳。根据本发明的实施例，所述探针具有seqidno:2所示的核苷酸序列，所述杂交处理是在15℃的条件下进行30min。根据本发明的实施例，所述纯化处理通过链霉素亲和性磁珠纯化进行的。链霉素亲和性磁珠可特异性地结合具有生物素标记的上述dna探针，而上述dna探针又在杂交过程中与含有dna低频突变的序列特异性结合，进而通过磁珠纯化，可进一步提高对dna低频突变的特异性富集。根据本发明的实施例，所述dna片段来源于血液或其他体液游离ctdna或cfdna。根据本发明实施例的方法，可实现血液或其他体液游离ctdna或cfdna中低频dna突变的高效富集。在本发明的第五方面，本发明提出了一种检测低频dna突变的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)根据前面所述的方法，富集预定低频dna突变，以便获得预定低频dna突变集；2)对所述预定低频dna突变集进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果由至少一个测序读段构成；以及3)将所述测序读段与参考序列进行比对，以便确定预定低频dna突变位点是否存在突变。根据本发明实施例的方法，可高灵敏性和特异性地实现对待测核酸样品中低频dna突变-egfrs768i，egfrl861q，brafv600e的检测，可以检测出突变频率低至0.1％的低频变异。根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本发明的实施例，将所述测序读段与参考序列进行比对后，进一步包括确定预定低频dna突变位点的碱基峰，所述预定低频dna突变位点的突变碱基峰出现在相应野生型dna碱基峰的位置是存在预定低频dna突变位点的指示。根据本发明的具体实施例，所述预定低频dna突变位点的突变碱基峰出现在野生型dna碱基峰的位置，是预定低频dna突变位点为点突变的指示。根据本发明的具体实施例，所述探针具有seqidno:2所示的核苷酸序列，所述第一pcr扩增和第二pcr扩增是通过巢氏pcr进行的。由此，根据本发明实施例富集产物进行测序的结果会更加稳定，更有助于结果的判断。在本发明的再一方面，本发明在特殊设计的dna探针的基础上，采用捕获富集的方法，建立了检测肺腺癌患者人群中的3种稀有突变egfrs768i，egfrl861q，brafv600e的方法。根据本发明的一个具体实施例，所述方法通过对肺腺癌患者外周血或其他体液ctdna的突变情况进行检测。根据本发明实施例的上述检测低频dna突变的方法具有如下特点：1.肺腺癌患者egfr基因的突变检测；2.微创性：受检者只需要提供10ml外周血或其他体液样本；3.实时性：可对受检者进行多次实时采血检测，实现肿瘤的动态监控；4.高灵敏度：不受限于病灶位置及大小，可以检测出突变频率为0.1％的低频变异；5.高特异性：在ctdna含量较少的情况下，能够保证较低的假阳性率、假阴性率，确保得到的检测结果能够准确的反应受检者实时外周血或其他体液状况。附图说明图1是根据本发明实施例的采用egfrs768i-1探针，无论如何调整实验条件，如杂交温度，洗脱温度等，都无法在含1.5％突变的样本上富集突变，即无法在检测位置上看到t碱基峰的结果图；图2是根据本发明实施例的采用egfrs768i-2探针，在含1％突变的样本上，多个实验条件下(不同的杂交温度，不同的洗脱温度)都可以看到突变的富集，即在检测位置上看到t碱基峰的结果图；图3是根据本发明实施例的在egfr基因野生型、含5％egfrs768i突变、含1％egfrs768i突变、含0.1％egfrs768i突变的标准品上进行测试的结果图；图4是根据本发明实施例的egfrl861q突变的实验结果图，其中左图：两轮pcr中选择相同的引物，则最后的富集产物测序图谱会存在杂峰干扰的问题，影响突变存在与否的判断，右图：在含有0.1％l861q突变样品上进行测试；图5是根据本发明实施例的在egfr基因野生型、含5％egfrl861q突变、含1％egfrl861q突变、含0.1％egfrl861q突变的标准品上进行测试结果图；图6是根据本发明实施例的在含有0.1％brafv600e突变的样品上进行测试结果图；图7是根据本发明实施例的在brafv600e-2探针的条件下，在barf基因野生型、含5％brafv600e突变、含1％brafv600e突变、含0.1％barfv600e突变的标准品上进行测试结果图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。lna是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2′-o，4′-c-亚甲基-β-d-呋喃核糖核酸单体，核糖的2′-o位和4′-c位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖c3′-内型的n构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。lna修饰是指lna直接修饰在核苷酸的五碳糖上。本发明适用于所有可以提供外周血或其他体液样本的肺癌患者人群，所涉及的内容主要包括3大部分：用于肺癌患者靶向用药相关基因egfr敏感突变位点富集的dna探针设计、样本突变富集及测序、变异数据解读。下面具体介绍这三大部分：(一)用于肺癌患者靶向用药相关基因egfr敏感突变位点富集的dna探针设计基于相关文献参考，根据lna修饰碱基发生错配时，其tm值会下降(gt错配除外)，且比正常碱基发生错配时tm值降低更多的原则，设计了与egfr基因突变型序列完全配对的lna修饰的dna探针，对肺癌靶向用药相关基因egfrs768i，egfrl861q，brafv600e进行特异性的捕获。dna探针设计如下：表1：dna探针列表名称序列egfrs768i探针biot-g+cc+a+t+cg+tg-phosegfrl861q探针biot-aa+c+a+gc+t+gg-phosbrafv600e探针1biot-g+a+t+t+tc+tc+t+g+ta-phosbrafv600e探针2biot-t+a+ca+g+a+ga+a+a+tc-phos备注：+：代表lna修饰，代表lna直接修饰在该核苷酸序列的“+”后的核苷酸的五碳糖上，biot：代表生物素，phos：代表磷酸。(二)样本突变富集及测序1、对cfdna/ctdna片段进行第一轮pcr扩增；2、取部分扩增产物进行变性；3、在变性产物中加入特殊设计的dna探针进行杂交；4、在杂交体系中加入链霉素亲和性磁珠，结合dna探针上的生物素；5、用洗涤缓冲液清洗上述混合物两遍；6、清洗后的产物进行第二轮pcr；7、用abi3730进行sanger测序。(三)变异数据解读1、sanger测序得到测序碱基峰图；2、与参考序列进行比对；3、寻找突变位点的突变碱基峰；4、判断其是否有突变存在。以下介绍本发明的具体实施例。实施例1egfrs768i突变位点的检测本实施例中以egfr基因20外显子的s768i突变为例来分析本发明的特殊dna探针捕获富集egfr突变的方法。实验用的样本为实验室配置的egfr基因野生型、含5％egfrs768i突变、含1％egfrs768i突变、含0.1％egfrs768i突变的标准品。利用上述方法检测egfr20外显子的s768i突变的方法包括以下步骤：1、第一轮pcr扩增：2、变性缓冲液的配制：1mnaoh125μl80mmedta100μl0.5g/l酚红400μl水375μl总体积1000μl3、pcr产物变性：4、杂交缓冲液的配置：5、探针杂交：其中，使用的egfrs768i探针如下所示：名称序列egfrs768i-1探针biot-ggc+c+at+c+gtgg-phosegfrs768i-2探针biot-g+cc+a+t+cg+tg-phos6、准备链霉素亲和性磁珠每个样本需要20μl磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：1)加入200μlsureselectbinding缓冲液；2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；3)离心管放入磁力架；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，共2次；6)加入30μlsureselectbinding缓冲液悬浮磁珠。7、链霉素亲和性磁珠与dna探针结合：8、洗涤未捕获的dna片段：1)在磁力的作用下，20℃静置2min；2)待溶液澄清，吸掉上清液；3)加入100μlwashing缓冲液，吹吸混匀；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，1次；6)加入20μl超纯水重悬磁珠。9、第二轮pcr：10、测序：本实施例中，采用abi3730进行sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。11、突变分析：1)sanger测序得到测序碱基峰图；2)与参考序列进行比对；3)寻找突变位点的突变碱基峰；4)判断其是否有突变存在。结果如图1和图2所示。如果egfr发生了s768i突变，则egfr的编码基因发生了g碱基向t碱基的突变。图1显示，采用egfrs768i-1探针，无论如何调整实验条件，如杂交温度，洗脱温度等，都无法在含1.5％突变的样本上富集突变，即无法在检测位置上看到t碱基峰；图2显示，采用egfrs768i-2探针，在含1％突变的样本上，多个实验条件下(不同的杂交温度，不同的洗脱温度)都可以看到突变的富集，即在检测位置上看到t碱基峰。进而，根据富集程度的高低，发明人最终选择了egfrs768i-2探针在杂交温度37℃，洗脱温度37℃的条件下进行对egfrs768i的特异性富集。在该实验条件下，发明人进一步对egfr基因野生型、含5％egfrs768i突变、含1％egfrs768i突变、含0.1％egfrs768i突变的标准品上进行测试，结果如图3所示，结果显示，egfrs768i-2探针对不同浓度的低频egfrs768i突变均可实现特异性富集。实施例2egfrl861q突变位点的检测本例中以egfr基因21外显子的l861q突变为例来分析本发明的特殊dna探针捕获富集egfr突变的方法。实验用的样本为实验室配置的egfr基因野生型、含5％egfrl861q突变、含1％egfrl861q突变、含0.1％egfrl861q突变的标准品。利用上述方法检测egfr21外显子的l861q突变的方法包括以下步骤：1、第一轮pcr扩增2、变性缓冲液的配制1mnaoh125μl80mmedta100μl0.5g/l酚红400μl水375μl总体积1000μl3、pcr产物变性4、杂交缓冲液的配置5、探针杂交其中，egfrl861q探针的序列如下所示：名称序列egfrl861q探针(位于正义链)biot-aa+c+a+gc+t+gg-phos6、准备链霉素亲和性磁珠每个样本需要20μl磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：1)加入200μlsureselectbinding缓冲液；2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；3)离心管放入磁力架；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，共2次；6)加入30μlsureselectbinding缓冲液悬浮磁珠。7、链霉素亲和性磁珠与dna探针结合8、洗涤未捕获的dna片段1)在磁力的作用下，20℃静置2min；2)待溶液澄清，吸掉上清液；3)加入100μlwashing缓冲液，吹吸混匀；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，1次；6)加入20μl超纯水重悬磁珠。9、第二轮pcr10、测序本实施例中，采用abi3730进行sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。11、突变分析1)sanger测序得到测序碱基峰图；2)与参考序列进行比对；3)寻找突变位点的突变碱基峰；4)判断其是否有突变存在。结果如图4所示。如发生了egfrl861q突变，则egfr的编码基因发生了a碱基向t碱基的突变。发明人在研究过程中发现，如果在两轮pcr中选择相同的引物，则最后的富集产物测序图谱会存在杂峰干扰的问题，影响突变存在与否的判断，如图4左图所示。而如果采用巢式pcr，则测序结果会非常稳定，有助于结果的判断。发明人进一步在含有0.1％l861q突变样品上进行测试，结果如图4右图所示。在巢式pcr的实验条件下，发明人进一步在egfr基因野生型、含5％egfrl861q突变、含1％egfrl861q突变、含0.1％egfrl861q突变的标准品上进行测试，结果如图5所示。实施例3brafv600e突变位点的检测本例中以braf基因v600e突变为例来分析本发明的特殊dna探针捕获富集braf突变的方法。实验用的样本为实验室配置的braf基因野生型、含5％brafv600e突变、含1％brafv600e突变、含0.1％brafv600e突变的标准品。利用上述方法检测brafv600e突变的方法包括以下步骤：1、第一轮pcr扩增2、变性缓冲液的配制1mnaoh125μl80mmedta100μl0.5g/l酚红400μl水375μl总体积1000μl3、pcr产物变性4、杂交缓冲液的配置5、探针杂交brafv600e探针序列如下所示：名称序列brafv600e-1探针biot-g+a+t+t+tc+tc+t+g+ta-phosbrafv600e-2探针biot-t+a+ca+g+a+ga+a+a+tc-phos6、准备链霉素亲和性磁珠每个样本需要20μl磁珠，在离心管中进行磁珠清洗：1)加入200μlsureselectbinding缓冲液；2)吹吸混匀至磁珠全部悬浮；3)离心管放入磁力架；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，共2次；6)加入30μlsureselectbinding缓冲液悬浮磁珠。7、链霉素亲和性磁珠与dna探针结合8、洗涤未捕获的dna片段1)在磁力的作用下，20℃静置2min；2)待溶液澄清，吸掉上清液；3)加入100μlwashing缓冲液，吹吸混匀；4)溶液澄清后，去除上清；5)重复步骤1-4，1次；6)加入20μl超纯水重悬磁珠。9、第二轮pcr10、测序本实施例中，采用abi3730进行sanger测序，测序实验操作按照制造商提供的操作说明书进行测序操作。11、突变分析1.sanger测序得到测序碱基峰图；2.与参考序列进行比对；3.寻找突变位点的突变碱基峰；4.判断其是否有突变存在。结果如图6所示。如发生了brafv600e突变，则braf编码基因发生了t碱基向a碱基的突变。发明人在研究过程中发现，这两组探针都可以达到一定的富集效果，但比较而言，brafv600e-2探针好于brafv600e-1探针。发明人进一步在含有0.1％brafv600e突变的样品上进行测试，结果如图6所示。发明人发现，这两条探针的特异性上有区别。brafv600e-1探针是设计在反义链上的，而brafv600e-2探针是设计在正义链上的，两者对于各自特异性匹配序列的严格程度上有差异。在brafv600e-2探针的条件下，在barf基因野生型、含5％brafv600e突变、含1％brafv600e突变、含0.1％barfv600e突变的标准品上进行测试，结果如图7所示。结果显示，brafv600e-1探针和brafv600e-2探针可实现对不同浓度barfv600e突变的富集和检测。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>杭州瑞普基因科技有限公司<120>用于富集低频dna突变的dna探针及其应用<130>pidc3185739<160>16<170>patentinversion3.3<210>1<211>9<212>dna<213>artificial<220><223>富集egfr基因20号外显子发生s7681突变的样本的探针的核苷酸序列<400>1gccatcgtg9<210>2<211>9<212>dna<213>artificial<220><223>富集egfr基因21号外显子发生l861q突变的样本探针的核苷酸序列<400>2aacagctgg9<210>3<211>12<212>dna<213>artificial<220><223>用于富集braf基因发生v600e突变的样本的探针的核苷酸序列<400>3gatttctctgta12<210>4<211>12<212>dna<213>artificial<220><223>用于富集braf基因发生v600e突变的样本的探针的核苷酸序列<400>4tacagagaaatc12<210>5<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>s768i-正向引物<400>5ctggccaccatgcgaagcca20<210>6<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>s768i-反向引物<400>6acatagtccaggaggcagcc20<210>7<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>s768i-2nd-正向引物<400>7cactgacgtgcctctccctc20<210>8<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>s768i-2nd-反向引物<400>8ccaggaggcagccgaagggc20<210>9<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>l861q-正向引物<400>9ctggcagccaggaacgtac19<210>10<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>l861q-反向引物<400>10gacctaaagccacctccttactt23<210>11<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>l861q-2nd-正向引物<400>11aggaacgtactggtgaaaac20<210>12<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>l861q-2nd-反向引物<400>12cctccttactttgcctccttc21<210>13<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>v600e-正向引物<400>13tttcttcatgaagacctcacagt23<210>14<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>v600e-反向引物<400>14cagtggaaaaatagcctcaat21<210>15<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>v600e正向引物<400>15tttcttcatgaagacctcacagt23<210>16<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>v600e反向引物<400>16cagtggaaaaatagcctcaat21当前第1页12