一株猪丹毒丝菌及其应用的制作方法

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一株猪丹毒丝菌及其应用。

背景技术：

猪丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)是一种小型、细长、直杆状的革兰氏阳性细菌，可引起猪和许多其他动物出现丹毒。猪丹毒通常表现为急性或亚急性败血症和慢性增殖性病变。心脏是主要的靶器官，通常表现为明显的损伤。猪丹毒这种疾病发生在世界各地，在欧洲、亚洲、澳大利亚和美洲具有重要的经济意义。猪丹毒丝菌也是人类的一种人畜共患病病原体，是皮肤病-类丹毒的病因。减毒活疫苗和细菌早就被用来控制猪丹毒。然而，弱毒疫苗的失败经常发生，注射后常引起剧烈的反应或死亡。猪丹毒的高发仍然是世界范围内猪肉产业关注的问题。此外，疫苗接种产生的抗体很难与野生株丹毒丝菌感染引起的抗体区分开来。因此，需要开发新的、更有效的疫苗。

丹毒丝菌血清型众多，迄今已确认的有26个血清型(即1a、1b、2-24、n)，不同血清型丹毒丝菌菌株的毒力存在明显差异，1a、1b型的致病力最强，源自败血症病例的菌株多为1a型，源自疹块型病例的菌株多为2型。由于1a型多引起中大猪的急性败血死亡，所以一旦发生此病将很难控制，从而给养殖户造成重大经济财产损失，给我国养猪业的发展带来巨大的困难。在先研发的很多药物对猪丹毒丝菌病都能起到很好的治疗效果，但是随着养殖规模发展，大量抗菌药物的使用，休药期药物的不合理使用，都造成病原菌的耐药现象越来越严重，越来越不利于临床疾病的预防和治疗。因此亟需研发一种新的具有较好免疫原性的菌株制备的疫苗。

技术实现要素：

针对目前猪丹毒病治疗存在的问题，本发明提供一株1a型猪丹毒菌及其应用。

本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种猪丹毒丝菌，所述的猪丹毒丝菌为猪丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)hn1573，保藏编号：cgmccno：16808，保藏日期：2018年11月09日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

上述的一种猪丹毒丝菌，所述猪丹毒丝菌为1a型猪丹毒丝菌。

本发明还提供一种猪丹毒丝菌在制备防控猪丹毒病的药物中的应用。

上述的一种猪丹毒丝菌在制备防控猪丹毒病的药物中的应用，所述药物为疫苗。

一种猪丹毒丝菌灭活疫苗，该疫苗是由猪丹毒丝菌血清型抗原和佐剂制成，所述猪丹毒丝菌血清型抗原为已灭活的猪丹毒丝菌hn1573株抗原。

上述的一种猪丹毒丝菌灭活疫苗，所述佐剂为氢氧化铝佐剂。

上述的一种猪丹毒丝菌灭活疫苗，所述猪丹毒丝菌菌量为1×10⁹cfu/ml。

上述任一种猪丹毒丝菌灭活疫苗的制备方法为：将猪丹毒丝菌接种到tsb液体培养基，置于37℃摇床中培养，18h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹cfu/ml，加入甲醛至终浓度为0.2％，于37℃灭活12h；灭活后的菌液按体积比9:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得猪丹毒丝菌灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的菌株hn1573分离自发生急性败血症死亡的育肥猪的心血，在tsa固体培养基上分离时无其它细菌生长，只有猪丹毒丝菌生长，在tsb液体培养基中增殖滴度高，达10⁹cfu/ml以上。

2、本发明中的菌株hn1573对保育猪具有较强的致病力，引起保育猪发病死亡，具有良好的免疫原性。

3、根据本发明中的菌株hn1573制备的疫苗对猪的猪丹毒丝菌病具有较好的保护效果。

附图说明：

图1为菌株hn1573菌落形态。

图2为菌株hn1573菌体革兰氏染色100×显微镜下形态。

图3为菌株hn1573的pcr鉴定结果，图中的marker为dl2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为引物p1、p2扩增hn1573株16srrna基因结果；泳道2为引物p1、p2扩增疫苗株g4t10株16srrna基因结果；泳道3为引物p1、p2扩增沙门氏菌c500株16srrna基因结果。

图4为菌株hn1573的血清型pcr鉴定结果，图中的marker为dl2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；泳道1为引物p3、p4扩增hn1573株glycerol-3-phosphatecytidylyltransferase基因结果；泳道2为引物p3、p4扩增疫苗株g4t10株glycerol-3-phosphatecytidylyltransferase基因结果；泳道3为引物p3、p4扩增沙门氏菌c500株结果。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。

本发明所述猪丹毒丝菌的病料来自于2018年8月在河南省原阳县某大型养猪场采集的发生急性败血症死亡的6月龄育肥猪的心血。

实施例1：菌株hn1573的分离和鉴定

1.1培养基的制备

tsb液体培养基：将tsb肉汤粉(trypticsoybroth，胰蛋白胨大豆肉汤)30g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml；

tsa固体培养基：将tsa琼脂粉(trypticsoyagar，胰蛋白胨大豆琼脂)40g，溶于1000ml超纯水中，115℃灭菌15min，加胎牛血清50ml；于4℃保存备用。

1.2菌株的分离培养

无菌采集病猪的心血接种于tsa固体培养基上，37℃恒温培养箱中培养24-36h，长出一致的针尖状大小、无色透明，圆形、光滑、边缘整齐菌落(见图1)。纯化接种后，进行革兰氏染色，该菌为革兰氏阳性菌，直或稍弯曲的细杆菌，链状排列或成长丝(见图2)。从菌株的形态学与生化特性结果初步判定为猪丹毒丝菌属，命名为菌株hn1573。

1.3菌株的鉴定

1.3.1引物设计

根据猪丹毒丝菌根据丹毒丝菌16srrna基因(no.m23728)序列，设计一对通用引物，用于猪丹毒丝菌的扩增，引物序列如下：

p1：5’-agatgccatagaaactggta-3’(seqidno.1)

p2：5’-ctgtatccgccataacta-3’(seqidno.2)

扩增片段大小为407bp。

根据猪丹毒丝菌glycerol-3-phosphatecytidylyltransferase基因的序列设计一对猪丹毒丝菌1a型的特异性引物，用于猪丹毒丝菌1a型的扩增，引物序列如下：

p3：5’-ctcctaacgctttagcacgc-3’(seqidno.3)

p4：5’-tgatcctttgccactaatgc-3’(seqidno.4)

扩增片段大小为356bp。

1.3.2pcr鉴定

按照dna提取试剂盒的操作步骤提取出菌株hn1573的dna，分光光度计测定浓度为100ug/ml，进行pcr鉴定。

pcr扩增反应体系为25μl：10×缓冲液2.5μl，2.5mmdntps0.5μl，10μm/l通用引物p1，p2各1μl，5u/μlrtaq1μl，100ug/mldna模板1μl，加入ddh2o至25μl。疫苗株g4t10株为阳性对照，沙门氏菌c500株为阴性对照。

反应条件：95℃预变性2min，进入循环：94℃30s，60℃30s，68℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，pcr产物4℃保存。

扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μl，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。结果扩增出407bp片段，测序与猪丹毒丝菌wh13013株(genbankno：cp017116)100％同源，测序结果如下，证明菌株hn1573为猪丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)。

agatgccatagaaactggtagactagagtgcaggagaggttagtggaattccatgtgtagcggtaaaatgcgtagatatatggaggaacaccagtggcgaaggcggctaactggcctgtaactgacgctgaggctcgaaagcgtggggagcaaataggattagataccctagtagtccacgccgtaaacgatggatactaagtgttggagaaattcagtgctgtagttaacgcaataagtatcccgcctggggagtatgcgcgcaagcgtaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacataccgcgcaaaagcacagagatgtgtaatagttatggcggatacag(seqidno.5)

1.3.3血清型鉴定

参照1.3.2pcr鉴定方法，用猪丹毒丝菌1a型的特异性引物p3、p4扩增，结果扩增出356bp大小片段(见图3)，测序结果如下，与猪丹毒丝菌wh13013株(genbankno:cp017116)100％同源，证明菌株hn1573为1a型猪丹毒丝菌。

ctcctaacgctttagcacgctttagaatattaatatgaccttgatgtaataaatcaaacgtaccgtatgttataacttttttcatttgtttactcctccactaattaatttgatgactattacactttatcctctctactagactaaaatttaactatttgctaatagttccaatattttcgaaaaagtcgataaatctttcagaggatttattgtccatatatttattcaccttatgattgacttcttctctcttacttttgaaactatcgacttcttctaatacattttcgaagaatttaattaaaccatctaaatcagttatcttataacccggcattagtggcaaaggatca(seqidno.6)

1.4毒力试验

试验动物为30日龄断奶健康的仔猪10只。试验动物分为两组，对照组5只，试验组5只。将菌株hn1573接种tsb液体培养基，37℃摇床培养18h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算原液菌体浓度，调整至2.5×10⁸cfu/ml，试验组动物通过颈部皮下注射接种2mlhn1573株液体培养物，对照组动物通过颈部皮下注射接种32ml灭菌的tsb液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。

观察发现：试验组动物在接种hn157324h后表现出高热，体温达42-43℃、稽留不退、卧地、不食、黏膜发绀等症状，3天内全部死亡；对照组动物在试验期间体温正常且无明显的临床症状。

试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀5头对照组动物；采集病料，进行猪丹毒丝菌分离。试验组剖检呈明显的全身败血症变化，肾脏淤血、肿大呈紫红色，脾脏充血肿大，呈樱桃红色，全身淋巴结充血、出血、肿大，胃、十二指肠呈急性出血性卡他性炎。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的5份病料均未分离到猪丹毒丝菌，试验组的5份病料中均分离到猪丹毒丝菌，pcr鉴定结果与hn1573一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将猪丹毒丝菌菌株hn1573接种到tsb液体培养基，置于37℃摇床中培养，18h后收取培养物，测定浓度，调整培养物中的菌数为2×10⁹cfu/ml，每1000ml菌液加2ml甲醛溶液，于37℃灭活12h。灭活后的菌液按体积比9:1加入氢氧化铝佐剂，混合制得猪丹毒丝菌灭活疫苗。

2.2疫苗的安全性试验

选取30日龄健康保育猪10头，分为2组，每组5头。

疫苗组：颈部皮下注射4ml本疫苗；

对照组：颈部皮下注射4ml灭菌生理盐水。测定动物体温，观察临床表现，共观察2周。

观察期间，疫苗组和对照组的保育猪在整个观察期间呼吸、食欲、精神状态都正常，说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3疫苗的效力试验

选取30日健康仔猪30头，分为6组，每组5头。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.5ml、1ml、1.5ml和2ml；第5组为未免疫组；第6组为健康对照组，注射2ml灭菌生理盐水。疫苗组和健康对照组3周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后14天各组用10⁹cfu的hn1573菌液采取静脉注射攻毒。观察仔猪的临床表现，并每日测定体温，共观察2周。对死亡猪肺脏等器官进行猪丹毒丝菌分离培养。

观察发现：疫苗组与未免疫组有明显的差异，攻毒后第二天，未免疫组第二天开始出现临床症状，体温升高，卧地，不食，黏膜发绀，第2天开始出现死亡，1周内5头全部死亡。

剖检死亡猪肾脏、脾脏、全身淋巴结肿大淤血或出血。健康对照组的仔猪均未发病。而疫苗组中，0.5ml疫苗组的5头仔猪中有3头出现临床症状和病例变化；1ml疫苗组的5头仔猪中有2头出现临床症状和病例变化；1.5ml疫苗组的5头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；2ml疫苗组的5头仔猪没有发病。免疫攻毒保护情况见表1.

表1猪丹毒丝菌hn1573株免疫攻毒试验结果

注：“——”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.5ml含菌量为1×10⁹cfu/ml。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一株猪丹毒丝菌及其应用

<141>2019-01-31

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna/rna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

agatgccatagaaactggta20

<210>2

<211>18

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<210>4

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