用于治疗肥胖症的胰高血糖素/GLP-1激动剂的制作方法

将与本申请一起以电子方式提交的处于ascii文本文件形式的序列表的内容(名称：序列表_ascii.txt；大小：12.3千字节；以及创建日期2013年12月10日)通过引用以其全文结合在此。背景肥胖症是全世界重大且日益增长的健康问题，并且与许多危及生命的疾病相关，这些疾病如心血管疾病、肾脏病、高血压、中风、不育、呼吸功能障碍、和2型糖尿病。胰高血糖素和胰高血糖素样肽-1(glp-1)衍生自前胰高血糖素原，前胰高血糖素原为具有158个氨基酸的前体多肽，其在不同的组织中被加工形成许多种不同的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(glp-1)、胰高血糖素样肽-2(glp-2)和胃泌酸调节素(oxm)，它们涉及许多种生理功能，包括葡萄糖稳态、胰岛素分泌、胃排空、和肠道生长，以及调节进食。胰高血糖素是具有相应于胰高血糖素原的氨基酸33到61(前胰高血糖素原的53到81)的29个氨基酸的肽，而glp-1产生为具有相应于胰高血糖素原的氨基酸72到108(前胰高血糖素原的92到128)的37个氨基酸的肽。glp-1(7-36)酰胺或glp-1(7-37)酸是glp-1的生物活性形式，其在glp-1受体处显示出基本上等同的活性。胰高血糖素是通过胰脏产生的并且与胰高血糖素受体(“glucr”)相互作用。胰高血糖素在肝脏中起作用经由糖异生和糖原分解而升高血糖。当血糖开始下降时，胰高血糖素发信号给肝脏以便分解糖原和释放葡萄糖，从而引起血糖水平朝向正常水平上升。glp-1相比于胰高血糖素具有不同的生物活性。它从肠l细胞分泌并且结合到glp-1受体上。它的活性包括刺激胰岛素合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌、和抑制进食。胰高血糖素和glp-1，作为它们对应的受体的激动剂起作用，已经显示出有效于减轻体重。在销售或开发中的用于治疗肥胖症的某些glp-1类似物包括，例如，利拉鲁肽(来自诺和诺德公司的)和艾塞那肽(来自礼来公司/艾米林生物制药公司的)。仍然需要更多的用于有效治疗肥胖症的药剂，例如具有改进的溶解度、可配制性(formulatability)、稳定性、和有效性的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。简要概述本披露提供了包含以下氨基酸序列或其由组成的分离肽：hx2qgtftsdx10sx12x13lx15x16x17x18ax20x21fx23x24wlx27x28gx30；其中x2是g或s，x10是y或k，x12是k、e、r、或s，x13是k或y，x15是d或e。x16是s或g，x17是e、r、q、或k，x18是r、s、或a，x20是r、k、或q，x21是d或e，x23是v或i，x24是a或q，x27是e或v，x28是a或k，并且x30是g或r(seqidno:4)。在某些方面，x2是s，x15是d，x16是s，x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x28是a，并且x30是g(seqidno:5)。在某些方面，如果x17是e，则x18是r，并且如果x17是r，则x18是s(seqidnos:6和7)。在某些方面，x10是y，x12是k，x13是k，并且x27是v(seqidnos:8和9)。在某些方面，x10是k，x13是y，并且x27是e(seqidnos:10和11)。在某些方面，x12是e(seqidnos:12和13)，可替代地，x12是r(seqidnos:14和15)。在某些方面，该分离肽包含seqidno:16或由其组成。在某些方面，该分离肽包含氨基酸序列seqidnos:17或氨基酸序列seqidno:19或由其组成。在某些方面，该分离肽包含seqidno:18或由其组成。在上述肽的某些实施例中，x30的羧基基团被酰胺化。在其他实施例中，该羧基基团是是未修饰的酸。在此提供的任何肽可进一步包含一个或多个修饰的氨基酸，例如，添加酰基部分，例如，修饰可以是在赖氨酸残基的n(ε)基团上的棕榈酰部分。在某些实施例中，该棕榈酰基团通过γ谷氨酸盐接头连接到赖氨酸残基上。已经使用了包括β丙氨酸和氨基己酸在内的替代接头。其他替代接头是可能的，包括含有短peg部分例如含有2个或4个peg单元的接头。在不同的实施例中，在此提供的这些分离肽可结合到胰高血糖素受体、glp-1受体、或胰高血糖素受体和glp-1受体这两者上。在某些方面，该胰高血糖素受体是人胰高血糖素受体，和或该glp-1受体是人glp-1受体。在某些方面，如在此提供的分离肽以在camp测定1(如在此所述)中小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的ec50结合到人胰高血糖素受体上。在某些方面，如在此提供的分离肽以在camp测定1中小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的ec50结合到人glp-1受体上。在某些方面，如在此提供的分离肽是glp-1活性的激动剂、胰高血糖素活性的激动剂、或glp-1活性和胰高血糖素活性这两者的激动剂。在一些实施例中，如在此提供的分离肽结合胰高血糖素受体和glp-1受体两者，并且相对于天然配体而言展现出在glp-1受体上比胰高血糖素受体上大至少大约2倍的活性。在一个实施例中，该肽在glp1r上(相比于glp1)具有比在胰高血糖素受体上(相对于胰高血糖素)高5到10倍的相对效价。在某些方面，如在此提供的分离肽可进一步包含与该肽相关的异源部分。在一些方面，该异源部分是蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(peg)、生物素、白蛋白、人血清白蛋白(hsa)、hsafcrn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非fniii支架、表位标签、重组多肽聚合物、细胞因子、或此类部分的两种或更多种的任何组合。还提供了包含如在此所述的分离肽、和载体的药用组合物。进一步提供了包括这样的药用组合物的药盒。还提供了用于治疗或预防由体重过多引起或其特征为体重过多的疾病或病症的方法，其中该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如在此提供的分离肽、或包含这种肽的组合物。在某些方面，该疾病或病症可以是肥胖、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、糖尿病前期、空腹血糖增加、2型糖尿病、高血压、血脂异常(或这些代谢危险因素的组合)、胰高血糖素瘤、心血管疾病，例如充血性心力衰竭、动脉硬化、动脉粥样硬化、冠心病、或外周动脉疾病；中风、呼吸功能障碍、肾脏病、以及它们的任何组合。根据该方法，可以通过注射，例如皮下注射，来给予如在此所述的分离肽。根据该方法，可以给予该肽每日一次。在某些实施例中，该受试者是人。还提供了用于治疗或预防由体重过多引起或其特征为体重过多的疾病或病症的方法，其中该方法包括向需要治疗的受试者给予有效量的如在此提供的分离肽、或包含这种肽的组合物。根据该方法，可以通过注射，例如皮下注射，来给予如在此所述的分离肽。根据该方法，可以给予该肽每日一次。在某些实施例中，该受试者是人。附图/图简要说明图1显示了在dio小鼠中在以三个不同的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g730之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。在不同组中的初始体重分别为：载体组：47.4±3.7g；g73010nmol/kg组：44.5±2.2g；g73020nmol/kg组：45.9±3.6g和g73050nmol/kg组：46.1±2.4g。图2显示了在dio小鼠中在以三个不同的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g797之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。在不同组中的初始体重分别为：载体组：47.4±3.7g；g7975nmol/kg组：47.5±1.2g；g79720nmol/kg组：47.4±2.2g和g79750nmol/kg组：47.2±1.8g。图3显示了在dio小鼠中在以20nmol/kg的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g812之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。在不同组中的初始体重分别为：载体组：47.4±3.7g和g81220nmol/kg组：49.2±3.4g。图4是比较针对呈现于图1、2、和3中的三种胰高血糖素/glp-1共激动剂肽的体重结果的变化的曲线图。图5显示了在dio小鼠中在以两个不同的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g796之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。图6显示了在dio小鼠中在以两个不同的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g865之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。图7显示了在dio小鼠中在以两个不同的剂量给予胰高血糖素/glp-1共激动剂肽g933之后从第0天开始体重变化的平均百分比，与载体治疗以及利拉鲁肽治疗进行比较。图8是比较针对呈现于图5、6、和7中的三种胰高血糖素/glp-1共激动剂肽的体重结果的变化的曲线图。详细说明定义贯穿本披露，术语“一个(a/an)”或“一种(a/an)”实体是指一个或多个或一种或多种该实体；例如，“一种多核苷酸”应被理解为表示一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个(一种或多种)”、以及“至少一个”(“至少一种”)在此可互换地使用。此外，在本文中使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在此在措词如“a和/或b”中所使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、以及“b”(单独)。同样，如在措词如“a、b和/或c”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一者：a、b、和c；a、b、或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。应当理解，当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与本披露相关的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，theconcisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology(《生物医学与分子生物学简明词典》)，juo，pei-show，第二版，2002，crc出版社；thedictionaryofcellandmolecularbiology(《细胞与分子生物学词典》)，第三版，1999，学术出版社(academicpress)；以及theoxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology(《生物化学与分子生物学牛津词典》)，修订版，2000，牛津大学出版社(oxforduniversitypress)为技术人员提供了在本披露中使用的许多术语的通用词典。单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(si)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。如在此使用的，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且包含两个或更多个氨基酸的任何链或多个链。因此，如在此使用的，“肽”、“肽亚单位”、“蛋白质”、“氨基酸链”、“氨基酸序列”、或用来指代两个或更多个氨基酸的链或多个链的任何其他术语，都被包括定义“多肽”中，尽管这些术语的每一者都可具有更具体的含义。术语“多肽”可以用来替代任何这些术语或者与其可互换地使用。该术语进一步包括已经历翻译后或合成后修饰的多肽，这些修饰例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。更具体地说，如在此使用的术语“肽”涵盖全长肽以及其片段、变体或衍生物，例如，glp-1/胰高血糖素激动剂肽(例如，在长度上为29、30、或31个氨基酸)。如在此披露的“肽”，例如，glp-1/胰高血糖素激动剂肽，可以是包含用来增加半衰期的另外的成分(例如像fc结构域或白蛋白结构域)的融合多肽的一部分。如在此描述的肽还可以许多不同的途径衍生。当提及glp-1/胰高血糖素激动剂肽时，术语“片段”、“类似物”、“衍生物”、或“变体”包括保留至少某种期望的活性(例如，结合到胰高血糖素和/或glp-1受体上)的任何肽。在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的片段包括在表达、纯化、和或给予受试者的过程中展现出所希望的特性的蛋白水解片段、缺失片段。如在此使用的，术语“变体”指的是由于氨基酸取代、缺失、插入、和/或修饰而不同于所列举肽的肽。变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体还可以，或可替代地，含有其他修饰-例如肽可以是缀合或偶联的，例如融合到异源氨基酸序列或其他部分上，例如用于增加半衰期、溶解度、或稳定性。缀合或偶联到在此提供的肽上的部分的实例包括，但不限于，白蛋白、免疫球蛋白fc区、聚乙二醇(peg)，等等。该肽还可以与便于该肽的合成、纯化或鉴定或增强该多肽结合到固相支持物上的接头或其他序列(例如，6组氨酸)缀合或产生偶联。如在此使用的术语“序列一致性”指的是在两个或更多个多核苷酸序列之间或在两个或更多个多肽序列之间的关系。当一个序列中的位置被与比较序列的相应位置中的相同核酸碱基或氨基酸占据时，该序列被说成是与那个位置“一致”。“序列一致性”的百分比是通过确定在这两个序列中存在的一致核酸碱基或氨基酸的位置的数目进行计算的，从而产生“一致”位置的数目。然后将“一致”位置的数目除以在比较窗口中的位置的总数并且乘以100而产生“序列一致性”的百分比。通过将两个最佳比对序列在比较窗口上进行比较来确定“序列一致性”的百分比。为了对用于比较的序列进行最优化的比对，多核苷酸或多肽序列的在比较窗口中的部分可包含被称为空位的添加或缺失，而参照序列保持不变。最佳比对是，即使存在空位，也可在参照序列与比较序列之间生成最大可能数量的“一致的”位置的比对。可以使用国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)截止到2004年9月1日提供的程序“blast2序列”的版本来确定在两个序列之间的“序列一致性”百分比，该程序可与程序blastn(用于核苷酸序列比较)以及blastp(用于多肽序列比较)结合使用，这些程序基于卡林(karlin)和阿尔丘尔(altschul)的算法(《美国国家科学院院刊》(proc.natl.acad.sci.usa)90(12)：5873-5877，1993)。当利用“blast2序列”时，对于下述参数使用截止到2004年9月1日的默认参数：字长(3)、开放空位罚分(11)、扩展空位罚分(1)、空位急速下降(50)、期望值(10)以及任何其他需要的包括但不限于基质选项的参数。术语“组合物”或“药用组合物”指的是含有在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽连同例如药学上可接受的、用于向需要治疗的受试者(例如，针对肥胖症正在进行治疗的人类受试者)给药的载体、赋形剂、或稀释剂的组合物。术语“药学上可接受的”是指这样的组合物，它们在合理的医学判断范围内适合于与人以及动物的组织接触而没有过度的毒性或其他与合理的利益/风险比相当的其他并发症。“有效量”是在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的量，其以单剂量或作为一系列剂量的一部分向受试者给药对于治疗(例如治疗肥胖症)是有效的。例如，当它的给药导致体重减轻或体重维持(例如，预防体重增加)、减少体脂肪、预防或调节低血糖症、预防或调节高血糖症、促进胰岛素合成、或减少进食中的一者或多者时，这个量是有效的。这个量可以是对于所有被治疗的受试者而言的固定剂量，或者可以取决于被治疗的受试者的重量、健康、和身体状况、所希望的体重减轻或体重维持的程度、肽的配制、医疗状况的专业评估、以及其他相关因素而改变。术语“受试者”意指任何受试者，尤其是需要用在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽进行治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括，但不限于，人类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊、母牛、猿类、猴子、猩猩、和黑猩猩，等等。在一个实施例中，该受试者是人类受试者。如在此使用的，“需要治疗的受试者”指的是其希望治疗的个体，例如，肥胖受试者或希望促进体重或体脂肪减少、体重或体脂肪维持、或在规定时间段预防体重增加或将其降低到最低限度的有肥胖症倾向的受试者。如在此使用的“glp-1/胰高血糖素激动剂肽”是嵌合肽，在测定1的条件下，其展现出相对于天然胰高血糖素的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更高的在胰高血糖素受体上的活性，并且还展现出相对于天然glp-1的至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或更高的在glp-1受体上的活性。如在此使用的术语“天然胰高血糖素”指的是天然存在的胰高血糖素，例如，人胰高血糖素，其包含seqidno:1的序列。术语“天然glp-1”指的是天然存在的glp-1，例如，人glp-1，并且是涵盖例如，glp-1(7-36)酰胺(seqidno:2)、glp-1(7-37)酸(seqidno:3)或者这两种化合物的混合物的通用术语。如在此使用的，在没有任何进一步指定的情况下，对“胰高血糖素”或“glp-1”的一般参考旨在分别表示天然的人胰高血糖素或天然的人glp-1。除非另外指出，“胰高血糖素”指的是人胰高血糖素，并且“glp-1”指的是人glp-1。glp-1/胰高血糖素激动剂肽在此提供了结合到胰高血糖素受体上且结合到glp-1受体上的肽。在某些实施例中，在此提供的肽是胰高血糖素和glp-1活性的共激动剂。这样的肽在此称为glp-1/胰高血糖素激动剂肽。glp-1/胰高血糖素激动剂肽在此提供为具有有利比率的glp-1和胰高血糖素活性，以便促进体重减轻、预防体重增加、或者维持所希望的体重，并且具有优化的溶解度、可配制性、和稳定性。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽在此被提供为对人glp1和人胰高血糖素受体具有活性，在某些实施例中相比于天然配体，对glp-1受体的相对活性比对胰高血糖素受体至少约高1倍、2倍、5倍、8倍、10倍、15倍、20倍、或25倍。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为对胰高血糖素和glp-1受体具有所希望的效价，并且具有所希望的促进体重减轻的相对效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在camp测定1(参见实例2)中展现出对glp-1受体小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在4.4％人血清白蛋白中的camp测定(测定2，参见实例2)中展现出对glp-1受体小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在camp测定1(参见实例2)中展现出对胰高血糖素受体小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在4.4％人血清白蛋白中的camp测定(测定2，参见实例2)中展现出对胰高血糖素受体小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为当使用测定2时，当与天然配体比较时具有在约0.01到0.50范围，例如，从约0.02到0.30，例如，约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、或0.30的相对glpl-r/glucr效价比。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在camp测定1(参见实例2)中展现出对葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃肽)(gipr)小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在4.4％人血清白蛋白中的camp测定(测定2，参见实例2)中展现出对gipr小于10,000pm、小于5000pm、小于2500pm、小于1000pm、小于900pm、小于800pm、小于700pm、小于600pm、小于500pm、小于400pm、小于300pm、小于200pm、小于100pm、小于50pm、小于25pm、小于20pm、小于15pm、小于10pm、小于5pm、小于4pm、小于3pm、或小于2pm的以ec50表示的体外效价。在某些实施例中，在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽具有可接受的溶解度、可易于配制、血浆稳定性、和改进的药代动力学特征中的一个或多个标准。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为可溶于在宽ph范围的标准缓冲液中。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽可以高达0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、或更高的浓度溶于通用缓冲溶液中，溶于缓冲系和例如从0.25到150mm的一系列离子强度中，包括但不限于，磷酸盐缓冲液、tris缓冲液、谷氨酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、或组氨酸缓冲液。示例性的缓冲液包括100mm谷氨酸盐ph4.5缓冲液、100mm乙酸盐ph5缓冲液、100mm琥珀酸盐ph5缓冲液、100mm磷酸盐ph6缓冲液、100mm组氨酸ph6缓冲液、100mm磷酸盐ph6.5缓冲液、100mm磷酸盐ph7.0缓冲液、100mm组氨酸ph7.0缓冲液、100mm磷酸盐ph7.5缓冲液、100mmtrisph7.5缓冲液、和100mmtrisph8.0缓冲液。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为能以0.8mg/ml溶于跨一系列ph范围，例如，从ph4.0到ph8.0，例如，在ph4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、或8.5的标准缓冲液中。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为可溶于从ph4.5到8.0、5.0到8.0、5.5到8.0、6.0到8.0、6.5到8.0、7.0到8.0、4.5到8.5、5.5到8.5、5.5到8.5、6.0到8.5、6.5到8.5、或7.0到8.5的标准缓冲液中。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为可在标准药物配制品中配制。示例性配制品包括，但不限于：0.1mtrisph7.5，150mm甘露醇，最终配制品ph＝7.2；0.05mtris，50mm精氨酸/精氨酸，最终配制品ph＝8.0；或磷酸钠缓冲液(ph8)/1.85％w/v丙二醇，最终配制品ph＝7.0。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为以高达0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、或更高的浓度可溶于这些或其他配制品中。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为针对在血清或血浆中的蛋白酶是可接受地稳定的。胰高血糖素或glp-1的常见降解产物包括+1产物(酸)和dppiv-裂解产物。具有+1质量的产物可由在谷氨酰胺的酰胺基团或在c末端的脱酰胺作用而产生。裂解产物由血浆中的蛋白酶dppiv的作用而产生。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被披露为在37℃下在血浆中24小时之后以高达30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的水平在血浆中保持稳定。在此披露了包含以下氨基酸序列的glp-1/胰高血糖素激动剂肽：hx2qgtftsdx10sx12x13lx15x16x17x18ax20x21fx23x24wlx27x28gx30；其中x2是g或s，x10是y或k，x12是k、e、r、或s，x13是k或y，x15是d或e。x16是s或g，x17是e、r、q、或k，x18是r、s、或a，x20是r、k、或q，x21是d或e，x23是v或i，x24是a或q，x27是e或v，x28是a或k，并且x30是g或r(seqidno:4)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是y或k，x12是k、e、r、或s，x13是k或y，x15是d，x16是s，x17是e、r、q、或k，x18是r、s、或a，x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是e或v，x28是a，并且x30是g(seqidno:5)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是y或k，x12是k、e、r、或s，x13是k或y，x15是d，x16是s，如果x17是e并且x18是r，或如果x17是r并且x18是s，则x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是e或v，x28是a，并且x30是g(分别为seqidno:6和seqidno.7)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是y，x12是k，x13是k，x15是d，x16是s，如果x17是e并且x18是r，或如果x17是r并且x18是s，则x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是v，x28是a，并且x30是g(分别为seqidno:8和seqidno:9)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是k，x12是k、e、r、或s，x13是y，x15是d，x16是s，如果x17是e并且x18是r，并且如果x17是r并且x18是s，则x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是e，x28是a，并且x30是g(分别为seqidno:10和seqidno:11)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是k，x12是e，x13是y，x15是d，x16是s，如果x17是e并且x18是r，或者如果x17是r并且x18是s，则x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是e，x28是a，并且x30是g(分别为seqidno:12和seqidno:13)。在某些实施例中提供了以上所示的分离肽，其中x2是s，x10是k，x12是r，x13是y，x15是d，x16是s，如果x17是e并且x18是r，或者如果x17是r并且x18是s，则x20是r，x21是d，x23是v，x24是a，x27是e，x28是a，并且x30是g(分别为seqidno:14和seqidno:15)。在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽包括，但不限于g730(seqidno:16)、g797(seqidno:17)、g849(seqidno:18)、g933(seqidno:19)、g865(seqidno:20)、g796(seqidno:21)、g812(seqidno:22)和g380(seqidno:23)。这些glp-1/胰高血糖素激动剂肽列在表1中：表1：glp-1/胰高血糖素肽序列k(ge-棕榈酰基)＝具有通过γ谷氨酸接头缀合到ε氮上的棕榈酰基团的赖氨酸。肽g797和g933两者都具有在位置12的谷氨酸残基，并且对胰高血糖素受体和glp-1受体两者都保持稳健的活性，如在实例2中所示。该相应的残基在毒蜥外泌肽(exendin-4)和胰高血糖素中是赖氨酸，而在glp-1中是丝氨酸。虽然这个残基被认为不与该受体接触，但是在电荷上从正到负的变化可改变邻近的环境。此外，g797、g849和g933具有在位置27处的谷氨酸残基。在毒蜥外泌肽4中的残基27是赖氨酸并且在glp1(缬氨酸)和胰高血糖素(甲硫氨酸)中是不带电的疏水残基。艾塞那肽的赖氨酸与glp1受体在残基glul27和glu24处发生静电相互作用(c.r.underwood(安德伍德)等人jbiolchem(《生物化学杂志》)285723-730(2010)；s.runge(伦格)等人，《生物化学杂志》28311340-11347(2008))。虽然当在位置27处的电荷被改变为负的时候可预期到glp1r效价的损失，但是这种改变与g797、g849、和g933中的glp1r活性相容。制造方法。本披露提供了制造glp-1/胰高血糖素激动剂肽的方法。可通过任何适合的方法制造在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。例如，在某些实施例中，通过本领域普通技术人员熟知的方法，例如通过如merrifield(梅里菲尔德)描述的固相合成(1963，j.am.chem.soc.(《美国化学学会杂志》)85:2149-2154)，化学合成在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。可以例如，通过使用自动合成仪，使用标准试剂完成固相肽合成，如在实例1中解释的。可替代地，可以使用如本领域普通技术人员熟知的合宜的载体/宿主细胞组合以重组方式产生在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。用于以重组方式产生glp-1/胰高血糖素激动剂肽的许多种方法是可得的。通常，将编码glp-1/胰高血糖素激动剂肽的多核苷酸序列插入适当的表达载体，例如，含有用于该插入的编码序列的转录和翻译的必需元件的载体。将编码glp-1/胰高血糖素激动剂肽的核酸插入载体的正确阅读框中。然后将该表达载体转染到适合的表达该glp-1/胰高血糖素激动剂肽的宿主细胞中。适合的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、或哺乳动物细胞。许多种可商购的宿主-表达载体系统可以用来表达在此所述的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。修饰、缀合、融合、和衍生。在某些实施例中，在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽经由氨基酸修饰而被稳定化。在某些实施例中，c末端氨基酸的羧基被酰胺化。在某些实施例中，该c末端氨基酸是酰胺化的甘氨酸，例如，g730、g797、g849、g865、g796、g812、和g380。在某些实施例中，例如，g933，该c末端甘氨酸是未修饰的酸。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽被提供为其中一个或多个氨基酸残基被酰化。例如，在某些实施例中，在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽含有一个或多个赖氨酸残基，其中棕榈酰部分被附接到n(ε)基团上。在某些实施例中，接头结合在赖氨酸与该棕榈酰基团之间。这个接头可以是γ谷氨酸基团，或为替代接头，例如但不限于，β丙氨酸和氨基己酸。可以使用不同的酰化方法，如添加胆固醇基或肉豆蔻酰基。在某些实施例中，该棕榈酰部分被添加在位置13(例如，g730)。在某些实施例中，该棕榈酰部分被添加在位置10(例如，g797、g849、g933、g865、g796、和g812)。在某些实施例中，该棕榈酰部分被添加在位置17(例如，g380)。在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽，例如，g730、g797、g849和g933可以被棕榈酰化，以便借助于与血清白蛋白结合而延长它们的半衰期，由此降低它们的肾脏清除倾向，如在实例1中所述。可替代地或另外地，如在此披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽可以与异源部分联合，以便例如延长半衰期。该异源部分是蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(peg)、生物素、白蛋白、人血清白蛋白(hsa)、hsafcrn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非fniii支架、表位标签(epitopetag)、重组多肽聚合物、细胞因子、或此类部分的两种或更多种的组合。例如，glp-1/胰高血糖素激动剂肽可与异源多肽融合。通过重组基因融合和表达或通过化学缀合，这些肽可融合到蛋白质上。适合于作为用于融合的伴侣的蛋白质包括但不限于，人血清白蛋白、抗体和包含到抗体的fc部分上的融合的抗体片段。glp-1融合到这些蛋白质上同时保留效价(l.baggio(巴乔)等人，diabetes(《糖尿病》)532492-2500(2004)；p.barrington(巴灵顿)等人diabetes，obesityandmetabolism(《糖尿病、肥胖症和代谢》)13426-433(2011)；p.paulik(波利克)等人americandiabetesassociation(《美国糖尿病协会》)2012，poster(波斯特)1946)。还已描述了延伸的重组肽序列以给出高分子量肽(v.schellenberger(舍伦贝格尔)等人naturebiotechnol(《自然生物技术》)271186-1190(2009)；pasylation(ep2173890))。在某些实施例中，glp-1/胰高血糖素激动剂肽与c末端的融合伴侣(例如白蛋白或fc部分)结合为融合蛋白的n末端部分。如在此所述的glp-1/胰高血糖素激动剂肽还可被融合到肽或蛋白质结构域上，例如对于人血清白蛋白具有亲和力的‘albudabs’(m.s.dennis(丹尼斯)等人，jbiolchem(《生物化学杂志》)27735035-35043(2002)；a.walker(沃克)等人，proteinengdesignselection(《蛋白质工程、设计与选择》)23271-278(2010))。用于将在此披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽与异源多肽例如白蛋白或fc部分融合的方法是本领域普通技术人员已知的。其他异源部分可以缀合到glp-1/胰高血糖素激动剂肽上以进一步稳定或增加半衰期。为了化学融合，某些实施例的特征为维持自由n末端，但是可以产生用于衍生的可替代点。另一种替代方法是用大的化学部分，例如高分子量聚乙二醇(peg)，来衍生这种肽。“聚乙二醇化glp-1/胰高血糖素激动剂肽”具有共价结合到其上的peg链。glp-1/胰高血糖素激动剂肽的衍生，例如，聚乙二醇化，可以在经棕榈酰化的赖氨酸上进行，或者替代地在被取代或通过延伸而被结合的残基(如半胱氨酸)上进行，以允许衍生。可以针对相对效价和在glp-1受体与胰高血糖素受体活化之间的平衡将以上glp-1/胰高血糖素激动剂肽形式进行体外和/或体内表征。通用术语“聚乙二醇链”或“peg链”指的是以通式h(och2ch2)noh表示的处于支链或直链形式的氧化乙烯和水的缩合聚合物的混合物，其中n是3、4、5、6、7、8、9、或更大的整数。peg链包括乙二醇的聚合物，具有选自大约500到大约40,000道尔顿范围的平均总分子量。peg链的平均分子量以数字指示，例如，peg-5,000指的是具有平均大约5,000的总分子量的聚乙二醇链。可以通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应来进行聚乙二醇化。参见，例如，focusongrowthfactors(《聚焦生长因子》)，3：4-10，1992和欧洲专利申请ep0154316和ep0401384。可以通过使用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。用于制备聚乙二醇化的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的方法通常包括以下步骤：(a)在分子藉此附接到一个或多个peg基团的条件下，使glp-1/胰高血糖素激动剂肽与聚乙二醇(如peg的反应性酯或醛衍生物)反应，和(b)获得一种或多种反应产物。药用组合物进一步提供了组合物，例如，含有有效量的如在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的药用组合物，其被配制为用于治疗代谢性疾病，例如，肥胖症。可以根据已知的方法配制本披露的组合物。适合的制备方法描述于，例如，remington’spharmaceuticalsciences(《雷明顿药物科学》)，第19次编辑，a.r.gennaro(真纳罗)编著，mackpublishingco.(马克出版公司)，easton(伊斯顿)，pa(1995)，将其通过引用以其全文结合在此。组合物可以处于多种形式，包括但不限于，水溶液、乳剂、凝胶剂、混悬剂、冻干形式、或本领域已知的任何其他形式。另外，该组合物可含有药学上可接受的添加剂，例如包括，稀释剂、粘合剂、稳定剂、和防腐剂。一旦配制，本发明的组合物即可以直接给予受试者。可以与本发明的组合物一起使用的载体是本领域熟知的，并且包括但不限于，例如甲状腺球蛋白、白蛋白(如人血清白蛋白)、破伤风类毒素、和聚氨基酸(如聚l-赖氨酸、聚l-谷氨酸)、流感病毒和乙肝病毒核心蛋白，等等。可以使用许多种水性载体，例如，水、缓冲水、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等等。可以通过常规的、熟知的灭菌技术将组合物灭菌，或者可以将其过滤灭菌。可将得到的组合物包装为原样使用、或冻干，该冻干制剂在给药之前与无菌溶液组合。根据需要，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如ph调节和缓冲剂、张力调节剂、湿润剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。治疗肥胖症的方法、模型系统。glp-1/胰高血糖素激动剂肽可将胰高血糖素的作用(例如，抑制进食或调节血糖水平)与glp-1的作用(例如，抑制胃动力、或促进胰岛素释放)结合。因此它们起作用而加速过多脂肪组织的消除，诱导可持续的体重减轻，并且改进血糖控制。glp-1/胰高血糖素激动剂肽还起作用而降低心血管危险因素，如高胆固醇、和高ldl胆固醇或异常hdl/ldl比率。本披露提供了治疗肥胖症或肥胖症相关疾病或失调的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予如在此披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。进一步提供了用于治疗肥胖症或肥胖症相关疾病或失调的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。进一步提供了如在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽在用于治疗肥胖症或肥胖症相关疾病或失调的药剂的制造中的用途。可以给予在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽用于预防体重增加，促进体重减轻，减少过多体重或治疗包括病态性肥胖在内的肥胖症(例如通过控制食欲、摄食、进食、热量摄取、和/或能量消耗)。另外，在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽可用于治疗其他肥胖相关代谢失调。其他肥胖相关代谢失调的实例包括但不限于：胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、糖尿病前期、空腹血糖增加、2型糖尿病、高血压、血脂异常(或这些代谢危险因素的组合)、胰高血糖素瘤、心血管疾病例如充血性心力衰竭、动脉硬化、动脉粥样硬化、冠心病、或外周动脉疾病；中风、呼吸功能障碍、或肾脏病。“治疗”是用于获得有益或所希望的临床结果的途径。如在此提供的，来自披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的有益或所希望的临床结果包括但不限于：体重下降、减少的体重增加、食欲降低、血清葡萄糖和血清胰岛素水平降低或稳定化；肥胖相关疾病的程度的改善、减轻、稳定、消弱；或肥胖相关疾病进展的延迟或减缓。在某些实施例中，“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些受试者包括已经患有失调的那些受试者以及有待预防失调的那些受试者。治疗意指当与不存在治疗相比较时抑制或减少肥胖相关症状(例如体重增加)的增加，而不一定意味着暗示相关病症的完全停止。在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的给药途径可以例如为口服、肠胃外、经由吸入或局部给药。如在此所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或经阴道给药。用于给药的形式的另一个实例是注射用溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽可以作为单剂量或作为多剂量给药。在某些实施例中，通过皮下注射给予glp-1/胰高血糖素激动剂肽。肠胃外配制品可以是单次推注剂量、输注剂量或负荷推注剂量随后是维持剂量。可以具体固定的或可变的间隔给予这些组合物，例如，每日一次，或以“在需要时”为基础。也可以调整剂量方案以便提供最佳期望反应(例如治疗性或预防性反应)。有待给予的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的量可以由本领域的普通技术人员容易地确定而不需要在此给出披露内容的过度实验。影响glp-1/胰高血糖素激动剂肽的给药方式和对应量的因素包括但不限于：疾病的严重性(例如，肥胖的程度)、受试者的病史、以及经历治疗的受试者的年龄、身高、体重、健康、和身体状况。类似地，有待给予的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的量将取决于给药方式以及该受试者将经历这种药剂的单剂量还是多剂量。在某些实施例中，可以经由注射每日一次给予在此提供的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。药盒在另外的其他实施例中，本披露提供了包含glp-1/胰高血糖素激动剂肽的药盒，这些药盒可用于进行在此所述的方法。在某些实施例中，药盒包含在一个或多个容器中的在此披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。本领域的技术人员将易于认识到，这些披露的glp-1/胰高血糖素激动剂肽可易于与本领域中熟知的已建立的药盒形式之一相结合。实例实例1：glp-1/胰高血糖素激动剂肽的合成、修饰、和表征缩写清单：boc：叔丁氧基羰基tert-bu：叔丁基dcm：二氯甲烷dic：二异丙基碳二亚胺fmoc：9-芴基甲氧基羰基hobt：1-羟基苯并三唑hplc：高效液相色谱法mtt：4-甲基三苯甲基nmp：n-甲基吡咯烷酮pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基tfa：三氟乙酸tis：三异丙基硅烷trt：三苯基甲基，三苯甲基glp-1/胰高血糖素激动剂肽合成如下。用preludetm固相肽合成仪(proteintechnologies(蛋白质技术有限公司)，tucson(图森)，az，usa)，在novasyntgr或预加载的fmoc-王树脂(fmoc-wangresin)(novabiochem)上进行肽链延长。应用制造商提供的方案将氨基酸的羟基苯并三唑酯偶联在n-甲基吡咯烷酮(nmp)中。芴基甲氧基羰基(fmoc)基团用于氨基酸的α-氨基基团的半永久性保护，而对于丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸的侧链用叔丁基(tert-bu)保护，并且对于精氨酸用2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)保护，对于组氨酸用三苯甲基(trt)保护。在位置1的组氨酸的n-末端氨基基团用叔丁氧基羰基基团(boc)保护。当需要侧链的后续化学修饰时，将lys(mtt)掺入肽链中。在完成肽链延长时，通过用含有2％tfa和5％tis(10x7ml，各0.5分钟)的dcm洗涤肽-树脂去除mtt基团。在preludetm肽合成仪上，使用dic作为偶联剂，在hobt存在下进行脂质部分到lys侧链上的偶联。使用tfa:tis:水(95:2.5:2.5)的混合物从该树脂上切割肽。在室温下2h之后，过滤该肽基树脂，用tfa洗涤，并且将合并的滤液在真空中蒸发至干燥。用醚研磨残留物，将形成的沉淀过滤，用醚洗涤，并干燥。将粗制的肽溶解于在水中的5％乙酸中，并且通过反相高压液相色谱法在附接到varian920-lc系统上的polaris3c8-a柱上进行分析。使用10％到90％缓冲液b的标准梯度系统经过15分钟的过程进行分析。缓冲液a为在水中的0.1％tfa，而缓冲液b为在乙腈中的0.1％tfa。记录在210nm处的hplc图谱。在具有半制备型c18rpxbridgewaters(沃特斯)柱的varianprostar系统上进行制备分离。使用水和乙腈的上述溶剂系统，处于30％到70％缓冲液b梯度经过30分钟过程，进行分离。通过电喷雾质谱法(masslynx，沃特斯公司)来分析在色谱分离上同质的产物(>97％纯度)。实例2：胰高血糖素和glp-1受体介导的camp产生的体外研究在基于细胞的camp活性测定(测定1)中的肽的生物活性：针对生物活性，测试了通过实例1的方法合成的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的生物活性，例如，通过以下方法刺激一种或多种细胞受体反应。通过标准方法在hek293s或cho细胞中产生表达人、小鼠、大鼠、或狗glp-1受体(glp-1r)、胰高血糖素受体(gcgr)或葡萄糖依赖性促胰岛素肽(抑胃肽)受体(gipr)的稳定细胞系。这些不同受体的肽活化导致下游的camp第二信使的产生，其可以在功能活性测定中测得。使用“测定培养基”进行camp测定：测定培养基：在dmem(吉布科公司(gibco)编号41966)中的10％fbs，含有0.5mmibmx(西格玛公司(sigma)编号17018)。使用低蛋白结合的384孔板(格瑞纳公司(greiner)编号781280)来进行制作在测定培养基中的测试样品的十一次1比5连续稀释。所有样品稀释度均制作一式两份。将表达感兴趣受体的细胞的冻结的冷冻小瓶在水浴中迅速解冻，转移到预加温的测定培养基中并且在240xg旋转离心5分钟。以优化的浓度将细胞重新悬浮在测定培养基中(例如hgcgr细胞为1x105个细胞/ml，hglp-1r和hgipr细胞为0.5x105个细胞/ml)。从稀释板上将5μl重复样品压印到黑色浅孔u型底部的384孔板(科明公司(coming)编号3676)上。为此，添加5μl细胞悬液，并且将这些板在室温下孵育30分钟。使用可商购的camp动态2htrf试剂盒(cisbio，目录号62am4pej)，遵循按照制造商的建议的两步方案测定camp水平。简要地说，通过将抗camp穴状化合物(供体荧光团)和camp-d2(受体荧光团)各1/20稀释于提供在该试剂盒中的缀合与裂解缓冲液中而单独地将它们制成。将5μl抗camp穴状化合物添加到测定板的所有孔中，并且将5μlcamp-d2添加到除了非特异性结合(nsb)孔之外的所有孔中，向其上添加缀合与裂解缓冲液。将这些板在室温下孵育一个小时，然后在envision读取器(perkinelmer(珀金埃尔默))上使用320nm的激发波长和620nm&665nm的发射波长进行读数。在“测定培养基”中进行的camp测定中确定的合成glp-1/胰高血糖素激动剂肽的序列和它们的ec50值显示在表2中。在表2中的所有肽是用c端酰胺合成的。另外的glp-1/胰高血糖素激动剂肽是用c端酸合成的，并且在“测定培养基”中进行的camp测定中确定的ec50值显示在表3中。在“测定培养基”中进行的另外的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的ec50显示在表4中。在表4中的所有肽具有c端酰胺，除非它们被表示为“酸”，在这种情况下它们具有c端酸。表2：具有c端酰胺的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的camp活性(测定1)表3：具有c端酸的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的camp活性(测定1)肽人glucrec50人glp1rec50人giprec50mmmg9311.78e-111.30e-100.00e+00g9335.92e-123.20e-119.70e-09g9346.30e-121.80e-113.60e-09g9738.90e-121.20e-114.70e-08表4：另外的glp-1/胰高血糖素激动剂肽的camp活性(测定1)缩写：k(ge-棕榈酰化)＝具有通过γ谷氨酸接头缀合到ε氮上的棕榈酰基团的赖氨酸；k(ahx-棕榈酰化)＝具有通过氨基已酸接头缀合到ε氮上的棕榈酰基团的赖氨酸；k(ba-棕榈酰化)＝具有通过β丙氨酸酸接头缀合到ε氮上的棕榈酰基团的赖氨酸；aib，氨基异丁酸。k(棕榈酰化)＝具有直接缀合到ε氮上的棕榈酰基团的赖氨酸。在血浆浓度的血清白蛋白存在下胰高血糖素和glp-1受体介导的camp产生测定(测定2)。在cho细胞中测得针对肽诱导camp产生的激动剂效价测定，所述cho细胞分别在如下4.4％、3.2％和3.2％的人、大鼠或小鼠血清白蛋白存在下表达人、大鼠或小鼠胰高血糖素受体(缩写为glucr或gcgr)或glp-1受体。将具有人、小鼠、或大鼠glucr或glp-1受体的稳定重组表达的cho细胞在dmem10％fbs和遗传霉素(100pg/ml)中培养。在lx细胞冷冻培养基-dmso无血清(西格玛奥德里奇公司)中以2x107/小瓶制备冷冻保存细胞母液并且在-80℃下保存。将细胞在37℃迅速解冻，并且然后稀释在含有血清白蛋白(对于人、大鼠、和小鼠血清白蛋白分别为4.4％、3.2％和3.2％)的测定缓冲液(dmem)中。将肽连续稀释在dmso中，然后按照规定的终浓度在含有血清白蛋白的dmem中稀释100倍。然后将稀释的肽转移到384黑色浅孔微量滴定测定板中。将细胞添加到测定板上并且在室温孵育30分钟。孵育之后停止测定，并且按照制造商的指南使用可获自cisbiobioassays公司的动力d2camp测定试剂盒测量camp水平。在珀金埃尔默的荧光读板仪上进行读数。人和大鼠血清白蛋白购自西格玛奥德里奇公司，而小鼠血清白蛋白购自equitech生物有限公司。如制造商的指南中所述将数据转化成％δf，并且通过4-参数逻辑拟合法进行分析以确定ec50值。针对选择的肽的测定2ec50值显示在表5中。确定的测定2ec50值取决于所测试的肽在重组细胞系中的glp1受体和胰高血糖素受体两者上的固有效价并且取决于所述肽对血清白蛋白的亲和力，该亲和力决定游离肽的量。与血清白蛋白的结合增加所获得的ec50值。可基于camp产生随着hsa浓度的变化来计算处于血浆浓度的白蛋白的游离肽的部分以及在0％hsa的ec50。例如，g730和g933分别产生针对在4.4％hsa处的游离肽的0.85％和0.29％的值、以及在0％hsa处的glp1r的7pm和6pm的ec50。例如，g797和g849分别产生针对在4.4％hsa处的游离肽的0.82％和0.48％的值、以及在0％hsa处的glp1r的7pm和2pm的ec50。为了比较在不同肽之间并且在经过不同的条件下在glp1r和glucr上的活性的平衡，可使用以下计算使这些活性相关联，其中ec50与天然配体的活性有关。表5：在血浆浓度的血清白蛋白存在下glp-1/胰高血糖素激动剂肽的ec50效价(测定2)1glucr/glp1r比率确定如下：相对效价glucr＝胰高血糖素的ec50/测试肽的ec50相对效价glp1r＝glp1的ec50/测试肽的ec50glucr/glp1r比率＝相对效价glucr/相对效价glp1r血浆中的肽的稳定性测试。肽g730、g797、g849和g933在血浆中的稳定性确定如下。通过称量固体肽到艾本德低结合管(eppendorflowbindtube)中并且溶解于dmso中，制备约200μmol/l的肽的储备溶液。将10μl储备溶液添加到在艾本德低结合管中的990μl血浆中，从而生成血浆中约2μmol/l的肽初始浓度。在添加到该储备溶液中之前，来自人、大鼠和小鼠的冰冻空白血浆已经解冻并加热到37℃的温度。将加标的血浆样品轻轻混合并且在开始实验之前允许平衡约5分钟。将血浆样品在galaxyrco2培养箱中在37℃孵育48小时。在0、1、2、6.5、17、24和48小时时取样(30μl)。将这些样品在-70℃下保存直到用于分析。血浆样品测定如下。30μl血浆样品为蛋白质，将其用180ml冷乙醇在96孔低结合板(艾本德lobind)中沉淀。在混合和离心之后，将100μl上清液转移到新的板上，将1μl注射到分析柱上。使用偶联到具有正电喷雾电离的中等高分辨率质谱仪(珀金埃尔默pentof)的plc-系统(lcexigentμlc)进行分析。该分析柱为5cm的1mm安捷伦poroshell(定制的)c18柱，粒径为2.7μm。流率：0.1ml/min，使用慢速反相梯度。使用的流动相为含有0.1％甲酸的乙腈和水。对以下降解产物以手工方式评估得到的数据：+1产物(酸)和dppiv裂解产物。具有+1质量的产物可由在谷氨酰胺的酰胺基团或在c末端的脱酰胺作用而产生。裂解产物由血浆中的蛋白酶dppiv的作用而产生。肽的降解和肽产物的形成均以初始肽浓度的百分比形式报告。进行峰积分并计算剩余肽的％：(峰面积/峰面积oh)*100。24h时间点的数据显示在表6中。对于g797和g933而言，脱酰胺作用和dppiv裂解的水平是低的。表6：血浆中的肽稳定性溶解度如下在ph范围为4.5到8.0内的许多缓冲液种类中评估了肽溶解度。将干燥粉末形式的glp-1/胰高血糖素激动剂肽在室温下在不同的缓冲液中重构。使用nanodrop2000分光光度计在280nm处测量吸光度，并且使用以下等式计算肽浓度：c＝(a280*mw)/ε其中c-浓度ε-消光系数mw-分子量a280-在280nm处的吸光度ε＝(1xtrp＝5560)+(1xtyr＝1200)结果显示在表7中。在一定的ph范围(6.5到8.5)中这些肽的每一种能以0.8mg/ml溶解。g730在4.5到8.0的ph范围可溶，g797在6.到8.0的ph范围可溶，并且g933在6到8.0的ph范围可溶。在许多不同的缓冲系统中测试g933的溶解度，这些缓冲系统也示于表7中。g933至少在以下缓冲系统中能以1mg/ml溶解：组氨酸(ph6和7；离子强度：0.25到100mm)、磷酸钠(ph6-7.5；离子强度：0.25到100mm)、和三羟甲基氨基甲烷(ph7-9；离子强度：0.25到100mm)。表7：肽溶解度概况(所有缓冲液的离子强度：100mm)配制品。在三种不同的等渗配制品中评估了肽溶解度：1.默认配制品(df)＝0.1mtrisph7.5，150mm甘露醇。最终配制品ph＝7.22.备用配制品1(bf1)＝0.05mtris，50mm精氨酸/脯氨酸。最终配制品ph＝8.03.备用配制品2(bf2)＝磷酸钠缓冲液(ph8)/1.85％w/v丙二醇。最终配制品ph＝7.0如上详述测量溶解度，并且将结果示于表8中。g730、g797和g933能以至少5mg/ml溶于df中，g849在df中的最大溶解度是3.7mg/ml，g797能以至少10mg/ml溶于bf1中，并且g933能以至少10mg/ml溶于bf2中。表8：在配制品中的肽溶解度通过a280nm测定的浓度在一个月内通过反相超高效液相色谱法(rpuplc)测量纯度来评估df的稳定性。储存条件为5℃、25℃、40℃和-80℃。结果显示在表9和10中。表9在稳定性条件下在1个月之后的肽配制品纯度表10：在稳定性条件下在1个月之后的肽配制品纯度的损失(与to比较的％)这些肽都显示出可接受的关于溶解度、可配制性和稳定性的特性。实例3：体内研究g730、g797、和g812(研究a)。如下在膳食诱导肥胖(dio)小鼠模型中测试了在此披露的选择的glp-1/胰高血糖素激动剂肽。使雌性c57/b16jhsd01a(从英国哈兰实验室(harlanlaboratories)获得)在9-11周龄时开始接受d12492高脂肪饮食(研究饮食公司(researchdiets)，新泽西州，美国)和巧克力甜点、德利卡托球(delicatoball)(delicatabakverk，瑞典)，并且在到达动物设施之前维持饮食持续16周，在三周适应期期间以及在药物治疗期间，将两种饮食成分的卡路里含量显示在表11中。将小鼠分成9个组(n＝5-6)，并且在29周龄开始治疗。这些治疗组和给药显示在表12中。表11：dio饮食的含量表12：用于研究a的治疗组将glp-1/胰高血糖素激动剂肽g730、g797、和g812、以及利拉鲁肽配制在载体100mmtris/150mm甘露醇中，ph7.4。治疗为皮下给药，每日两次，持续14天，同时这些动物维持高脂肪饮食。在整个给药期间每天监测这些动物的体重。在第14天，在4小时禁食期之后，从神志清醒的小鼠获得血样，用于测量血浆葡萄糖和胰岛素。然后使用异氟烷(isofluorane)将小鼠麻醉，从眼后的毛细血管床收集末梢血。测量以下参数：甘油三酯、总胆固醇、非酯化脂肪酸(nefa)、β-羟丁酸和成纤维细胞生长因子21(fgf21)的血液化学测量值(以下表14和15)。与利拉鲁肽和载体相比较，用利拉鲁肽和glp-1/胰高血糖素激动剂肽g730、g797和g812进行治疗对体重的影响显示于图1-4中。用g730或g797治疗的动物在14天的给药期间显示出剂量依赖性的且连续的体重减轻。在50nmol/kg时，用g730和g797治疗的动物相比于用载体治疗的动物在第14天经历了约24％的体重变化。用g730或g797治疗的小鼠在第14天显示出血糖水平的剂量依赖性降低(表13)。对于这两种治疗，尤其是在较高剂量时，还观察到降低的胰岛素水平(表13)。胰岛素敏感指数稳态模型评估(homa)在20nmol/kgg730以及20和50nmol/kgg797时得以显著改善。homa是使用血浆胰岛素和血糖水平的总和来评估β细胞功能和胰岛素抵抗的建模方法(表14)。总血浆胆固醇被所有剂量的利拉鲁肽、g730和g797降低，其中在血浆非酯化脂肪酸(nefa)水平以及血浆和肝脏甘油三酯(tg)方面的变化较不显著。β-羟丁酸(behy)具有朝向增加水平的趋势，与体重减轻一致。成纤维细胞生长因子21(fgf21)总体上随着双重glp-1/胰高血糖素激动剂肽治疗而增加。表13：glp-1/胰高血糖素激动剂肽治疗对葡萄糖、胰岛素、和homa的影响通过双尾分布、两样本不等方差检验评估结果；*指示与载体比较p<0.05。g865、g933、和g796(研究b)。在饮食诱导肥胖模型中，使用以上相同的方案，测试了另一组glp-1/胰高血糖素肽，但这些治疗组和给药显示在表15中：表15：用于研究b的治疗组肽剂量动物编号载体na6利拉鲁肽26.6nmol/kg6g8655nmol/kg6g86510nmol/kg6g9335nmol/kg6g93310nmol/kg6g79620nmol/kg6g79650nmol/kg6将glp-1/胰高血糖素激动剂肽g865、g933、和g796、以及利拉鲁肽配制在载体100mmtris/150mm甘露醇中，ph7.4。治疗为皮下给药，每日两次，持续14天，同时这些动物维持高脂肪饮食。在整个给药期间每天监测这些动物的体重。在第14天，在4小时禁食期之后，从神志清醒的小鼠获得血样，用于测量血浆葡萄糖和胰岛素。然后使用异氟烷(isofluorane)将小鼠麻醉，从眼后的毛细血管床收集末梢血。测量以下参数：甘油三酯、总胆固醇、非酯化脂肪酸(nefa)、β-羟丁酸和成纤维细胞生长因子21(fgf21)的血液化学测量值(以下表16和17)。与利拉鲁肽和载体相比较，用利拉鲁肽和glp-1/胰高血糖素激动剂肽g933、g865、g796进行治疗对体重的影响显示于图5-8中。用g933、g865或g796治疗的动物在14天的给药期间显示出剂量依赖性的且连续的体重减轻。在治疗后第14天的葡萄糖水平、胰岛素水平和homa显示在表16中。在治疗后第14天的总血浆胆固醇水平、血浆非酯化脂肪酸(nefa)水平、血浆和肝脏甘油三酯(tg)水平、β-羟丁酸(behy)水平、和成纤维细胞生长因子21(fgf21)水平显示在表17中。表16：glp-1/胰高血糖素激动剂肽治疗对葡萄糖、胰岛素、和homa的影响通过双尾分布、两样本不等方差检验评估结果；*指示与载体比较p<0.05。表17：glp-1/胰高血糖素激动剂肽治疗对另外的血液化学测量值的影响通过双尾分布、两样本不等方差检验评估结果；*指示与载体比较p<0.05。***本披露在范围上不受所描述的具体实施例的限制，这些实施例旨在作为本披露的单独方面的简单说明，并且在功能上等效的任何组合物或方法均处于本披露的范围内。事实上，除了在此示出并且描述的那些，本披露的各种改变从前述说明书和附图对于本领域技术人员来说将变得清楚。这类改变旨在落入所附权利要求书的范围内。本说明书提到的所有公开和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。序列表<110>米迪缪尼有限公司（medimmunelimited）<120>用于治疗肥胖症的胰高血糖素/glp-1激动剂<130>glpgg-100wo1<140>待定<141>2013-12-10<150>61/735,823<151>2012-12-11<160>26<170>patentin版本3.5<210>1<211>29<212>prt<213>智人<400>1hisserglnglythrphethrserasptyrserlystyrleuaspser151015argargalaglnaspphevalglntrpleumetasnthr2025<210>2<211>30<212>prt<213>智人<400>2hisalagluglythrphethrseraspvalsersertyrleuglugly151015glnalaalalysglupheilealatrpleuvallysglyarg202530<210>3<211>31<212>prt<213>智人<400>3hisalagluglythrphethrseraspvalsersertyrleuglugly151015glnalaalalysglupheilealatrpleuvallysglyarggly202530<210>4<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(2)..(2)<223>xaa是gly或ser<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(10)..(10)<223>xaa是tyr或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、arg、或ser<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(13)..(13)<223>xaa是lys或tyr<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(15)..(15)<223>xaa是asp或glu<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(16)..(16)<223>xaa是ser或gly<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(17)..(17)<223>xaa是glu、arg、gln、或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(18)..(18)<223>xaa是arg、ser、或ala<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(20)..(20)<223>xaa是arg、lys、或gln<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(21)..(21)<223>xaa是asp或glu<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(23)..(23)<223>xaa是val或ile<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(24)..(24)<223>xaa是ala或gln<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(27)..(27)<223>xaa是glu或val<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(28)..(28)<223>xaa是ala或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(30)..(30)<223>xaa是gly或arg<400>4hisxaaglnglythrphethrseraspxaaserxaaxaaleuxaaxaa151015xaaxaaalaxaaxaaphexaaxaatrpleuxaaxaaglyxaa202530<210>5<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(10)..(10)<223>xaa是tyr或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、arg、或ser<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(13)..(13)<223>xaa是lys或tyr<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(17)..(17)<223>xaa是glu、arg、gln、或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(18)..(18)<223>xaa是arg、ser、或ala<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(27)..(27)<223>xaa是glu或val<400>5hisserglnglythrphethrseraspxaaserxaaxaaleuaspser151015xaaxaaalaargaspphevalalatrpleuxaaalaglygly202530<210>6<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(10)..(10)<223>xaa是tyr或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、arg、或ser<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(13)..(13)<223>xaa是lys或tyr<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(27)..(27)<223>xaa是glu或val<400>6hisserglnglythrphethrseraspxaaserxaaxaaleuaspser151015gluargalaargaspphevalalatrpleuxaaalaglygly202530<210>7<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(10)..(10)<223>xaa是tyr或lys<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、arg、或ser<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(13)..(13)<223>xaa是lys或tyr<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(27)..(27)<223>xaa是glu或val<400>7hisserglnglythrphethrseraspxaaserxaaxaaleuaspser151015argseralaargaspphevalalatrpleuxaaalaglygly202530<210>8<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<400>8hisserglnglythrphethrserasptyrserlyslysleuaspser151015gluargalaargaspphevalalatrpleuvalalaglygly202530<210>9<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<400>9hisserglnglythrphethrserasptyrserlyslysleuaspser151015argseralaargaspphevalalatrpleuvalalaglygly202530<210>10<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、或arg<400>10hisserglnglythrphethrserasplysserxaatyrleuaspser151015gluargalaargaspphevalalatrpleuglualaglygly202530<210>11<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>嵌合glp-1/胰高血糖素肽<220><221>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域<222>(12)..(12)<223>xaa是lys、glu、arg、或ser<400>11hisserglnglythrphethrserasplysserxaatyrleuaspser151015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