一种提取多糖多酚植物总RNA的方法与流程

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种提取多糖多酚植物总rna的方法。

背景技术：

rna是基因表达过程中非常重要的生物分子，对其分离纯化是研究基因功能的重要基础之一。高质量的rna对于后续文库构建、rna-seq以及其他的分子生物学分析极其重要。而对于大多数植物组织来说，抽提高质量的rna显得尤为重要，因为绝大多数植物材料富含多糖、多酚、蛋白质以及次级代谢产物。多酚类物质在研磨过程中很容易被氧化，并能结合蛋白质和核酸形成大分子物质；在提取过程中，多糖和多酚类物质可能会导致rna降解，干扰后续的实验应用，而普通的trizol法提取植物总rna的方法不能去除植物中的糖类和酚类。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种提取多糖多酚植物总rna的方法，用针对多糖多酚植物的裂解液代替trizol溶液对植物组织进行裂解，并加入水饱和酚减少dna的混入，同时加入β-巯基乙醇降低氧对细胞产生的氧化损伤。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种提取多糖多酚植物总rna的方法，包括如下步骤：

s1、取适量组织样品用液氮充分研磨3～5次后，取200mg磨碎的组织样品置于2mlep管中，加入1ml多糖多酚植物专用裂解液和50µl的β-巯基乙醇，立即漩涡震荡混匀,室温静置15min，使其充分裂解后，4℃，12000r/min离心10min；

s2、吸取上清液转移至新的2mlep管中，冰上操作，加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液（氯仿：水饱和酚=1:1），轻微震荡混匀，室温静置分层5min后，4℃，12000r/min离心10min；

s3、吸取上清液转移至新的2mlep管中，冰上操作，加入200µl氯仿，轻微震荡混匀，室温静置分层，然后4℃，12000r/min离心10min。

s4、吸取上清液转移至新的1.5mlep管中，冰上操作，加入等体积的预冷至-20℃的无水乙醇，-80℃，静置30min，让rna充分析出后，4℃，12000r/min离心10min；

s5、弃上清，加入1ml75%的乙醇，温和震荡洗涤5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s6、弃上清，加入1ml无水乙醇，温和震荡洗涤5min后，4℃，12000r/min离心5min，弃上清，风干处理20-30min；

s7、加入由10µldnase和70µlrdd缓冲液混合而成的混合液，混匀，室温静置约15min；

s8、加入200µlrnase-free水，混匀，再加入100µl氯仿，轻轻混匀，室温静置至分层；4℃，12000r/min离心10min；

s9、吸取上清液转移至新的1.5mlep管中，冰上操作，加入1ml预冷至-20℃的无水乙醇，-80℃，静置30min后，4℃，12000r/min离心10min；

s10、弃上清，加入1ml75%乙醇，温和震荡洗涤5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s11、弃上清，加入1ml无水乙醇，温和震荡洗涤5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s12、弃上清，室温风干，加入20-50µlrnase-free水进行溶解，即得总rna，-80℃存放。

本发明具有以下有益效果：

有效避免了植物中糖类和酚类对总rna的降解，同时能够完全清除rna中混有的蛋白质和dna。本方法所提取的总rna可以满足对microrna以及其靶基因的研究。

附图说明

图1为用trizol法提取的多糖多酚类植物的rna琼脂糖胶图。

图2为采用本发明实施例的方法所提取的总rna琼脂糖胶图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

一种提取多糖多酚植物总rna的方法，包括如下步骤：

s1、取适量组织样品用液氮充分研磨3～5次后，取约200mg磨碎的组织样品置于2mlep管中，加入1ml多糖多酚植物专用裂解液和50µlβ-巯基乙醇，立即漩涡震荡混匀,室温静置15min，使其充分裂解后，4℃，12000r/min离心10min；

s2、吸取上清液（约900µl）转移至新的2mlep管中，冰上操作，加入等体积氯仿和水饱和酚的混合液（氯仿：水饱和酚=1:1），轻微震荡混匀，室温静置分层5min后，4℃，12000r/min离心10min；

s3、吸取上清液（约800µl）转移至新的2mlep管中，冰上操作，加入200µl氯仿，轻微震荡混匀，室温静置分层，然后4℃，12000r/min离心10min。

s4、吸取上清液（约700µl）转移至新的1.5mlep管中，冰上操作，加入等体积的预冷至-20℃的无水乙醇，-80℃，静置30min～2h，让rna充分析出后，4℃，12000r/min离心10min；

s5、弃上清，加入1ml75%的乙醇，温和震荡洗涤约5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s6、弃上清，加入1ml无水乙醇，温和震荡洗涤约5min后，4℃，12000r/min离心5min，弃上清，风干处理约20-30min；

s7、加入由10µldnase和70µlrdd缓冲液混合而成的混合液，混匀，室温静置约15min，如果室温温度较低，适当增加混合液的体积，此步骤是为了去除rna中的dna；

s8、加入200µlrnase-free水，混匀，再加入100µl氯仿，轻轻混匀，室温静置至分层；此步骤是为了去除rna中的dnase；

s9、吸取上清液转移至新的1.5mlep管中，冰上操作，加入1ml预冷至-20℃的无水乙醇，-80℃，静置30min后，4℃，12000r/min离心10min；

s10、弃上清，加入1ml75%乙醇，温和震荡洗涤约5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s11、弃上清，加入1ml无水乙醇，温和震荡洗涤约5min后，4℃，12000r/min离心5min；

s12、弃上清，室温风干，加入20-50µlrnase-free水进行溶解，即得总rna，-80℃存放。

对比例

1.将组织样品直接放入无rnase研体中，加入少量液氮，迅速研磨，如此反复3-5次后，取50-100mg组织转移入离心管，加入1mltrizol溶液用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟，室温放置15min，使其充分裂解；

2.12000rpm离心10min，弃沉淀，加入200ul氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min，4℃，12000g离心15min；

3.吸取上层水相至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置5-10min，4℃12000g离心10min，弃上清，rna沉于管底；

4.加入1ml75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃8000g离心5min，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10min。注：rna样品不要过于干燥，否则很难溶解。5.可用50ulh2o，tebuffer或0.5%sds溶解rna样品，55-60℃，5-10min。注：h2o、te或0.5%sds均须用depc处理并高压。

在提取的rna中，如果18s的条带亮度弱于28s的条带，说明所提取的rna比较完整，没有降解。如图1所示，是用trizol法提取的多糖多酚类植物的rna琼脂糖胶图，从图中可以看出18s条带亮于28s条带，rna降解比较厉害。而且，rna中残留的dna和蛋白质较多。如图2所示，为本实施例所提取的总rna琼脂糖胶图，从图中可以看出，所提取的rna基本上没有降解，而且没有dna和蛋白质的残留。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。