本发明涉及一种沙眼衣原体双重qpcr方法，尤其涉及一种快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法及引物和探针。
背景技术：
沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis,ct)是一种专性胞内寄生病原，不同的血清型可以造成不同的疾病和并发症，包括生殖道感染(血清型d-k)，沙眼(血清型a-c)和性病淋巴肉芽肿(血清型l1-l3)[1-3]。作为最常见的性传播病原，沙眼衣原体可以引起严重的盆腔炎、异位妊娠和输卵管性不孕[4]，给家庭和社会带来巨大的压力和医疗消耗。每年全球范围内新增沙眼衣原体泌尿生殖道感染病例约9200万例，大约50％的男性感染者和70％的女性感染者不表现出临床症状，造成大量的沙眼衣原体感染者得不及时诊断和正规治疗[5]，从而成为传染源继续传播疾病。
细胞培养因其良好的特异性而被认为是沙眼衣原体检测的金标准[6]。但由于其成本高、耗时长、技术难度大、灵敏度低，已不再作为沙眼衣原体的常规检测手段[7]。目前许多替代的血清学技术，如酶联免疫吸附试验(elisa)和免疫胶体金技术(icgt)可以大大缩短检测时间，但不适用于诊断急性ct感染[8]。核酸扩增试验(naats)以其高灵敏度、高特异性和快速的特点成为临床微生物实验室最推荐的沙眼衣原体感染诊断方法[9,10]。事实上，实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qpcr)和多重qpcr(multiplexqpcr)等现代pcr技术的出现可以将报告时间缩短至2小时内[11,12]。然而，真正可以用于沙眼衣原体检测的具有高灵敏度和高特异性的qpcr方法仍然缺乏，这造成了沙眼衣原体感染的漏诊和误诊。
技术实现要素：
本发明目的在于解决沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis,ct)是一种专性胞内寄生病原，不同的血清型可以造成不同的疾病和并发症，包括生殖道感染(血清型d-k)，沙眼(血清型a-c)和性病淋巴肉芽肿(血清型l1-l3)[1-3]。作为最常见的性传播病原，沙眼衣原体可以引起严重的盆腔炎、异位妊娠和输卵管性不孕[4]，给家庭和社会带来巨大的压力和医疗消耗，在精准医学日益发展的当下，现有发明或试剂已无法满足需求而提供的一种能实现精准诊断并适合我国人群的快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法及引物和探针。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法，包括如下步骤：
(1)前期准备程序：
研究样本：随机留取性传播疾病患者的泌尿生殖道标本若干份，包括男性尿道拭子若干份、女性宫颈内拭子和阴道拭子若干份，用于方法评价。
仪器与试剂：
①核酸提取仪(expure20)及其配套磁珠法提取纯化试剂；
②荧光定量pcr仪(lightcycler480)；多重荧光定量pcr体系(platinumtmmultiplexpcrmastermix)；
③pcr产物测序；
(2)核酸提取与纯化：
①原始样本核酸提取：用生殖道样本核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取操作严格按照仪器及配套试剂sop进行；
②提取纯化后的核酸模板吸入无dna酶ep管，存储于-86℃冻存备用。
(3)引物/探针设计、合成、标记，从ncbi数据库，分别下载已公布的沙眼衣原体血清型d-k菌株隐性质粒和23srrna基因序列，用dnaman进行序列比对，避开变异区或突变点后，分别设计各基因的引物和探针合成及标记表为：
(4)qpcr扩增及结果判断：
①多重qpcr体系：2×platinumtmmultiplexpcrmix25.0μl、50μm的正反引物各0.3μl、10μm的探针各0.5μl、模板20.0μl，补水至终体积50.0μl；
②扩增参数：95℃2.5min+(95℃10s+60℃30s)×45，选择510nm和580nm通道于60℃探测荧光；
③鉴定结果判断：鉴定标志物的扩增曲线呈“s”形，ct值＜37判为阳性；扩增曲线呈“s”形，37≤ct值＜40则再进行两次重复检测，若扩增曲线仍然为“s”形，ct值仍然＜40，也判为阳性；否则判为阴性；
④在多重qpcr反应中，两个鉴定标志物中的任意一个或两个均为阳性结果时，该样本判为阳性样本；
(5)检测下限及扩增线性范围试验：
①将浓缩后的高浓度沙眼衣原体核酸模板用超纯水进行10倍梯度稀释，制成浓度为1.0×102-1.0×108copies/ml的梯度浓度模板，用于pcr扩增；以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以线性关系良好的最低和最大浓度作为扩增线性范围；
(6)诊断灵敏度、特异性计算：
①原始样本鉴定结果判断：多重qpcr法与单重商业化试剂盒均阳性，则判为真阳性；多重qpcr法阳性，单重商业化试剂盒阴性，经扩增产物一代测序，与标株同源性≥90％；也判为真阳性；否则，判为假阳性；
②多重qpcr法阴性，单重商业化试剂盒阴性，则判为真阴性；多重qpcr法阴性，单重商业化试剂盒阳性，经扩增产物测序，与标株同源性≥90％，判为假阴性；否则，也判为真阴性；
③诊断灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性数)×100％；诊断特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性数)×100％；
(7)统计方法：对所有数据用spss进行学生t检验分析，p<0.05为有统计学差异，p<0.01为有显著统计学差异。
进一步地，沙眼衣原体crypticplasmid和23srrna基因检测引物与探针的序列与标记表为：
进一步地，同时检测沙眼衣原体隐性质粒的nt：1755-1880片段和23srrna基因的nt：51-169片段，所用引物和探针是经过我国流行分布株筛选后确定，避开变异区或突变点设计而成。
进一步地，快速检测沙眼衣原体双重qpcr试剂：
(1)多重qpcr体系：2×platinumtmmultiplexpcrmix25.0μl、50μm的正反引物各0.3μl、10μm的探针各0.5μl、模板20.0μl，补水至终体积50.0μl；
(2)扩增参数：95℃2.5min+(95℃10s+60℃30s)×45，选择510nm和580nm通道于60℃探测荧光。
进一步地，快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法，鉴定结果判断方法为：
(1)鉴定标志物的扩增曲线呈“s”形，ct值＜37判为阳性；扩增曲线呈“s”形，37≤ct值＜40则再进行两次重复检测，若扩增曲线仍然为“s”形，ct值仍然＜40，也判为阳性；否则判为阴性；
在多重qpcr反应中，两个鉴定标志物中的任意一个为阳性结果以及两个均为阳性结果时，该样本判为阳性样本。
进一步地，研究样本：随机留取性传播疾病患者的泌尿生殖道标本共1284份，包括男性尿道拭子236份、女性宫颈内拭子和阴道拭子共1048份，用于方法评价。
本发明的有益效果在于：
(1)检测下限低至2copies/pcr，扩增线性范围均达到1.0×102-1.0×108copies/ml，对沙眼衣原体的诊断灵敏度和特异性分别为100.0％(134/134)，99.3％(1142/1150)，从样品处理到报告结果≤2.0小时；
(2)本方法专利简便、快速、灵敏度高、特异性好，不仅可提高沙眼衣原体感染的诊断能力，还可实现快速检测，为尽早精准治疗赢得时间。
【附图说明】
图1为本发明crypticplasmid引物、探针检测沙眼衣原体梯度模板结果图；
图2为本发明23srrna引物、探针检测沙眼衣原体梯度模板结果图；
图3为本发明134个多重qpcr阳性样本的ct值分布图；
【具体实施方式】
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步描述：
如图1、图2、图3所示，一种快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法，包括如下步骤：
(1)前期准备程序：
研究样本：随机留取性传播疾病患者的泌尿生殖道标本若干份，包括男性尿道拭子若干份、女性宫颈内拭子和阴道拭子若干份，用于方法评价。
仪器与试剂：
①核酸提取仪(expure20)及其配套磁珠法提取纯化试剂；
②荧光定量pcr仪(lightcycler480)；多重荧光定量pcr体系(platinumtmmultiplexpcrmastermix)；
③pcr产物测序；
(2)核酸提取与纯化：
①原始样本核酸提取：用生殖道样本核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取操作严格按照仪器及配套试剂sop进行；
②提取纯化后的核酸模板吸入无dna酶ep管，存储于-86℃冻存备用。
(3)引物/探针设计、合成、标记，从ncbi数据库，分别下载已公布的沙眼衣原体血清型d-k菌株隐性质粒和23srrna基因序列，用dnaman进行序列比对，用primer5软件，避开变异区或突变点后，分别设计各基因的引物和探针合成及标记表为：
(4)qpcr扩增及结果判断：
①多重qpcr体系：2×platinumtmmultiplexpcrmix25.0μl、50μm的正反引物各0.3μl、10μm的探针各0.5μl、模板20.0μl，补水至终体积50.0μl；
②扩增参数：95℃2.5min+(95℃10s+60℃30s)×45，选择510nm和580nm通道于60℃探测荧光；
③鉴定结果判断：鉴定标志物的扩增曲线呈“s”形，ct值＜37判为阳性；扩增曲线呈“s”形，37≤ct值＜40则再进行两次重复检测，若扩增曲线仍然为“s”形，ct值仍然＜40，也判为阳性；否则判为阴性；
④在多重qpcr反应中，两个鉴定标志物中的任意一个或两个均为阳性结果时，该样本判为阳性样本；
(5)检测下限及扩增线性范围试验：
①将浓缩后的高浓度沙眼衣原体核酸模板用超纯水进行10倍梯度稀释，制成浓度为1.0×102-1.0×108copies/ml的梯度浓度模板，用于pcr扩增；以能判阳的最低加入模板数作为检测下限；以线性关系良好的最低和最大浓度作为扩增线性范围；
(6)诊断灵敏度、特异性计算：
①原始样本鉴定结果判断：多重qpcr法与单重商业化试剂盒均阳性，则判为真阳性；多重qpcr法阳性，单重商业化试剂盒阴性，经扩增产物一代测序，与标株同源性≥90％；也判为真阳性；否则，判为假阳性；
②多重qpcr法阴性，单重商业化试剂盒阴性，则判为真阴性；多重qpcr法阴性，单重商业化试剂盒阳性，经扩增产物测序，与标株同源性≥90％，判为假阴性；否则，也判为真阴性；
③诊断灵敏度＝真阳性数÷(真阳性数+假阴性数)×100％；诊断特异性＝真阴性数÷(真阴性数+假阳性数)×100％；
(7)统计方法：对所有数据用spss进行学生t检验分析，p<0.05为有统计学差异，p<0.01为有显著统计学差异。
优选地，沙眼衣原体crypticplasmid和23srrna基因检测引物与探针的序列与标记表为：
优选地，同时检测沙眼衣原体隐性质粒的nt：1755-1880片段和23srrna基因的nt：51-169片段，所用引物和探针是经过我国流行分布株筛选后确定，避开变异区或突变点设计而成。
优选地，快速检测沙眼衣原体双重qpcr试剂：
(1)多重qpcr体系：2×platinumtmmultiplexpcrmix25.0μl、50μm的正反引物各0.3μl、10μm的探针各0.5μl、模板20.0μl，补水至终体积50.0μl；
(2)扩增参数：95℃2.5min+(95℃10s+60℃30s)×45，选择510nm和580nm通道于60℃探测荧光。
优选地，快速检测沙眼衣原体双重qpcr方法，鉴定结果判断方法为：
(2)鉴定标志物的扩增曲线呈“s”形，ct值＜37判为阳性；扩增曲线呈“s”形，37≤ct值＜40则再进行两次重复检测，若扩增曲线仍然为“s”形，ct值仍然＜40，也判为阳性；否则判为阴性；
在多重qpcr反应中，两个鉴定标志物中的任意一个为阳性结果以及两个均为阳性结果时，该样本判为阳性样本。
优选地，研究样本：随机留取性传播疾病患者的泌尿生殖道标本共1284份，包括男性尿道拭子236份、女性宫颈内拭子和阴道拭子共1048份，用于方法评价。
如图3中每个点代表一个样本；当ct值＝45表示检测该样本的该片段时曲线没有起跳，该片段检测结果为阴性；在多重qpcr反应中，两个鉴定标志物中的任意一个为阳性结果以及两个均为阳性结果时，该样本判为阳性样本。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。