一种真菌病毒快速检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种真菌病毒快速检测方法。

背景技术：

真菌病毒广泛存在于病原真菌中，大多呈现无症状的潜伏侵染不引起寄主表型变化。有的真菌病毒对寄主真菌产生有益的作用，如引起寄主致病力增强或增强寄主真菌寄和植物的耐热性。少数真菌病毒能引起寄主表型变化，包括引起寄主致病力衰退等。弱毒相关真菌病毒可作为潜在的生防因子用于植物真菌性病害防治。同时，真菌病毒与寄主真菌的互作系统对了解病毒和真菌致病性提供了一个良好的模型和工具。除此之外，自然界中存在丰富的真菌病毒资源，大部分的真菌病毒具有多样性的分子特性和生物学特征。所以研究真菌病毒有助于提高对整个病毒进化和生态的了解，对推动病毒学的发展具有重要的意义。

在研究真菌病毒对寄主的影响时需要进行病毒消除，一般采用原生质体再生后挑取单孢，再对单孢生长的菌落进行检测。在研究病毒通过孢子在后代传递效率时，要挑取单孢后进行病毒检测。又比如在蘑菇种植中，也需要对蘑菇中病毒进行检测，挑取无毒的菌株。由于传统的病毒检测涉及到dsrna的提取，或者采用试剂盒提取总rna后进行rt-pcr检测。但该类方法通常需要较多的菌丝，总rna提取步骤多，耗时长，成本高工作量大。因此有必要建立一种更加快速、方便准确地检测真菌中病毒的方法。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种真菌病毒快速检测方法，通过直接挑取培养的真菌菌丝简易提取总rna后，利用病毒特异性引物进行rt-pcr检测，为真菌病毒研究和菇类种植中减少病毒危害提供重要方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种真菌病毒快速检测方法，包括以下步骤：

(1)提取真菌总rna：取0.1g真菌菌丝于1.5ml离心管中，加入100ul1×te溶液，用无菌枪头捣碎，12000g离心5min，吸取上清即得；

(2)以所述真菌总rna为模板，用primerpremier5.0软件设计待检测病毒特异性引物，进行rt-pcr，rt-pcr的反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

(3)取扩增产物进行电泳鉴定：取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的真菌病毒快速检测方法结合了真菌总rna简易提取和rt-pcr检测方法，需要的菌丝量少，真菌总rna提取的步骤简单，可适应于大量菌株的直接检测，除了快速、准确和灵敏外，还降低了成本，减少了工作时间。对真菌病毒脱毒技术的建立、病毒研究和菇类生产中无毒品种培育等都具有较大的应用价值。

附图说明

图1为本发明中对病毒capv1进行rt-pcr检测结果。marker(5kbp)，泳道1和2分别为带毒尖孢炭疽病菌菌株和无毒尖孢炭疽病菌菌株。

图2为本发明中对病毒mocv1-b的rt-pcr检测结果。marker(5kbp)，泳道1和2分别为带毒稻瘟病菌菌株和无毒稻瘟病菌菌株。

图3为本发明中对病毒norv2的rt-pcr检测结果。marker(5kbp)，泳道1和2分别为带毒稻黑孢菌株和无毒稻黑孢菌株。

图4为本发明中对病毒abfv1的rt-pcr检测结果。marker(5kbp)，泳道1和2分别为含abfv1的芸苔生链格孢菌株和无毒菌株。

图5为本发明中对病毒cgcv1的rt-pcr检测结果。marker(5kbp)，泳道1和2分别为含cgcv1的胶孢炭疽病菌株和无毒菌株。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中使用的已知的真菌病毒carv1、mocv1-b、norv2、abfv1和cgcv1的序列可于美国国立生物技术信息中心(ncbi)检索得到。

实施例1真菌中总rna简易提取

刮取培养皿0.1g菌丝于1.5ml的离心管中，加入100ul的1×te溶液后，用枪头捣碎，12000g离心5min，取上清液。

实例2真菌中病毒rt-pcr检测

根据尖孢炭疽病菌中已知真菌病毒colletotrichumacutatumrnavirus1(carv1)(kc572132.1)序列用primer5设计特异性引物，引物为

carv1-f:5’-tcttcaggatacccgcactac-3’

carv1-r:5’-gatcacgtaaatcatcgagcc-3’

该引物预期扩增产物大小为496bp。

用上述引物对提取的总rna进行rt-pcr扩增。反转录反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

将扩增产物进行检测，取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带，如图1所示。对pcr产物进行测序，结果序列用blast比对，确实为已知病毒carv1。

实施例3

根据稻瘟病菌中对已知真菌病毒magnaportheoryzaechrysovirus1-b(mocv1-b)序列用primer5设计特异性引物，引物为

mocv1-b-f:5’-gtcaacattggcggcacg-3’

mocv1-b-r:5’-gcatcgctttccaaccaca-3’

该引物预期扩增产物大小为507bp。

用上述引物对提取的总rna进行rt-pcr扩增。反转录反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

将扩增产物进行检测，取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带，如图2所示。对pcr产物进行测序，结果序列用blast比对，确实为已知病毒mocv1-b。

实施例4

根据稻黑孢中对已知真菌病毒nigrosporaoryzaevictorivirus2(norv2)序列用primer5设计特异性引物，引物为

norv2-f:5’-gaccctaacaccattatccacc-3’

norv2-r:5’-gcggcaccaccacctatt-3’

该引物预期扩增产物大小为635bp。

用上述引物对提取的总rna进行rt-pcr扩增。反转录反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

将扩增产物进行检测，取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带，如图3所示。对pcr产物进行测序，结果序列用blast比对，确实为已知病毒norv2。

实施例5

根据芸苔生链格孢中对已知真菌病毒alternariabrassicicolafusarivirus1(abfv1)序列用primer5设计特异性引物，引物为

abfv1-f:5’-tgaccctgggaatgctgtg-3’

abfv1-r:5’-ccgtcacaggttcttccac-3’

该引物预期扩增产物大小为510bp。

用上述引物对提取的总rna进行rt-pcr扩增。反转录反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

将扩增产物进行检测，取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带，如图4所示。对pcr产物进行测序，结果序列用blast比对，确实为已知病毒abfv1。

实施例6

根据尖孢炭疽病菌中已知真菌病毒colletotrichumgloeosprioideschrysovirus1(cgcv1)序列用primer5设计特异性引物，引物为

cgcv1-f:5’-aacatgagggcttctattggc-3’

cgcv1-r:5’-catcgttgtaagacttgtggtct-3’

该引物预期扩增产物大小为454bp。

用上述引物对提取的总rna进行rt-pcr扩增。反转录反应体系和条件为：总rna5ul，随机引物3ul与dmso2ul加入depc处理过的0.5ml离心管中，于99℃水浴3min，迅速置于液氮中lmin，后移置冰上；再依次加入，5×rtbuffer4ul，dntp2u1，dtt2ul，rnaseinhibitor1ul，superscripttmiirnaseh-reversetranscriptase1ul，42℃反应1h；

取合成的cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增。pcr反应体系和条件包括：ddh2o34.5ul，10×pcrbuffer5ul，dntpmixture(2.5mm)6ul，primers(20mm)2ul，cdna2ul，lataqtm0.5ul。扩增条件为：94℃1min后，94℃10sec，56℃10sec，72℃40s，共35循环，然后72℃延伸5min。

将扩增产物进行检测，取5ul的pcr产物，1％琼脂糖电泳检测扩增结果，含有病毒的菌株出现与预期大小相符的条带，无病毒对照菌株中无扩增条带，如图5所示。对pcr产物进行测序，结果序列用blast比对，确实为已知病毒cgcv1。

以上实施例说明，利用本发明结合简易提取真菌总rna及相应的rt-pcr检测的真菌病毒快速检测方法可对真菌病毒进行特异性检测，并得到准确结果。