可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及可分泌抗pedv单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用。

背景技术：

猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)作为冠状病毒科和alphacoronavirus属的成员，是猪流行性腹泻(ped)的病原体，该病是一种高度接触性传染性肠道疾病，其主要特征是猪严重腹泻、呕吐、脱水及对哺乳仔猪的高致病率。自1982年以来，pedv已在东南亚传播和蔓延，例如在日本。在过去的30年里，亚洲猪场感染pedv的情况十分严重，分别自2005年和2007年在中国和泰国进一步记录了该病，在被感染的猪场，处于各个年龄期段的猪都受到严重呕吐和水样腹泻的影响，更严重的是哺乳仔猪的死亡率接近100％，相对而言成年猪的发病状况较轻和死亡率较低。

pedv的基因组是线性单股正链且具有感染性的rna，长约28kb，含有7个开放阅读框(orf1a，orf1b，和orf2～6)，orf1a与orf1b编码多聚蛋白pp1ab，这种多聚蛋白可被病毒编码的裂解蛋白酶分为16个非结构蛋白(nsp1～nsp16)并参与到病毒rna转录和复制的基本机制。四种结构蛋白分别是囊膜蛋白(s)、膜蛋白(m)、小膜蛋白(e)和核衣壳蛋白(n)，核衣壳就是由n蛋白与rna构成。

pedv感染的组织学特征包括严重扩散的萎缩性肠炎，随着轻度细胞质空泡化表面绒毛状肠细胞肿胀，散在的肠细胞坏死然后脱落，下层含有凋亡细胞的绒毛膜层收缩。小肠绒毛变为原始长度的三分之二左右(腺窝深度比由正常的7:1缩小为3:1，具体的变化取决于感染的程度和病情。pedv在整个小肠的绒毛上皮细胞中复制，破坏目标细胞使其细胞坏死或凋亡，这些过程导致绒毛萎缩和空泡形成以及酶活性的显着降低，这一系列的过程的发生能够阻断消化和影响营养物质和电解质的吸收，从而导致猪吸收不良发生腹泻继而使仔猪严重脱水最终致命。尽管与断奶的猪相比较，为什么pedv感染哺乳仔猪会诱发更严重的病症的机理还没有清楚地阐明，新生猪肠道细胞再生较慢可能会是一个重要的因素。

pedv在猪与猪之间的感染主要是通过直接或者间接的粪口传播，空气传播在某些条件下也在其传播中发挥作用。pedv进入猪场主要是通过临床或者亚临床感染猪的腹泻粪便、呕吐物和被污染环境资源，运输猪、饲料或者食物的拖车，猪场主或者猪场访客(如穿着携带污染源服饰和鞋子的货车司机)，以及野生动物和鸟类。其他受污染的污染物，如母乳、饲料、食物物品或食品添加剂或配料都可能是潜在的病毒来源。为了控制该病继续危害我国猪场安全，对它的及时发现就显得尤为重要。

目前现有技术中多种的检测方法如pcr、ihc、lamp等，对仪器有很高的要求或者样品前处理复杂，不能达到操作简便节省资源的目的。因此，目前的猪流行性腹泻病毒的检测、诊断和科学指导防控亟需更为简便、高效的技术。

目前有用胶体金方法检测pedv的现有技术，如专利文献“一种用于检测猪流行性腹泻病毒的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用”(申请号cn201310317343.6)。胶体金法能实现现场快速检测，但是其只能实现定性检测且灵敏度低。荧光法也被用于检测pedv，如专利文献“一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法”(申请号cn201510152757.7)。荧光法能实现定性检测且灵敏度比胶体金有所提高，但荧光标记抗体溶液中容易出现聚集，荧光信号较弱、不稳定。近来兴起的表面增强拉曼免疫检测技术具有灵敏度高且抗体特异性强的优点，如专利文献“一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉曼金标试纸条及其制备方法”(申请号：cn201810005898.x)，但是存在对胶体金质量要求严苛且拉曼试纸条对不同抗体的适应性不同的不足。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明获得了2株能分泌抗pedv单抗杂交瘤细胞4a11和3h7。

本发明的第二目的在于提供由所述的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。

本发明的第三目的在于提供所述的单克隆抗体的应用，所述的单克隆抗体可对猪流行性腹泻病毒进行高效、准确的检测。

本发明的第四目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒的试纸，通过所述的单克隆抗体建立了检测猪流行性腹泻病毒的试纸。

本发明的第五目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为杂交瘤细胞株4a11，已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctccno：c2018123。

一株可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为杂交瘤细胞株3h7，已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：c2018122。

一种猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，由保藏编号为cctccno：c2018122的杂交瘤细胞株3h7产生。所述的单克隆抗体腹水间接elisa效价达10^-7。

一种猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，由保藏编号为cctccno：c2018123的杂交瘤细胞株4a11产生。所述的单克隆抗体腹水间接elisa效价达10^-6。

所述的抗体亚型为igg2a，kappa链。

所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体的纯化方法，去除脂质后，通过辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化，其中，正辛酸与初始腹水的比例为40μl/ml，缓冲液为浓度0.015mol/lph＝7.4的pbs，硫酸铵的终饱和度为50％。

所述的去除脂质的方法优选为通过二氧化硅吸附去除。

所述的二氧化硅的加入量优选为按二氧化硅与腹水的比例为80～120mg/ml加入。

所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体在检测猪流行性腹泻病毒的应用。

一种猪流行性腹泻病毒检测试纸，包含所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。

所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括双抗体夹心拉曼检测试纸、双抗体夹心胶体金试纸、双抗体夹心荧光试纸。

所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括捕获抗体、检测抗体；所述的捕获抗体优选为由保藏编号为cctccno：c2018122的杂交瘤细胞株3h7产生的单克隆抗体，所述的检测抗体优选为由保藏编号为cctccno：c2018123的杂交瘤细胞株4a11产生单克隆抗体。

所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸的质控线优选为山羊抗小鼠igg。

所述的双抗体夹心拉曼检测试纸优选通过如下方法制得：

(1)拉曼探针：在纳米金溶液中加入agno3溶液进行反应，然后再加入拉曼探针分子进行搅拌孵育，加入pvp继续反应，离心得到拉曼探针；

(2)拉曼探针标记抗体的制备：将步骤(1)得到的拉曼探针溶于水中，调节ph至8.5，加入由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗反应，随后加入封闭剂室温孵育，离心，得到拉曼探针标记抗体，所述的拉曼探针标记抗体加入至样品溶液中作为所述的双抗体夹心拉曼检测试纸的点样溶液；

(3)拉曼试纸的组装：组装以杂交瘤细胞株4a11产生的单抗作为检测线，山羊抗小鼠igg为质控线的拉曼试纸。

步骤(1)中所述的纳米金优选通过柠檬酸盐还原法制备，加热水至沸腾后，加入氯金酸和柠檬酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色。

所述的柠檬酸盐优选为柠檬酸三钠。

所述的柠檬酸三钠的浓度优选为0.5％～1.5％(w/v)。

所述的氯金酸的浓度优选为0.005％～0.02％(w/v)。

所述的继续加热煮沸的时间优选为5～15min；更优选为10min。

步骤(1)中所述的拉曼探针分子优选为4-atp(对氨基苯硫酚)。

步骤(1)中所述的agno3溶液的浓度优选为8～12mm；更优选为10mm。

步骤(1)中所述的agno3溶液的加入速度优选为1滴/15s～1滴/25s；更优选为1滴/20s。

步骤(1)中所述的反应条件优选为室温反应20min。

步骤(1)中所述的孵育的时间优选为15min。

步骤(1)中所述的pvp优选为pvp29000；所述的继续反应的时间优选为25min。

所述的拉曼检测试纸包括支撑薄片、硝酸纤维素膜、样品垫和吸收垫、检测(t线)和质控线(c线)，所述的检测线和所述的质控线设在所述的硝酸纤维素膜上，所述的检测线为所述的杂交瘤细胞株4a11产生的单克隆抗体，所述的质控线为山羊抗小鼠igg。当t线检测出拉曼信号时，结果为阳性；当t线检测不出拉曼信号时，结果为阴性。

所述的支撑薄片优选为pvc板。

所述的双抗体夹心胶体金试纸优选通过如下方法制备得到：

(1)制备金纳米颗粒：通过柠檬酸盐还原法制备，加热水至沸腾后，加入氯金酸和柠檬酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色；

(2)制备金标抗体：在步骤(1)制得的金纳米颗粒溶液中加入由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗，搅拌反应后静置后，加入封闭剂反应后离心，然后用含20％(w/v)蔗糖、20％(w/v)海藻糖、0.1％(w/v)pvpk40、0.1％(w/v)s-9、1％(w/v)bsa、0.5％(w/v)tween-20的pbs(0.015m，ph7.4)复溶；

(3)双抗体夹心胶体金试纸的组装：组装含有以杂交瘤细胞株3h7产生的抗体制得的金标抗体的结合垫，以杂交瘤细胞株4a11产生的单抗作为检测线，山羊抗小鼠igg为质控线的双抗体夹心胶体金试纸。

步骤(1)中所述的金纳米颗粒的粒径优选为40nm。

步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为15min；所述的静置的时间优选为15min。

步骤(2)中所述的封闭剂优选为peg20000；所述的加入封闭剂反应的操作优选为旋转15min并静置15min。

步骤(2)中所述的离心条件优选为6000rpm离心15min。

步骤(3)中所述的双抗体夹心胶体金试纸的组装中，所述的胶体金试纸条包括样品垫、结合垫和吸收垫制成。

所述的样品垫处理液为含1.0％～5.0％(w/v)蔗糖、0.5％～3％(v/v)tween-20的0.2mph7.4的磷酸缓冲液；所述作为检测线的杂交瘤细胞株4a11产生的单抗终浓度为0.5～1mg/ml；所述作为质控线的山羊抗小鼠igg终浓度为0.5～2mg/ml；所述的结合垫上需要的金标抗体终浓度为150～300mg/ml。

所述的双抗体夹心荧光试纸优选通过如下方法制备得到：

(1)荧光标记抗体的制备：将荧光微球与由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗搅拌孵育后，加入甘氨酸过夜反应，再加入乙醇胺，室温搅拌反应，超声清洗；

(2)双抗体夹心荧光试纸的组装：组装含有以杂交瘤细胞株3h7产生的抗体制得的荧光标记抗体的结合垫，以杂交瘤细胞株4a11产生的单抗作为检测线，山羊抗小鼠igg为质控线的双抗体夹心荧光试纸。

步骤(1)所述的荧光微球优选先进行如下活化步骤：先将荧光微球于0.05mmes溶液中，离心30min后，再次溶解于0.05mmes(ph6.0)中，超声清洗；加入1mg/mledc、1mg/mlnhs，孵育30min，超声清洗，得到活化后的荧光微球。

步骤(1)中所述的超声清洗的时间优选为20～40min；进一步优选为30～40min。

步骤(1)中所述的甘氨酸的浓度优选为0.05～0.2m；更优选为0.1m。

步骤(1)中所述的杂交瘤细胞株3h7产生的单抗终浓度优选为40～80mg/ml。

步骤(1)中所述的乙醇胺与荧光标记抗体溶液的比例为20～50μl/ml。

步骤(1)中所述的室温搅拌反应的时间优选为10～30min。

一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒，包含所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的杂交瘤细胞株4a11和3h7是可高产分泌抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，所述的单克隆抗体腹水间接elisa效价均达10^-6。

(2)本发明提供的杂交瘤细胞株4a11和3h7分泌抗猪流行性腹泻病毒特异性单抗，以所述的单抗为核心建立猪流行性腹泻病毒检测试纸(如拉曼试纸、胶体金试纸、荧光试纸)均能高度特异、准确、灵敏地检测猪流行性腹泻病毒。本发明的检测试纸灵敏度高，所制得的拉曼试纸、胶体金试纸、荧光试纸的检测限(lod)分别可达0.078125μg/ml(0.975×10³tcid50/ml)、0.625μg/ml(7.8×10³tcid50/ml)、0.3125μg/ml(3.9×10³tcid50/ml)，其中，所制得的拉曼试纸比同样方法制备的胶体金试纸条高4个滴度，比同样方法制备的荧光试纸条高2个滴度。而且所述的检测试纸仅与猪流行性腹泻病毒反应，与猪胃肠炎病毒和猪伪狂犬病毒等均不发生免疫反应，特异性好。

(3)利用本发明所制备的单克隆抗体检测猪流行性腹泻病毒，不需要昂贵的电子显微镜、pcr仪等设备，操作简便，可实现现场快速检测。

(4)利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效且快速地用于猪粪便中病毒的检测，为我国猪流行性腹泻病毒的检测、诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。

附图说明

图1是胶体金试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(pedv)的结果图。

图2是胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒(pedv)的灵敏度结果分析图。

图3是胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)和传染性胃肠炎病毒(tgev)的结果图。

图4是胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒的特异性结果分析图。

图5是荧光试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(pedv)的结果图。

图6是荧光试纸条检测猪流行性腹泻病毒(pedv)的灵敏度结果分析图。

图7是拉曼试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(pedv)的结果图。

图8是拉曼试纸条检测猪流行性腹泻病毒(pedv)的灵敏度结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。

实施例1杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备

1、pedv病毒的制备

将pedvchyj130330株(genbank:kj020932，由广东海大畜牧兽医研究院分离鉴定，保存)在37℃下接种于vero细胞(购自atcc，货号：atccccl-81)单层45分钟。然后将实验室配置的维护培养基(含1％(v/v)双抗(青链霉素混合液)的dmem)添加到培养物中培养2或3天。当细胞病变达到85％以上时，收集细胞并重复冷冻和解冻3次。超声破碎并以10000rpm离心1小时后，将上清液以45000rpm进一步离心3小时，并将沉淀再悬浮于pbs(0.01m，ph7.4)中。粗提物病毒依次铺于30％～60％((w/v))蔗糖-pbs中，33000rpm离心3h。然后将pedv病毒重新悬浮于pbs中并以40000rpm离心3小时以除去蔗糖。将纯化的病毒重悬于pbs中。将未接种的vero细胞进行相同的处理并用作阴性对照。

2、免疫动物

将超离纯化后的pedv免疫体格强健的6周龄balb/c小鼠(购自南方医科大学实验动物中心)。免疫方法如下，大腿肌肉、背部和皮下免疫弗式完全佐剂乳化的抗原100～105μg/只，2周后皮下免疫弗式不完全佐剂乳化的抗原80～85μg/只，间隔2周后皮下免疫弗式不完全佐剂乳化的抗原80～85μg/只，再间隔4周后皮下免疫弗式不完全佐剂乳化的抗原80～85μg/只，4免后1周采血，间接elisa测定抗血清效价。选取效价最高的小鼠融合前3天尾静脉注射80～85μg纯病毒抗原加强免疫。

3、细胞融合

因为融合时需要sp2/0细胞，所以融合前期要复苏并扩大培养sp2/0细胞(购自上海细胞生物学研究所)。

选择状态较好的sp2/0细胞通过有限稀释法多次亚克隆，选取状态最好的sp2/0细胞重悬并进行细胞计数，重悬前用基本培养基(含1％(v/v)双抗(青链霉素混合液)的rpmi-1640)清洗细胞，洗去死亡细胞，然后根据脾细胞总量取适量体积的优化后sp2/0细胞，制备好所需要的sp2/0细胞悬液。

融合的过程中先将饲养细胞离心1000r/min，7min去掉上清，于37℃放置备用。将制备的sp2/0细胞与免疫脾细胞(从步骤2免疫后的小鼠脾脏获得脾细胞)按体积比1:6于50ml离心管中混匀，1000r/min离心7min，去上清。将装有细胞混合物的离心管放入37℃水浴中，然后在1min内以由慢到快的速度滴入预热到37℃的50％peg1ml，边加边轻轻搅拌，加完后静置3min，接着在2～4min内以由慢到快的速度滴加15ml的基本培养基，1000r/min离心7min。用hat选择培养基重悬融合后的细胞并进行铺板，铺到预先铺有饲养层细胞的96孔细胞板，放入37℃，5％co2细胞培养箱中静置培养并观察细胞状态，5d～7d后选取细胞克隆数目多或细胞数量较多的细胞孔换液继续培养，其内细胞经过48小时即可取其细胞培养液进行检测。

4、筛选杂交瘤细胞的细胞表面间接荧光免疫吸附法的建立

参照专利文献“一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用”(申请号cn201510331003.8)的实施例1将pedv与偶联剂偶联进行融合后抗pedv阳性细胞的挑选。

将细胞弃去培养上清液，然后将制备的抗原偶联复合物与fitc标记的山羊抗小鼠igg(购自奥创生物技术有限公司，货号：a102-ab1)混合并稀释后每孔加100μl，37℃静置孵育1h后洗涤3次，每孔加入200μlrpmi1640培养基，置于荧光显微镜下观察每孔细胞。空白对照孔不加入抗原偶联复合物；sp2/0细胞上清和小鼠的阳性血清(用pbs稀释5000倍)分别为阴性对照和阳性对照，相同条件处理后进行对比。将镜下观察到荧光信号的阳性细胞孔标记后加入甲基纤维素半固体培养基，移液枪挑出标记细胞团，将其扩大传代培养后用于制备腹水和液氮保存，最终获得稳定的细胞株18株。

5、筛选杂交瘤细胞的间接elisa法的建立

将pedv包被酶标板检测杂交瘤细胞上清液，同时每次检测设定pbs为空白对照，以sp2/0细胞上清和小鼠的阳性血清(用pbs稀释5000倍)分别为阴性对照和阳性对照。将阳性孔通过有限稀释法多次亚克隆，将最终得到的阳性单克隆扩大传代培养后用于制备腹水和液氮保存，最终获得稳定的细胞株3株。综合两种筛选方法，本次共获得稳定的细胞株21株。

6、单克隆抗体腹水制备及纯化

采用体内诱生腹水法制备单抗。选取6～8周龄的balb/c小鼠腹腔注射液体不完全佐剂0.4～0.5ml/只，一周后注射浓度为1×10⁶/ml对数生长期的阳性杂交瘤细胞0.5ml到每只小鼠的腹腔。每天观察小鼠的生长情况至小鼠腹部膨大到影响其行动和精神状态，用注射针头抽取腹水。3000rpm离心10min，收集上清液即为单抗腹水。

纯化方案(1)：参照中文图书《细胞和分子免疫学实验技术》第三章“免疫球蛋白纯化技术”进行腹水纯化。腹水4℃，12000rpm离心15min，去除杂质。取1份腹水与2份醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33μl/ml腹水。室温混合30min。4℃静置2h以上，使其充分沉淀。上清经砂芯漏斗或125μm的尼龙网过滤后，加入1/10体积的0.1mph7.4pbs，用2mnaoh调ph值至7.4。冰浴下于30min内加入0.277g/ml的硫酸铵，使成45％饱和度。4℃静置1h以上。4℃，10000rpm离心30min，弃上清。沉淀用适量含137mmnacl、2.6mmkcl、0.2mmedta的ph7.4pbs溶解，于50～100倍体积的上述pbs中4℃透析过夜。

纯化方案(2)：在纯化方案(1)的基础上根据腹水存在脂质的实际情况，在过饱和硫酸铵之前按二氧化硅与腹水的比例为80～120mg/ml加入二氧化硅，静置0.5～2h吸附脂质。根据优化后结果将正辛酸与初始腹水的比例调为40μl/ml，pbs的浓度调为0.015mol/l，过滤膜的孔径调为0.45μm，硫酸铵的终饱和度调为50％。

采用pedv包板，将纯化方案(1)和(2)纯化的抗体4a11梯度稀释到相同浓度作为一抗，建立起对比两种纯化方案所得抗体效价的间接elisa。结果显示纯化方案(1)纯化抗体4a11的效价为2⁴×1000，纯化方案(2)纯化抗体4a11的效价为2⁶×1000，方案(2)纯化抗体的效价高于方案(1)。采用sds-page变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒(购自bbilifescience，cas号：e910da009)进行两种方案纯化后抗体4a11纯度的鉴定。明显观察到纯化方案(2)纯化抗体4a11的轻重链对应的位置出现的条带比纯化方案(1)纯化抗体4a11的轻重链对应的位置出现的条带浅1/2，该现象表明纯化方案(2)纯化抗体的纯度高于纯化方案(1)。两个鉴定实验共同说明了本发明优化的纯化方案(2)使抗体效价得到了提高。

7、单抗的类型及亚类鉴定和腹水效价测定

用鉴定单抗类型的试剂盒(southernbiotech，货号：5300-05)鉴定单抗的类型及亚类，结果显示除了编号为6h2的抗体亚型为igm，其余的抗体亚型都是igg2a，所有抗体的轻链类型都为κ链。采用间接elisa法检测单抗腹水的效价，结果表明单抗效价在2⁴×1000以下的有4株(a11h7、4a11h8、4a11c10、6h2)；效价在2⁴×1000～2⁷×1000之间的有16株(6d10、2h2、5h12、5a9、5h9、3c11f5、3c11f9、2c11、5a11、4a11b9、4g10、5e2、4d5、3g9、3h7、4h7)；效价为2⁸×1000的有1株(4a11)。

8、单抗的特异性检测

用pedv、猪伪狂犬病毒(prv)疫苗毒株bartha-k61(由广东永顺生物制药股份有限公司提供)、猪胃肠炎病毒(tgev)华毒疫苗株(由广东海大畜牧兽医研究院提供)包被elisa板，用间接elisa方法分析单抗的特异性反应。

结果显示，本发明的单抗仅与猪流行性腹泻病毒反应，而与猪伪狂犬病毒和猪胃肠炎病毒均不发生免疫反应。

9、双抗体夹心elisa方阵法配对实验

从筛选出的21株抗pedv单抗中挑选出14株效价较高的单抗进行双抗体夹心elisa方阵法配对实验。针对不同株抗体的效价不同，在配对之前要对酶标抗体的效价进行确定。选用b型的hrp标记试剂盒(购自北京泰天河生物技术有限公司，货号：md030)标记待配对的纯化抗体，其标记后的效价用直接elisa法进行测定。

确认好酶标抗体的效价后，将抗体包被在酶标板上，pedv稀释成相同浓度作为一抗，根据酶标抗体的效价将其稀释到合适浓度，建立双抗体夹心elisa方阵。如表1所示，“-”表示od450<1，“+”表示1<od450<2，“++”表示od450>2，有7个抗体配对的od450值大于1，其中3h7和hrp-4a11配对的od450值高于2，表明3h7和4a11配对的检测效果最好。

表1

10、杂交瘤细胞株的优化

通过间接elisa法检测单抗腹水的效价，3h7的效价为2⁷×1000，4a11的效价为2⁸×1000，高于其他19株抗体的效价；特异性检测结果显示3h7和4a11与猪伪狂犬病毒和猪胃肠炎病毒均不发生免疫反应；配对实验表明3h7和4a11配对的检测效果最好，故选择这两株抗体进行后续检测技术的建立。

杂交瘤细胞株3h7已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：c2018122。

杂交瘤细胞株4a11已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：c2018123。

将3h7和4a11这两株细胞进行有限稀释法克隆，具体步骤参考《抗体制备与使用实验指南》。采用间接elisa法检测(同步骤5)，将od450值高、只有一团细胞且细胞状态好的孔挑选出继续扩大培养。重复进行有限稀释法克隆和间接elisa法检测3次，用优化后的两株细胞制备腹水并进行纯化和鉴定(同步骤6～8)，分别得到纯化后的由杂交瘤细胞株3h7产生的单克隆抗体和由杂交瘤细胞株4a11产生的单克隆抗体，并做进一步研究。

实施例2抗pedv单抗的应用——双抗体夹心胶体金试纸条

1、制备金纳米颗粒(aunps)

方案(1)：参照中文图书《临床检验实验系列教程----免疫学检验分册》进行aunps的制备。将氯金酸(hauclo4)先配成0.005％～0.02％(w/v)水溶液，取100ml加热至沸腾。沸腾后立即快速搅动下准确加入0.5％～1.5％(w/v)柠檬酸三钠水溶液1ml。继续加热煮沸5min，呈橙红色。

方案(2)：对方案(1)进行优化，水沸腾后再加入0.005％～0.02％(w/v)氯金酸和0.5％～1.5％(w/v)柠檬酸三钠，继续加热煮沸5～15min，搅拌冷却后用超纯水定容至50ml。

方案(1)制备的aunps液面出现很多漂浮物、透光性差且底部出现黑色沉淀，方案(2)制备的aunps液面无明显漂浮物、透光性好且底部无黑色沉淀，表明本发明优化的方案(2)制备的aunps的质量更好。

2、制备金标抗体(aunps-mab)

方案(1)：参照期刊文献“张晓丽,颜露,向军俭,etal.呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制[j].食品工业科技,2013,34(13).”进行aunps-mab的制备。

方案(2)：

水沸腾后加入0.01％(w/v)氯金酸水溶液和1％(w/v)柠檬酸三钠，继续加热煮沸10min，搅拌冷却后用超纯水定容至50ml，制得金纳米颗粒(aunps)。

对方案(1)进行优化，采用所制得的金纳米颗粒(aunps)进行抗体标记。加入9μl(2mg/ml)由杂交瘤细胞株3h7产生的抗体后旋转15min并静置15min，接着加入100μl1％peg20k，旋转15min并静置15min，6000rpm离心15min后用60μl含20％(w/v)蔗糖、20％(w/v)海藻糖、0.1％(w/v)pvpk40、0.1％(w/v)s-9、1％(w/v)bsa、0.5％(w/v)tween-20的pbs(0.015m，ph7.4)复溶。

方案(1)制备的aunps-mab发生大量聚集；方案(2)制备的aunps-mab几乎观察不到聚集现象，表明本发明优化的方案(2)制备的aunps-mab的质量更好。

3、胶体金试纸条的组装

胶体金试纸条由pvc板，nc膜(180)，样品垫，结合垫和吸收垫制成。

(1)使用自动划膜器，将pbs(0.015m，ph7.4)稀释的mab(含有0.5～1mg/mlmab，所述的mab为由杂交瘤细胞株4a11产生的单抗)和浓度为0.5～2mg/ml的山羊抗小鼠igg(购自奥创生物技术有限公司，货号：a102-ab1)分别划到nc膜上被称为检测线(t线)和质控线(c线)的特定区域，划膜宽度为1μl/cm。

(2)nc膜在37℃下干燥并保存备用。

(3)使用自动喷金系统将aunps-mab喷到结合垫上，然后在37℃下干燥。

(4)对样品垫进行预处理，在室温下干燥后在37℃烘至全干。以pvc底板为支撑，从左到右依次黏贴上剪切好的样品垫、结合垫、nc膜和吸水纸。

装配完成后，使用可编程hgs201切条机将胶体金试纸条切割成3.8毫米宽和60毫米长的长条，将其装进卡壳并保存在合适的塑料盒中供进一步使用。

4、方法检测灵敏度和特异性的确定

使用磷酸缓冲液(0.2m，ph7.4，含有1％(w/v)tween-20)将浓缩的pedv(病毒滴度表示为tcid50，10⁶tcid50/ml；使用bca检测病毒浓度，80μg/ml)稀释成一系列浓度(0，0.625，1.25，2.5，5和10μg/ml)作为样品溶液。然后，将不同的样品溶液(各取80μl)分别添加到步骤3(其中，步骤(1)中的mab浓度为0.875mg/ml，山羊抗小鼠igg浓度为1mg/ml)制得的胶体金试纸条的样品孔中。拍摄照片以记录反应15分钟后的结果。在样品垫处理液配方、结合垫上需要的金标抗体终浓度、吸水纸和胶体金粒径的优化后：样品垫处理液为含1.0％～5.0％(w/v)蔗糖、0.5％～3％(v/v)tween-20的0.2mph7.4pb(磷酸缓冲液)，结合垫上需要的金标抗体终浓度为150～300mg/ml，吸水纸采用的是上海捷宁生物科技有限公司的h-2类型吸水纸，胶体金粒径为40nm，使用pb(磷酸缓冲液)中的pedv的系列稀释液(0，0.625，1.25，2.5，5和10μg/ml)测试双抗体夹心胶体金试纸条对于各种浓度的pedv的检测性能，结果如图1所示，随着pedv浓度的升高，t线的红色越来越深，点阴性样时不出现红色t线。对结果的进一步分析通过来自imagej的灰度值得出，如图2所示，经计算得出检测限(lod)为0.625μg/ml(7.8×10³tcid50/ml)。

采用本发明的胶体金试纸条检测猪伪狂犬病毒(prv)，猪圆环病毒2型(pcv-2)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)，猪瘟病毒(csfv)，传染性胃肠炎病毒(tgev)。结果如图3所示，点pedv时胶体金试纸条上出现明显的红色t线；在含有其他猪病毒的样本中t线上的颜色是不可见的。这些结果表明，本发明制备得到的胶体金试纸条具有高度的特异性。

对上述结果进一步通过来自imagej的灰度值得出。结果如图4所示，没有观察到与其他猪病毒的显著交叉反应，这进一步表明本发明的胶体金试纸条的高特异性。

5、添加回收实验

将阴性猪粪4℃，2000rcf，5min离心去除沉淀，然后与pb(磷酸缓冲液)以体积比1:6混合并加入pedv混合以制备加标样品。分别对包含0.1，1，5，10或20μg/mlpedv的加标样品进行了测试。随着pedv浓度的增加，t线处的红色变得更强。在六次重复实验中分析每个加标样品，并使用对应于标准曲线的标准方程计算灰度值。结果如表2所示，双抗体夹心胶体金试纸条的回收率在90％到110.27％之间，最高相对标准偏差(rsd)为12.63％。

表2

备注：结果取六个平行重复的算术平均值；回收率(％)＝(回收量/加入量)×100％；相对标准偏差＝(标准偏差/平均数)×100％。

实施例3抗pedv单抗的应用——双抗体夹心荧光试纸条

1、荧光标记抗体

方案(1)：参照期刊文献“崔浩,陈耀强,唐勇,etal.莱克多巴胺荧光胶乳颗粒免疫层析检测法的建立[j].分析测试学报,2011,30(7):764-768.”进行荧光标记抗体。

方案(2)：优化方案(1)，取荧光微球(购自苏州为度生物技术有限公司，货号：fg02c)50μl溶于950μl0.05mmes(2-(n-吗啡啉)乙磺酸)(ph6.0)中，15000rpm离心30min。吹散沉淀，溶解于1ml0.05mmes(ph6.0)中，超声清洗20min。加入10.65μl1mg/mledc(碳二亚胺)，6.65μl1mg/mlnhs(n-羟基珀酰亚胺)，混匀，旋转30min，超声清洗20min。

加入终浓度分别为10、20、40、80和160mg/ml的mab(由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗)，然后与荧光微球旋转2.5h；加入0.01m甘氨酸过夜反应，再加入30μl乙醇胺，室温搅拌30min，超声清洗40min。

将荧光微球和终浓度为80mg/ml的mab(由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗)旋转孵育2.5h后，分别加入20μl0.01m甘氨酸、10％bsa(w/v)、1％peg20000、1％pvp-40、1％甘露糖、1％酪蛋白钠作为封闭剂，然后混匀，过夜。再加入30μl乙醇胺，室温搅拌30min，超声清洗40min。

将荧光微球和终浓度为80mg/ml的mab(由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗)旋转孵育2.5h后，加入0.01m甘氨酸混匀，过夜反应；分别加入10μl、20μl、30μl、40μl、50μl乙醇胺，然后室温搅拌30min，超声清洗40min。

将荧光微球和终浓度为80mg/ml的mab(由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗)旋转孵育2.5h后，加入0.01m甘氨酸混匀，过夜反应；加入30μl乙醇胺，室温搅拌30min，分别超声清洗10min、20min、30min、40min、50min。

优化后的条件为mab的终浓度为40～80mg/ml，其他加入量对应的试纸条的灵敏度相对低且荧光出现聚集现象；封闭剂为0.1m甘氨酸，其他封闭剂的封闭效果不佳，对应的试纸条的非特异性强；研究发现0.05～0.2m的甘氨酸均能获得特异性较好的效果；乙醇胺的加入量为20～50μl，其他加入量对应的试纸条的非特异性强；超声清洗时间为20～40min，低于这个时间对应的试纸条出现聚集现象，高于这个时间对应的试纸条的灵敏度降低；当超声清洗时间为30～40min时，效果更佳。

使用激发光为365nm的紫外灯手电筒(购自supfire，货号：uv03-365)照射溶液，方案(1)制备的荧光标记抗体溶液中出现荧光聚集形成的亮点且荧光信号变弱，方案(2)中优化后的方案所制备的荧光标记抗体溶液无聚集现象且荧光信号稳定，表明本发明优化的方案(2)制备的荧光标记抗体的质量更好。

2、荧光试纸条的组装

荧光试纸条由pvc板，nc膜(180)，样品垫，结合垫和吸收垫制成。

(1)使用自动分配器，将pbs(0.015m，ph7.4)稀释的mab(含有0.875mg/mlmab，所述mab为由杂交瘤细胞株4a11产生的单抗)和山羊抗小鼠igg(购自奥创生物技术有限公司，货号：a102-ab1)(0.25mg/ml)分别分配到称为测试线(t线)和校准线的nc膜的特定区域(c线)，体积为0.5μl/cm。

(2)nc膜在37℃下干燥并保存备用。

(3)使用设定为1.0ml/cm的自动分配系统将步骤1中方案(2)的优化条件下制得的荧光标记抗体加载到结合垫上，然后在37℃下干燥。

(4)样品垫的预处理包括浸泡在pbs(0.015m，ph7.4，并且含有2.5％(w/v)蔗糖，2％(w/v)bsa，1％(w/v)tween-20)中并且在室温下干燥然后在37℃烘至全干。以pvc底板为支撑，从左到右依次黏贴上剪切好的样品垫、结合垫、nc膜和吸水纸，其中样品垫和结合垫要有2mm的重叠。

装配完成后，使用可编程hgs201切条机将荧光试纸条切割成3.8毫米宽和60毫米长的长条，将其装进卡壳并保存在合适的塑料盒中供进一步使用。

3、方法检测灵敏度的确定

使用磷酸缓冲液(0.2m，ph7.4，含有1％(w/v)tween-20)将浓缩的pedv(病毒滴度表示为tcid50，10⁶tcid50/ml；使用bca检测病毒浓度，80mg/ml)稀释成一系列浓度(0，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5和10mg/ml)，作为样品溶液。然后，将不同的样品溶液(各取80μl)分别添加到步骤2制得的荧光试纸条的样品孔中。拍摄照片以记录反应10分钟后的结果。结果如图5、图6所示，检测限(lod)为0.3125μg/ml(3.9×10³tcid50/ml)。

实施例4抗pedv单抗的应用——双抗体夹心拉曼试纸条

1、拉曼探针auag^4-atp@agnps的制备

方案(1)：参照期刊文献“shen,haicongetal.(2018).anovelsers-basedlateralflowassayfordifferentialdiagnosisofwild-typepseudorabiesvirusandge-deletedvaccine.sensorsandactuatorsb:chemical.282.10.1016/j.snb.2018.11.065.”进行拉曼探针auag^4-atp@agnps的制备。

方案(2)：优化方案(1)，使用本发明中实施例2中步骤1的(2)方案制备30nm胶体金。取100ml水加热至沸腾，将1ml0.01％(w/v)氯金酸(用水溶解)和1.6ml1％(w/v)柠檬酸三钠(用水溶解)依次加入，继续加热煮沸10min，搅拌冷却后用超纯水定容至50ml。将制备的30nm胶体金作为原料，进行拉曼探针的制备，使用的agno3溶液的浓度为10mm，agno3溶液的加入速度为1滴/20s，其他步骤同方案(1)。

用便携式拉曼仪(购自广州标旗光电科技发展股份有限公司，型号：smartraman检测拉曼信号，方案(1)制备的拉曼探针的拉曼信号为11000，方案(2)制备的拉曼探针的拉曼信号为24500。方案(2)制备的拉曼探针的拉曼信号比方案(1)提高1倍以上，故本发明优化的方案(2)能获得拉曼信号更高的拉曼探针。

2、auag^4-atp@agnps标记抗体

该步骤所用的抗体为由杂交瘤细胞株3h7产生的单抗，浓度为2mg/ml，加入量为16μl。

方案(1)：参照文献“shen,haicongetal.(2018).anovelsers-basedlateralflowassayfordifferentialdiagnosisofwild-typepseudorabiesvirusandge-deletedvaccine.sensorsandactuatorsb:chemical.282.10.1016/j.snb.2018.11.065.”进行auag^4-atp@agnps标记抗体操作。

方案(2)：优化方案1，使用步骤1中方案(2)制备的拉曼探针进行auag^4-atp@agnps标记抗体操作。对0.25m的碳酸钾加入量进行优化，设置梯度分别为0μl、3μl、6μl、9μl、12μl和15μl，结果显示碳酸钾加入量为0μl时auag^4-atp@agnps标记抗体稳定且拉曼信号值最高，随着碳酸钾加入量的增加溶液的沉淀增加，溶液变澄清，证明拉曼探针发生聚集，无法进行后续实验。故选择0μl为优化后的碳酸钾加入量。

用前述的便携式拉曼仪检测拉曼信号，方案(1)制备的auag^4-atp@agnps标记抗体的拉曼信号为6000，方案(2)制备的auag^4-atp@agnps标记抗体的拉曼信号为8200。方案(2)制备的auag^4-atp@agnps标记抗体的拉曼信号比方案(1)增强很多，表明本发明优化的方案(2)能获得拉曼信号更高的auag^4-atp@agnps标记抗体。

3、拉曼试纸条的组装

拉曼试纸条由pvc板，nc膜(180)，样品垫和吸收垫制成。

(1)使用自动分配器，将pbs(0.015m，ph7.4)稀释的mab(含有0.875mg/mlmab，所述的mab为由杂交瘤细胞株4a11产生的单抗)和0.5mg/ml山羊抗小鼠igg(购自奥创生物技术有限公司，货号：a102-ab1)分别分配到称为测试线(t线)和校准线的nc膜的特定区域(c线)，体积为1μl/cm。

(2)nc膜在37℃下干燥并保存备用。

(3)样品垫的预处理包括浸泡在pbs(0.015m，ph7.4，并且含有2.5％(w/v)蔗糖，2％(w/v)bsa，1％(w/v)tween-20)中并且在室温下干燥然后在37℃烘至全干。以pvc底板为支撑，从左到右依次黏贴上剪切好的样品垫、nc膜和吸水纸。

装配完成后，使用可编程hgs201切条机将拉曼试纸条切割成3.8毫米宽和60毫米长的长条，将其装进卡壳并保存在合适的塑料盒中供进一步使用。

4、方法检测灵敏度的确定

使用磷酸缓冲液(0.2m，ph7.4，含有1％(w/v)tween-20)将浓缩的pedv(病毒滴度表示为tcid50，10⁶tcid50/ml；使用bca检测病毒浓度，80mg/ml)稀释成一系列浓度(0，0.078125，0.15625，0.3125，0.625，1.25和2.5μg/ml)，每29μl样品溶液加入1μlauag^4-atp@agnps标记抗体，作为点样溶液。然后，将不同的点样溶液(各取80μl)分别添加到步骤3制得的拉曼试纸条的样品孔中。15分钟后使用便携式拉曼仪器读取拉曼信号，拍摄照片记录结果。结果如图7、图8所示，检测限(lod)为0.078125μg/ml(0.975×10³tcid50/ml)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。