交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法与流程

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法。

背景技术：

肉类动物来源的识别影响了食品和肉类生产加工，交易市场和餐饮业等领域。肉类食品安全层面越来越关注低价肉类如猪肉的替代品，以及牛、驴肉、羊肉等价格较高的肉类。肉类的欺诈性标签损害消费者的利益。肉类验证是动物源性食品的质量和安全的主要领域之一。基于鉴定加工和生肉物种方法的开发研究的重要性日益凸显。

cpa是一种核酸等温扩增技术，最初由杭州优思达生物技术有限公司开发(wo2010/080691a1)。传统的单交叉引物cpa扩增系统依赖于具有链置换功能的dna聚合酶和一套依据靶序列设计的引物：一条用于在每轮扩增期间引入额外引发位点扩增的交叉引物（2a1s）；两个标记的引物（2a*，3a*）参与扩增并用于检测；一对外围引物（4s，5a）分离单链序列。在适宜酶扩增的温度条件下，扩增产生具有与核酸试纸条检测线特异性结合位点结合的“抗原”产物(2a*1s3s/2s1a3a*）。

已有cpa技术的研究应用于食品医药、防疫检疫领域中病毒、原核生物、真核生物等的检测。在肉源性成分检测的应用中，传统cpa扩增系统只能针对一种肉源设计其特异的cpa检测体系，利用胶体金核酸试纸条或者其它检测方式将待检测肉源与其它肉源区分，如需进行多种肉源性成分的检测需要多套特异引物体系的设计和多次实验操作，在肉源掺假快速检测或其它检测应用方面还有其限制性。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于涉及提供交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法的技术方案。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于包括以下步骤：

1）在反应管中加入基础cpa体系：bstdna聚合酶反应缓冲液，甜菜碱，mg²⁺，bstdna聚合酶，ddh2o；一套cpa引物系统；不同肉源dna；

2）反应管在63℃恒温水浴锅中扩增60min后取出，外加各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*(n=1,2,3...)后，93℃水浴反应3min，取反应产物在胶体金核酸试纸条上测试。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤1）中cpa引物系统为：以不同肉源的相同基因片段设计的5条通用引物，包括一条交叉引物2a1s，两条内引物3a、2a，一对外围引物4s、5a，其中内引物3a、2a任一标记一条。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤2）中是各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*依据待检测的不同肉源的特异性基因片段设计的外加标记检测引物。

所述的交叉引物等温扩增反应体系同步检测多种肉源性成分方法，其特征在于所述步骤2）中胶体金核酸试纸条检测区域可设置与各个肉源的特异性外加标记引物6s/a-n*的不同外加标记结合的抗原/抗体以阻截不同肉源的产物，从而在不同检测线位置显现结果。

本发明以多种肉源性dna为对象，结合核酸试纸条检测技术建立cpa体系扩增技术，巧妙将体系内的一条标记改为扩增反应后外加标记引物的思路。可以不考虑研究对象的个数，只用一个cpa引物体系配合不同物种的外加标记引物，实现多种肉源性成分的同步检测，为满足当今食品安全现场快速检测市场和监管，具有重要的参考应用价值。

附图说明

图1cpa反应体系同步检测多种肉源性成分方法原理示意图；

图2优化后的cpa体系同步检测驴、羊、狐肉dna在胶体金核酸试纸条上的检测结果图。

图中0-ddh2o+驴、羊、狐外加标记，1-驴dna+驴外加标记，2-驴dna+羊外加标记，3-驴dna+狐外加标记，4-羊dna+驴外加标记，5-羊dna+羊外加标记，6-羊dna+狐外加标记，7-狐dna+驴外加标记，8-狐dna+羊外加标记，9-狐dna+狐外加标记。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1

1材料与设备

1.1实验材料

新鲜的动物肉（羊肉、驴肉购买自杭州农贸市场；狐狸肉由养殖厂提供）；ste缓冲液、sds、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）、氯仿-异戊醇（24:1）（杭州诺扬生物技术有限公司）；10×bstbuffer、bstdna聚合酶（北京拜尔迪生物技术有限公司）；无水乙醇、引物、蛋白酶k（12mg/ml)、5mol/lnacl溶液、te缓冲液、dntps、mg²⁺、ddh2o、5mol/l甜菜碱、石蜡油（上海生工工程技术有限公司）。

1.2仪器设备

nanodrop-2000核酸蛋白分析仪（thermo公司）、恒温水浴锅、离心机（thermo公司）、xh-c漩涡混合器。

2实验方法

2.1提取肉源dna

取新鲜的肉剪碎，采用改进的酚-氯仿抽提法提取各个待检测肉源的dna，利用核酸蛋白分析仪测浓度、纯度，以od260/od280数值为参考值，将适宜dna样品置于-20℃冷冻保存备用。

2.2狐、羊、驴cpa引物、外加标记引物设计

选择物种的线粒体基因作为设计引物的目标区段。从ncbi数据库中下载羊、狐狸、驴的全线粒体基因序列，利用dnaman软件比对，选取三个物种的约100bp差异基因序列作为设计外加标记引物设计的区段，结合primer软件在其周围的一致性区域设计5条通用性引物作为参与cpa扩增引物。在oligo软件中分析各个引物之间相互反应的可能性，并根据gc%、tm值、△g等参数对设计的引物进行修改以降低外加标记引物与检测探针内引物相互结合的可能性。

2.3cpa扩增及胶体金核酸试纸条测试

利用20µl的一个cpa反应体系对狐、羊、驴模板dna进行该cpa体系的有效性测试，20µlcpa反应体系（表1）加在反应管中于63℃水浴锅中恒温扩增60min，扩增结束后在相应的管子中加入3µl的不同物种的外加标记引物6s-n*，于93℃反应3min后取出，检测产物为2a1s3a*/6s-n*，在胶体金核酸试纸条上测试。

表120µlcpa反应体系

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3结果与分析

3.1狐、羊、驴cpa引物、外加标记引物设计结果

从ncbi数据库中选择狐、羊、驴三物种的全线粒体基因比对，在基因位置为16sribosomalrna基因区段位置作为设计cpa引物的目标区段。选择该基因序列位置的一段约100bp的差异基因序列设计狐、羊、驴三个外加标记引物（表2），通过核酸数据库的比对证明各个物种的外加标记引物都能找到相应物种。在其前后适当位置设计5条通用性引物作为参与cpa扩增引物（表3）。

表2狐、羊、驴外加标记引物序列

表3狐、羊、驴通用cpa系统引物表

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3.2cpa扩增和胶体金核酸试纸条测试结果

用一个cpa体系扩增狐、羊、驴dna，得到的扩增产物加对应的外加标记引物，结合胶体金核酸检测试纸条验证此设计方法的有效性，初始cpa体系检测结果显示可以扩增出狐、羊、驴的目标产物但阳性不强，通过改变3a*，2a的浓度比例，让产物中与外加探针互补的产物量增多，竞争条带的2a1s3s产物的量减少。结果显示在实验条件下，用2a:3a*=1:3比例的cpa引物扩增系统可以扩增出待检物种的对应反应产物，特异外加标记引物与扩增产物能有效结合并在试纸条上显示较好的阳性结果（图2）。故将一条标记引物转为外加标记引物的cpa检测方法可以实现多源性成分同步检测，为恒温扩增同步检测多源性成分提供了新的解决方案。