用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的肠道微生物菌群的制作方法

本发明涉及微生物组学领域，具体地说，涉及用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的肠道微生物菌群。

背景技术：

类风湿关节炎(ra)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的自身免疫性疾病。其特点是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。患病率为0.33％，我国约有500万患者，且多为中青年女性，未经正规治疗致残率达75％。常用费甾体类抗炎药、关节注射糖皮质激素等治疗。目前的治疗方法仅能控制病情，而非治愈ra，治疗是一个不断反复的过程，因此需要患者定期随访、及时评估疾病活动程度、进展情况以及药物副作用，来根据实际情况考虑是否改变治疗方案。

与ra初始诊断评估不同，目前对类风湿关节炎患者的预后以及疾病活动情况的评估主要通过acr标准(acr20、acr50、acr70)判断，方法基于观察和问卷评分综合判定。这一方法相对生理学改变，比较滞后，对于预后不良的患者而言，这种判断方法相对滞后，无法及时反映ra患者机体的炎症状态，不利于治疗及康复方案的及时调整。

目前研究发现，肠道菌群失调在类风湿关节炎等自身免疫疾病的发生及发展中起到重要作用。一方面，某些肠道菌种异常增殖与ra的发生密切相关，如prevotellacopri可增加ra发生几率，齿龈卟啉单胞菌可介导瓜氨酸化蛋白的产生，从而促进抗瓜氨酸化蛋白抗体(acpa)的产生，引发对自身抗原的交叉反应；另一方面，肠道中的产丁酸菌，如梭菌属(clostridium)，真杆菌属(eubacterium)，丁酸弧菌(butyrivibrio)，罗斯氏菌(roseburia)及粪杆菌属(faecalibacterium)，通过生成丁酸，促进肠道内免疫平衡。主要表现在以下几个方面：1)丁酸为上皮细胞提供能量来源，参与肠上皮组织细胞再生和修复；2)作为机体的信号分子，可以识别膜受体gpr41、gpr43、gpr109a，进而激活下游的信号通路，影响炎症因子和趋化因子表达；3)激活核受体pparγ，抑制nf-κb信号通路，抑制炎性因子表达；4)诱导treg细胞分化，促进foxp3promoter区乙酰化，上调foxp3表达；5)丁酸抑制树突状细胞和巨噬细胞，抑制th17细胞和th1细胞分化；6)促进紧密连接蛋白表达，促进肠上皮杯状细胞中黏蛋白的表达，保持肠上皮屏障完整；7)低肠道的ph值，有利于肠道益生菌的定植，维持肠道菌群稳态。而同时肠道内也有相当数量的非发酵菌，例如achromobacter，burkholderia，pseudomonas等本身不通过发酵作用产生短链脂肪酸，还可以利用短链脂肪酸(如丁酸等)作为碳源，对肠道内丁酸含量的波动也有一定影响。因此肠道菌群可以间接反映ra患者机体的免疫状态。

同时，肠道中还有一类不能以发酵形式利用葡萄糖的革兰氏阴性杆菌，以假单胞菌属pseudomonas、不动杆菌属acinetobacter、窄食单胞菌属atenotrophomonas等为代表，称之为非发酵菌，通常为条件致病菌。肠道非发酵菌不以碳水化合物为能量来源，也不通过发酵以外的代谢途径进行降解碳水化合物(不产生短链脂肪酸)，而是从各种小分子化合物中获取能量。在肠道中，丁酸等短链脂肪酸可以为这些细菌提供能量来源。

目前，尚未见将肠道产丁酸菌及非发酵菌联合用于类风湿关节炎病情及预后评估方面的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的肠道微生物菌群。

本发明的另一目的是提供一种用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的标志物。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的肠道微生物菌群，所述肠道微生物菌群包括肠道产丁酸菌和肠道非发酵菌两类肠道菌；

其中，所述肠道产丁酸菌包括12个产丁酸菌菌属的微生物，所述肠道非发酵菌包括33个非发酵菌菌属的微生物；

所述12个产丁酸菌菌属为anaerostipes，acetobacterium，clostridium，fusobacterium，megasphaera，treponema，brachyspira，filifactor，butyrivibrio，peptoniphilus，anaerotignum和roseburia；所述33个非发酵菌菌属为achromobacter，burkholderia，pseudomonas，ralstonia，robiginitalea，stenotrophomonas，tenacibaculum，ornithobacterium，cupriavidus，delftia，sphingomonas，variovorax，alcaligenes，gramella，zobellia，curvibacter，gilvibacter，limnohabitans，alicycliphilus，bordetella，roseomonas，polaribacter，paraburkholderia，rhodoferax，hydrogenophaga，flavobacterium，capnocytophaga，azotobacter，nonlabens，ramlibacter，brevundimonas，castellaniella和comamonas。

本发明中所述anaerostipes包括anaerostipeshadrus,anaerostipescaccae；

所述acetobacterium包括acetobacteriumwoodii；

所述clostridium包括clostridiumacetobutylicum,clostridiumbeijerinckii,clostridiumbotulinum,clostridiumbutyricum,clostridiumcarboxidivorans,clostridiumcellulovorans,clostridiumdifficile,clostridiumkluyveri,clostridiumperfringens,clostridiumsaccharobutylicum,clostridiumsaccharoperbutylacetonicum,clostridiumsporogenes,clostridiumsticklandii,clostridiumsymbiosum,clostridiumtetani；

所述fusobacterium包括fusobacteriumgonidiaformans,fusobacteriummortiferum,fusobacteriumnucleatum,fusobacteriumperiodonticum,fusobacteriumulcerans,fusobacteriumvarium；

所述megasphaera包括megasphaeraelsdenii,megasphaeragenomcsp.,megasphaeramicronuciformis；

所述treponema包括treponemaphagedenis,treponemavincentii；

所述brachyspira包括brachyspirahyodysenteriae,brachyspiramurdochii,brachyspirapilosicoli；

所述filifactor包括filifactoralocis；

所述butyrivibrio包括butyrivibriocrossotus,butyrivibriofibrisolvens,butyrivibrioproteoclasticus；

所述peptoniphilus包括peptoniphilusduerdenii,peptoniphilusharei,peptoniphiluslacrimalis；

所述anaerotignum包括anaerotignumpropionicum；

所述roseburia包括roseburiahominis,roseburiaintestinalis,roseburiainulinivorans；

所述achromobacter包括achromobacterdenitrificans，achromobacterxylosoxidans；

所述burkholderia包括burkholderiacenocepacia,burkholderiagladioli,burkholderialata,burkholderiametallica,burkholderiamultivorans,burkholderiaoklahomensis,burkholderiapseudomallei,burkholderialesbacterium；

所述pseudomonas包括pseudomonasaeruginosa,pseudomonasalcaligenes,pseudomonasantarctica,pseudomonasazotoformans,pseudomonasbrassicacearum,pseudomonasbrenneri,pseudomonaschlororaphis,pseudomonascichorii,pseudomonascitronellolis,pseudomonascremoricolorata,pseudomonasextremaustralis,pseudomonasfluorescens,pseudomonasfragi,pseudomonasknackmussii,pseudomonaskoreensis,pseudomonasmendocina,pseudomonasmosselii,pseudomonasoryzihabitans,pseudomonasparafulva,pseudomonaspoae,pseudomonaspseudoalcaligenes,pseudomonaspsychrophila,pseudomonaspsychrotolerans,pseudomonasputida,pseudomonasresinovorans,pseudomonasrhodesiae,pseudomonassabulinigri,pseudomonasstutzeri,pseudomonassynxantha,pseudomonassyringae,pseudomonastolaasii,pseudomonastrivialis,pseudomonasveronii,pseudomonasversuta,pseudomonasviridiflava,pseudomonasxinjiangensis；

所述ralstonia包括ralstoniainsidiosa,ralstoniamannitolilytica,ralstoniapickettii,ralstoniasolanacearum；

所述robiginitalea包括robiginitalea_biformata；

所述stenotrophomonas包括stenotrophomonasacidaminiphila,stenotrophomonasmaltophilia,stenotrophomonasrhizophila；

所述tenacibaculum包括tenacibaculumdicentrarchi,tenacibaculumjejuense；

所述ornithobacterium包括ornithobacteriumrhinotracheale；

所述cupriavidus包括cupriavidusgilardii,cupriavidusmetallidurans,cupriavidusnecator,cupriaviduspinatubonensis,cupriavidustaiwanensis；

所述delftia包括delftiaacidovorans,delftiatsuruhatensis；

所述sphingomonas包括sphingomonaspanacis,sphingomonastaxi；

所述variovorax包括variovoraxparadoxus,variovoraxboronicumulans；

所述alcaligenes包括alcaligenesfaecalis；

所述zobellia包括zobelliagalactanivorans；

所述alicycliphilus包括alicycliphilusdenitrificans；

所述bordetella包括bordetellabronchialis,bordetellagenomosp.13,bordetellagenomosp.9,bordetellahinzii,bordetellaholmesii,bordetellapetrii,bordetellapseudohinzii；

所述roseomonas包括roseomonasgilardii；

所述paraburkholderia包括paraburkholderiacaribensis,paraburkholderiaphymatum,paraburkholderiasprentiae,paraburkholderiaxenovorans；

所述rhodoferax包括rhodoferaxantarcticus,rhodoferaxferrireducens,rhodoferaxsaidenbachensis；

所述hydrogenophaga包括hydrogenophagacrassostreae；

所述flavobacterium包括flavobacteriumcolumnare,flavobacteriumjohnsoniae；

所述capnocytophaga包括capnocytophagahaemolytica,capnocytophagaleadbetteri,capnocytophagasputigena,capnocytophagastomatis；

所述azotobacter包括azotobacterchroococcum,azotobactervinelandii；

所述nonlabens包括nonlabensspongiae；

所述ramlibacter包括ramlibactertataouinensis；

所述brevundimonas包括brevundimonasdiminuta,brevundimonasnaejangsanensis,brevundimonassubvibrioides,brevundimonasvesicularis；

所述castellaniella包括castellanielladefragrans；

所述comamonas包括comamonasaquatica,comamonaskerstersii,comamonasserinivorans,comamonastestosteroni。

第二方面，本发明提供一种用于类风湿关节炎炎症状态评估及预后评价的标志物，所述标志物为机体肠道中的肠道产丁酸菌与肠道非发酵菌总丰度比值(ratio)，

该比值位于12.584±0.071范围内，表明类风湿关节炎有加重风险，该比值低于12.394，评估为类风湿关节炎炎症加重或类风湿关节炎预后不良。

例如，通过对患者粪便进行宏基因组检测，获得产丁酸菌与非发酵菌总丰度比值，即可评估ra的炎症状态及预后情况。具体地，检测方法为粪便16srrna基因扩增子测序或shotgun全基因组测序。

所述评估方法基于以下机制：产丁酸菌及非发酵菌通过影响丁酸净产量影响类风湿关节炎患者免疫状态。第三方面，本发明提供上述标志物ratio在类风湿关节炎诊断及预后评价方面的应用。

在本发明的一个具体实施方式中，纳入40例类风湿关节炎患者和29例健康人样本。抗环瓜氨酸肽抗体是以合成的环化瓜氨酸多肽(ccp)为抗原的自身抗体。抗ccp抗体不仅是ra早期诊断诊断指标，还与疾病严重程度相关，是鉴别侵袭性和非侵袭性ra的灵敏指标。ccp抗体阳性患者比抗体阴性的患者易发展更严重的关节骨质破坏。本发明纳入的40例类风湿关节炎患者，根据血清抗环瓜氨酸抗体情况分为anti-ccp阴性组与anti-ccp阳性组。

通过对样本的肠道菌群进行illumina高通量测序分析发现，12个产丁酸菌菌属acetobacterium，anaerostipes，clostridium，fusobacterium，megasphaera，treponema，brachyspira，filifactor，butyrivibrio，peptoniphilus，anaerotignum，roseburia及33个非发酵菌菌属achromobacter，burkholderia，pseudomonas，ralstonia，robiginitalea，stenotrophomonas，tenacibaculum，ornithobacterium，cupriavidus，delftia，sphingomonas，variovorax，alcaligenes，gramella，zobellia，curvibacter，gilvibacter，limnohabitans，alicycliphilus，bordetella，roseomonas，polaribacter，paraburkholderia，rhodoferax，hydrogenophaga，flavobacterium，capnocytophaga，azotobacter，nonlabens，ramlibacter，brevundimonas，castellaniella，comamonas的丰度比值在抗ccp抗体阴性组患者肠道显著增高(图1)，且与类风湿关节炎的多种临床指标及机体免疫指标显著相关(图2)。

对样本进行代谢物非靶向分析，发现在健康人群中粪便丁酸含量显著高于ra患者，并且在ra人群中，das28≥2.6的患者粪便丁酸含量显著低于das28<2.6的患者(图3)。das28为类风湿关节炎的活动评分，低于2.6代表病情得到缓解。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明首次提出肠道菌群中产丁酸菌与非发酵菌通过产生/消耗肠道丁酸，影响肠道丁酸净产量，从而影响ra的炎症状态及预后。对大样本进行验证，结果表明，通过粪便宏基因组检测，获得产丁酸菌与非发酵菌总丰度比值，即可评估ra的炎症状态及预后情况，且具有较高的敏感性和特异性。另外，肠道菌群与机体免疫状况变化相关，能及时反应机体的炎症状态。传统类风湿疾病活动情况的评估主要通过acr标准(acr20、acr50、acr70)判断，方法基于观察和问卷评分综合判定。这一方法相对生理学改变，比较滞后，对于预后不良的患者而言，这种判断方法相无法及时反映ra患者机体的炎症状态。而基于本发明的检测方法，样本采集便捷，机体无需损伤，并且较高的敏感性，定期检测，可以及早发现机体免疫状态的变化，进行治疗及康复方案的及时调整，避免疾病加重恶化。

附图说明

图1为本发明实施例2中产丁酸菌与非发酵菌丰度及两组菌群丰度比值(ratio)在健康人群、ccp抗体阴性组患者、ccp抗体阳性患者肠道中的差异情况。其中，hc，健康对照组；anti-ccp(-)，ccp抗体阴性组；anti-ccp(+)，ccp抗体阳性组。

图2a为本发明实施例3中肠道产丁酸菌及非发酵菌各属及总丰度比值(ratio)与类风湿关节炎临床指标相关性。其中，esr，红细胞沉降率；crp，c反应蛋白；das28.esr和das28.crp，类风湿关节炎评分；rf，类风湿因子；anti-ccp，抗环状瓜氨酸化多肽抗体；rho>0，正相关；rho<0,负相关；*标注为p-value<0.05；图2b为产丁酸菌与非发酵菌总丰度比值(ratio)与ra各指标线性回归曲线。

图3为本发明实施例4中粪便丁酸在健康人群和ra各组人群中的含量差异。其中，a：短链脂肪酸在健康人群及ra患者粪便中的含量差异。丁酸含量在健康与ra患者肠道中差异显著(p＝0.012)；b：粪便丁酸含量在不同病情程度患者肠道中的差异。das28，类风湿关节炎的活动评分，低于2.6代表病情得到缓解；djc，关节变形情况，djc(-)，关节无变形；djc(+)，关节有变形。c：关节无畸形患者粪便丁酸含量高于关节畸形患者。

图4为本发明实施例5中肠道产丁酸菌与非发酵菌对炎症状态(抗ccp抗体)评估的准确性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1类风湿关节炎抗ccp抗体阴性患者粪便中产丁酸菌富集，抗ccp抗体阳性患者粪便中非发酵菌富集

抗环瓜氨酸肽抗体是以环化瓜氨酸多肽(ccp)为抗原的自身抗体，对类风湿关节炎(ra)具有较高的敏感性和特异性，是ra早期诊断的一个高度特异指标。本实施例中利用illuminahiseq2000高通量测序技术对29例健康人及40例初发未治疗的ra患者(15例ccp抗体阴性，25例ccp抗体阳性)的粪便样本进行宏基因组测序，使用fastqc(version0.11.5)，trimmomatic(version0.33,option:slidingwindow:4:20minlen:40)，fastx-toolkit(version0.0.13,option:-q20-p80)完成低质量数据过滤，利用bwa完成人dna序列过滤，使用prinseq(options-verbose-derep1-derep_min2)去除扩增引起的重复序列。过滤后的序列利用kraken进行物种注释，去除在少于10％样本出现的物种。基于秩和检验筛选各组样本之间差异物种(wilcoxonrank-sumtestp-value≤0.05，fdr≤0.3)，其中抗ccp抗体阳性组(accp+)与抗ccp抗体阴性组(accp-)差异菌群集中在产丁酸菌与非发酵菌这两大类群(表1)。在抗体阴性患者组富集的差异菌群中包含大量产丁酸菌例如clostridium和fusobacterium属的11个菌种(表1，黑色加粗下划线标注)。抗体阳性患者组富集的肠道菌群中包含大量非发酵菌，例如，achromobacter，bordetella，pseudomonas，stenotrophomonas，sphingomonas和variovorax属的19个菌种(表1，黑色加粗斜体标注)。肠道非发酵菌不以碳水化合物为能量来源，也不通过发酵以外的代谢途径进行降解碳水化合物(不产生短链脂肪酸)，而是从各种小分子化合物中获取能量。在肠道中，丁酸等短链脂肪酸可以为这些细菌提供能量来源。因此，非发酵菌可能与肠上皮细胞竞争消耗丁酸。因此推断肠道菌群通过影响肠道内丁酸的净产量对类风湿患者机体炎症状态有重要影响。

实施例2类风湿关节炎轻症患者粪便中产丁酸菌/非发酵菌丰度比值显著增高

根据文献报道及基因组信息，本发明从实施例1收集的样本中检测出具有产丁酸能力的12个菌属anaerostipes，acetobacterium，clostridium，fusobacterium，megasphaera，treponema，brachyspira，filifactor，butyrivibrio，peptoniphilus，anaerotignum，roseburia，以及不能直接利用糖类但可以利用丁酸的非发酵菌33个菌属achromobacter，burkholderia，pseudomonas，ralstonia，robiginitalea，stenotrophomonas，tenacibaculum，ornithobacterium，cupriavidus，delftia，sphingomonas，variovorax，alcaligenes，gramella，zobellia，curvibacter，gilvibacter，limnohabitans，alicycliphilus，bordetella，roseomonas，polaribacter，paraburkholderia，rhodoferax，hydrogenophaga，flavobacterium，capnocytophaga，azotobacter，nonlabens，ramlibacter，brevundimonas，castellaniella，comamonas。对两大类菌群的丰度统计显示，产丁酸菌总丰度中位数在对照组hc(健康人)、ccp抗体阴性组anti-ccp(-)、ccp抗体阳性组anti-ccp(+)三组之间的分布为：ccp抗体阴性组>对照组>ccp抗体阳性组(图1,a)；非发酵菌总丰度中位数在三组之间的分布为：ccp抗体阴性组<对照组<ccp抗体阳性组。上述分布并无显著差异(图1,a)，但ccp抗体阴性患者与ccp抗体阳性患者相比，肠道中产丁酸菌总丰度与非发酵菌总丰度的比值显著增高(图1,c)，这一结果证实肠道菌群可以反映ra患者机体疾病程度，并通过丁酸净产量影响ra的预后程度。

实施例3肠道产丁酸菌及非发酵菌与类风湿关节炎临床指标的相关性

本实施例对所提及的产丁酸菌与非发酵菌各个菌属丰度与ra患者的血沉(esr)、c反应蛋白(crp)、das28.esr、das28.crp、类风湿因子(rf)和抗ccp抗体(anti-ccp)临床指标进行关联分析发现，产丁酸菌属多与ra患者ccp指标之间存在很强的相关性(图2a，表2)，11个产丁酸菌属与类风湿因子(rf)及抗环瓜氨酸肽抗体(anti-ccp)等指示疾病严重程度的临床指标负相关，而非发酵菌与之相反。本发明将产丁酸菌与非发酵菌总丰度的比值(ratio)作为一项指标，与ra患者的临床指标进行关联分析发现，这一特征与所有临床指标均呈现负相关(图2b)，暗示产丁酸菌通过生成丁酸在缓解ra患者炎症方面有潜在作用。菌属丰度与临床指标关联性见表2。

表2菌属丰度与临床指标关联性

实施例4粪便丁酸含量在健康及ra轻症患者中增高

对31例健康人、36例经过两年以上治疗的ra患者(22例关节变形、14例关节无变形)粪便样本中短链脂肪酸含量检测发现，在ra组中丁酸含量显著减少，其它短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、戊酸、异戊酸)含量无明显变化(图3,a)。同时发现，粪便丁酸含量与疾病活动程度(das28)以及关节畸形状况相关。在低疾病活动程度(das28<2.6)的患者中，粪便丁酸含量显著高于中高疾病活动程度(das28≥2.6)患者(图3,b)。关节无畸形患者粪便丁酸含量高于关节畸形患者(图1,c)。这一结果证实了肠道产丁酸菌及其产物丁酸的减少与类风湿关节炎的发生及严重程度态密切相关。

实施例5肠道产丁酸菌及非发酵菌用于预后评估的准确性

以实施例2中抗ccp抗体阴性/阳性两组病人为研究对象，认为抗ccp抗体阴性患者为预后良好、炎症状态水平较低的患者，以肠道中筛选出的差异产丁酸菌和非发酵菌总丰度比值为观察指标，对患者预后及机体炎症状态进行分类预测，经roc分析auc＝0.757，ci:0.5946-0.9201，比值最佳截断值为12.584，预测准确度为75.7％，可用于疾病预后情况以及炎症状态的评估(图4)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。