一种发酵高产大环内酰胺化合物的海洋小单孢菌株及应用的制作方法

本发明属于微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种发酵高产大环内酰胺化合物的海洋小单孢菌株及其应用。
背景技术：
：近年来，肿瘤的发病率及死亡率呈上升趋势，癌症已成为严重危害人类健康的第一杀手。目前，肿瘤的治疗仍以药物治疗为主，因此，抗肿瘤药物的研发具有巨大的市场前景，而不断研究开发新的高效低毒的抗肿瘤药物具有重要意义。微生物资源为创新药物研究提供无穷的源泉，从微生物次生代谢产物中寻找有活性的化合物作为先导化合物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径之一。微生物丰富多样的次生代谢产物为化学药物新药研究与开发提供了大量极为珍贵的模式结构和药物前体小分子，是药物发现源头创新和持续创新的重要物质基础，对整个创新药物的研究具有决定性意义。福建省微生物研究所于2017年首次报道了从海洋小单孢菌fim05-328的微生物次级代谢产物中分离到一个新结构的26元多烯大环内酰胺类化合物fw05328-1(详见中国专利cn107287131a)，并对化合物fw05328-1的结构进行鉴定，以及对化合物fw05328-1的生物活性进行初步研究。研究发现，该大环内酰胺化合物fw05328-1是一个新结构的化合物，其在体外对人食管鳞癌细胞株kyse30、kyse180、ec109具有优良的抑制活性，对人食管鳞癌细胞株ec109的抑制活性尤为突出，与结构相似物salinilactama及药物顺铂相比，其抑制活性分别是salinilactama的165倍、顺铂的95倍，使其成为具有较好研究前景的抗肿瘤药物先导物。但是，fw05328-1作为新结构化合物，在该化合物的在先研究中，仅限于对摇瓶发酵工艺的初步发酵研究，且其整体发酵效价极低，对后续提取工艺极为不利，难以应用于大规模发酵生产。现有研究中尚无关于大环内酰胺化合物fw05328-1规模化发酵生产工艺的研究及报道，为其后续应用造成了极大的限制。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一株发酵高产大环内酰胺化合物fw05328-1的海洋小单孢菌株，以解决现有技术中fw05328-1化合物的发酵产量较低的问题；本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用上述菌株发酵生产大环内酰胺化合物fw05328-1的方法。为解决上述技术问题，本发明所述的一种海洋小单孢菌菌株，其分类命名为micromonosporasp.fim-ma181224，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.17139。本发明所述海洋小单孢菌是以保存的海洋小单孢菌fim05-328(详见中国专利cn107287131a，保藏编号为cgmccno.13933)为出发菌株进行多轮诱变获得。本发明还公开了所述的海洋小单孢菌株在发酵生产大环内酰胺化合物中的应用。具体的，所述大环内酰胺化合物包括具有如下结构的化合物fw05328-1：本发明还公开了一种发酵生产大环内酰胺化合物fw05328-1的方法，即包括将所述的海洋小单孢菌接种于适宜发酵培养基中进行发酵培养的步骤。具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉0.8-1.2％，蛋白胨0.4-0.7％，黄豆饼粉0.15-0.30％，酵母粉0.15-0.25％，k2hpo4·3h2o0.03-0.06％，caco30.08-0.12％，海盐0.8-1.2％，调ph值6.2-6.8。优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.5％，黄豆饼粉0.25％，酵母粉0.2％，k2hpo4·3h2o0.05％，caco30.1％，海盐1％，自来水配制，调ph值为6.6。具体的，所述发酵培养步骤的条件为：以2.0-4.0％的接种量将种子液进行接种，控制罐压0.02-0.04mpa，控制转速200-240r/min，通气0.8-1.2vvm，于26-30℃进行发酵培养5-7d。优选的，所述发酵培养步骤的条件为：以2.0％的接种量进行接种，控制罐压0.03mpa，发酵前期控制转速200r/min，通气1.0vvm，随着菌丝的增长，当菌浓达到7％时，提高转速至220r/min，并根据发酵过程中do参数及菌丝生长的的变化，逐步提高转速至240r/min。具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉0.4-0.8％，蛋白胨0.4-0.8％，豆粕0.3-0.6％，酵母粉0.2-0.5％，k2hpo4·3h2o0.03-0.06％，caco30.08-0.12％，海盐1.4-2.0％，自来水配制，调ph值ph7.0-7.4。优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：玉米淀粉0.6％，蛋白胨0.5％，豆粕0.5％，酵母粉0.3％，k2hpo4·3h2o0.05％，caco30.10％，海盐1.6％，自来水配制，调ph值为ph7.2。具体的，所述种子液培养步骤包括摇瓶种子液培养及种子罐培养步骤；所述摇瓶种子液培养步骤条件为：将新鲜斜面挖块接入所述种子培养基，于27-29℃、控制转速200-240r/min培养68-80h得到摇瓶种子培养液；优选的，所述摇瓶种子液的培养步骤为：将培养好的新鲜斜面按0.5cm×0.5cm挖块接入种子培养基，28℃、220r/min培养72h得到摇瓶种子培养液。所述种子罐种子液培养步骤条件为：将培养好的摇瓶种子培养液以1.5-2.5％的接种量接种到含所述种子培养基的种子罐中，控制温度27-29℃，罐压0.02-0.04mpa，控制转速200-240r/min，发酵40-56h得到种子液。优选的，所述种子罐的培养步骤为：将培养好的摇瓶种子以2.0％的接种量接种于种子罐中，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟。具体的，所述方法还包括将所述菌株接种于高氏天冬素固体斜面培养基进行活化培养的步骤，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉1.5-3.5％，l-天冬素0.04-0.06％，kno30.08-0.12％，k2hpo4·3h2o0.04-0.06％，nacl0.04-0.06％，mgso4·7h2o0.04-0.06％，caco30.08-0.12％，琼脂1-2％，调ph值ph7.0-7.4。优选的，所述固体斜面培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2.0％，l-天冬素0.05％，kno30.1％，k2hpo4·3h2o0.05％，nacl0.05％，mgso4·7h2o0.05％，caco30.1％，琼脂1.5％，调ph值7.2。本发明通过对现有发酵产大环内酰胺化合物fw05328-1的海洋小单孢菌株fim05-328进行诱变育种，获得一株能够高产大环内酰胺化合物fw05328-1的突变株micromonosporasp.fim-ma181224。该菌株能有效提高发酵液中化合物fw05328-1的含量，在10l-500l发酵罐的发酵实验中，micromonosporasp.fim-ma181224发酵产生化合物fw05328-1的效价达到249.8mg/l，与原始菌株fim05-328的发酵效价相比，大幅度提高了大环内酰胺化合物fw05328-1的产生能力，有利于后续fw05328-1化合物的样品制备工作及后续药效研究，并为fw05328-1的工业化生产和后续临床推广提供了有利支持。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1为本发明突变株micromonosporasp.fim-ma181224在高氏天冬素固体斜面上35℃培养7d的电镜扫描图；图2为本发明突变株micromonosporasp.fim-ma181224的500l发酵罐的发酵曲线图。具体实施方式本发明下述实施例中，对于发酵液中大环内酰胺化合物fw05328-1的含量检测采用现有技术中已知的hplc-dad方法，具体包括：shimadzulc-20ad高效液相色谱仪，配spd-m20a二极管阵列检测器(dad)，odsc18分析柱(250mm×4.6mm，φ5μm)，控制柱温50℃，乙腈-水5％-100％梯度洗脱40min，流速1ml/min。实施例1菌株的诱变育种本实施例说明海洋小单孢菌micromonosporasp.fim-ma181224的诱变育种方法包括如下步骤：(1)单孢子菌悬液制备：出发菌株fim05-328(详见中国专利cn107287131a，保藏编号cgmccno.13933)接种于高氏天冬素固体培养基35℃培养15d，得到培养成熟的新鲜斜面。在培养成熟的斜面中加入适量生理盐水，用接种铲轻轻刮下菌体，倒入带有玻璃珠的无菌摇瓶振荡打散后过滤，即得到单孢子菌悬液；(2)co60诱变将制备好的fim05-328单孢子菌悬液2ml置于指形管中接受co60辐射，辐射剂量分别为300、500、800、1000gy，剂量率为900rad/min。辐射后的菌悬液梯度稀释后涂布于高氏天冬素平板上，35℃培养15d，观察菌落生长形态，计算致死率。培养好的平板用于菌种筛选；(3)uv诱变将制备好的fim05-328单孢子菌悬液10ml置于无菌平皿中在紫外灯(30w、距离30cm)下分别照射20、40、60、80、100、120s，照射后的菌悬液经梯度稀释后涂布于高氏天冬素平板上，35℃避光培养15d，观察菌落生长形态，计算致死率。培养好的平板用于菌种筛选；(3)常压室温等离子体(artp)诱变设置artp诱变育种仪的工作功率为110w，工作气体为氦气，工作气流量10l/min，处理距离2mm。在无菌环境内取10μl单孢子菌悬液涂于无菌金属载片上，使菌液在载片表面均匀铺开。将涂好菌悬液的金属载片置于artp诱变育种仪中进行处理，处理时间分别为0、30、60、90、120、150、180s，诱变处理后的金属载片放置于1ml无菌生理盐水中，在旋涡振荡器上振荡约1min将附着于载片上的孢子洗脱至生理盐水中，得到新的孢子菌悬液。新的菌悬液梯度稀释后涂布于高氏天冬素平板上，35℃培养15d，观察菌落生长形态，计算致死率。培养好的平板用于菌种筛选；(4)fw05328-1高产突变菌株的筛选以上述方法对出发菌株fim05-328进行多轮诱变及复合诱变，诱变后挑取平板上的单菌落以高氏天冬素固体培养基进行培养，培养成熟后的菌株在摇瓶上发酵进行初筛工作，以hplc方法测定发酵培养基中fw05328-1的含量，获得fw05328-1生产能力较高的数十株菌株。对该数十株菌株在摇瓶上进行复筛工作，进一步验证菌株发酵产生化合物fw05328-1的能力，获得一株fw05328-1高产菌株，其编号为fim-ma181224，命名为micromonosporasp.fim-ma181224，该菌株的电镜扫描图见图1所示。筛选的高产菌株micromonosporasp.fim-ma181224经斜面连续传代5代，fw05328-1发酵效价未发现显著变化。将该菌保存于25℃，每30天进行摇瓶发酵验证，实验结果表明，突变株fim-ma181224在5个月内发酵产生fw05328-1的能力未发现显著变化。以上结果表明突变株fim-ma181224发酵产生fw05328-1的能力高，且遗传性状稳定，适应于工业化生产。将诱变筛选得到的高产突变株micromonosporasp.fim-ma181224保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为cgmccno.17139，保藏日期为2019年01月07日。实施例2出发菌株fim05-328及突变株fim-ma181224摇瓶发酵对比分别将海洋小单孢菌fim05-328及突变株fim-ma181224于高氏天冬素固体培养基上35℃培养15d，得到海洋小单孢菌fim05-328及突变株fim-ma181224的新鲜斜面。将海洋小单孢菌fim05-328及突变株fim-ma181224的新鲜斜面挖块(0.5cm×0.5cm)接种于摇瓶种子培养基，于28℃、220r/min培养72h得到摇瓶种子，将摇瓶种子按4％接种量接种于摇瓶发酵培养基，于28℃、220r/min培养6d后放瓶，经hplc法测定发酵液中fw05328-1含量。种子培养基配制方法：玉米淀粉6g，蛋白胨5g，豆粕5g，酵母粉3g，k2hpo4·3h2o0.5g，caco31g，海盐16g，自来水1l，调ph值为ph7.2。发酵培养基配制方法：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2g，k2hpo4·3h2o0.5g，caco31g，海盐10g，自来水1l，调ph值为ph6.6。摇瓶发酵放瓶后，经hplc法测定出发菌株fim05-328及突变株fim-ma181224发酵液中fw05328-1含量。结果如表1所示。表1出发菌株fim05-328及突变株fim-ma181224发酵效价菌株编号fim05-328fim-ma181224发酵效价(mg/l)2.3125.8从上表数据可知，出发菌株fim05-328在摇瓶上发酵产生化合物fw05328-1的效价为2.3mg/l，而突变株fim-ma181224摇瓶发酵效价为125.8mg/l，其发酵产生化合物fw05328-1的能力较出发菌株提高约55倍。实施例3突变株fim-ma181224在10l发酵罐上发酵将培养好的摇瓶种子以2.5％的接种量接种到10l发酵罐中，发酵罐培养基装量7l，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，发酵0-48h控制转速200r/min，通气量为1：1.0vvm，随着菌丝的增长，发酵约48h后菌浓达到7％时，提高转速至220r/min，通气量调整至1：1.2vvm，发酵90h后根据发酵过程中do参数及菌丝生长的变化，再逐步提高转速至240r/min，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌2ml，发酵144h时发酵终止进行放罐。摇瓶种子制备方法与实施例2相同。发酵培养基配制方法：可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，黄豆饼粉2.5g，酵母粉2g，k2hpo4·3h2o0.5g，caco31g，海盐10g，泡敌0.3g，自来水1l，调ph值为ph6.6。发酵过程通过hplc检测发酵液中化合物fw05328-1的含量，发酵终止时发酵效价为150.6mg/l。实施例4突变株fim-ma181224在100l发酵罐上发酵本实施例的发酵过程同实施例3，其区别在于，在100l发酵罐中培养基装量为70l，接种量为2.0％，以种子罐培养好的种子液按2.0％的接种量接到100l发酵罐中，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌20ml。种子罐培养方法：将培养好的摇瓶种子以2.0％的接种量接种到10l发酵罐中，种子罐装液量7l，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟。摇瓶种子制备方法与实施例2一致。发酵过程通过hplc检测发酵液中化合物fw05328-1的含量，发酵终止时发酵效价为249.8mg/l。实施例5突变株fim-ma181224在500l发酵罐上发酵本实施例的发酵过程同实施例4，其区别在于，在500l发酵罐中装液量为350l，接种量为2.0％，以种子罐培养好的种子以2.0％的接种量接到500l发酵罐中，发酵48-72h内发酵罐内培养基起泡时补加泡敌100ml。其区别还在于种子罐培养方法：将培养好的摇瓶种子以2.5％的接种量接种到20l发酵罐中，种子罐装液量14l，发酵温度28℃，罐压0.03mpa，发酵期间控制转速220r/min，发酵48h种子罐培养成熟，发酵过程曲线如图2所示。摇瓶种子制备方法与实施例2一致。发酵过程通过hplc检测发酵液中化合物fw05328-1的含量，发酵终止时发酵效价为243.2mg/l。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12