蜡样芽孢杆菌发酵培养基和提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是蜡样芽孢杆菌发酵培养基和提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法。

背景技术：

南方水稻种植期间害虫轮流发生，以稻飞虱、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟的危害性最大，为了降低水稻害虫的发生率，防止化学农药的滥用，开发新型的生物农药是解决手段之一。与传统的化学农药相比，生物农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，易于保护生物多样性，来源广等优点。因此，高效生物农药的开发应用对人类健康，环境保护和农业的可持续发展都有极其重大的意义。目前中药植物源农药已成为生物合理性农药研究开发的热点之一。中药植物中的豆科是我国三大植物源农药资源之一，豆科植物具有黄酮类化合物、生物碱类化合物、杀虫凝集素等杀虫活性成分中。所以有必要分离豆科植物内生菌寻找新的生物农药资源。

南药水黄皮(pongamiapinnata(linn.)pierre)为豆科水黄皮属植物，也是一种典型的半红树植物，《中华本草》中记载，秋季果实成熟时采收，打下水黄皮种子晒干，味苦性寒小毒，可祛风除湿，解毒杀虫，主治风湿痹痛、癣疥、脓疮。蜡样芽孢杆菌(seb3)是从水黄皮种子部位分离获得的一株对水稻害虫稻纵卷叶螟(cnaphalocrocismedinalisguenee)具有较强杀虫活性的菌株，经16srdna序列系统发育学分析，将进行该菌株鉴定为腊样芽胞杆菌(b.cereus)。

要将蜡样芽胞杆菌seb3开发成商业化的新型生物杀虫剂产品，首先要解决菌株大量繁殖难的问题，同时确保其代谢产物杀虫活性保持在较高水平，为进一步实现seb3研发成高效、广谱、无公害、低成本的新型生物杀虫剂打下基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌发酵培养基，解决菌株大量繁殖难的问题；本发明还提供一种提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法，确保蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质的活性保持在较高水平。

为解决上述蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题，本发明提供一种蜡样芽孢杆菌发酵培养基，由以下组分制成：

碳源、氮源、无机盐和纯水；

所述碳源为废糖蜜，或者玉米淀粉和废糖蜜的混合物；

所述氮源为酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨、氯化铵中的一种或几种的混合物；

所述无机盐为氯化钠；所述发酵培养基的ph值范围为5.5～8.0。

作为本发明优选的一种蜡样芽孢杆菌发酵培养基由以下质量比的组分制成：2％废糖蜜、0.5～1.5％牛肉膏、0.5％氯化钠以及余量的纯水；所述发酵培养基的ph值为6.5～7.5。

优选的，所述发酵培养基的ph值为7.0。

作为本发明优选的一种蜡样芽孢杆菌发酵培养基由以下质量比的组分制成：2％废糖蜜和玉米淀粉的混合物、1％牛肉膏、0.5％氯化钠以及余量的纯水，所述废糖蜜和玉米淀粉的质量比为1:1，所述发酵培养基的ph值为6.5～7.5。

作为本发明优选的一种蜡样芽孢杆菌发酵培养基由以下质量比的组分制成：2％废糖蜜、1％酵母浸出物和蛋白胨的混合物、0.5％氯化钠以及余量的纯水，所述酵母浸出物和蛋白胨的质量比为1:1，所述发酵培养基的ph值为6.5～7.0。

蜡样芽孢杆菌发酵产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性用单位体积的蜡样芽孢杆菌培养液杀死的稻纵卷叶螟的死亡率来表示，单位体积的蜡样芽孢杆菌培养液杀死的稻纵卷叶螟的死亡率越高，则蜡样芽孢杆菌发酵产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性越高。

本发明的优点：本发明的蜡样芽孢杆菌发酵培养基选用能够为蜡样芽孢杆菌的生长提供充足营养的碳源和氮源，使得蜡样芽孢杆菌能够更好更快地生长繁殖，提高了蜡样芽孢杆菌的活菌数量，达到5.73×10⁹cfu·ml^-1～7.15×10⁹cfu·ml^-1，解决蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题。

为解决上述蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟活性物质的杀虫活性保持在较高水平的问题，本发明提供一种提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法，包括以下步骤：

①菌种的活化：将保存的蜡样芽孢杆菌的菌种转接到斜面培养基，37℃培养24小时，备用；

②种子液的制备：在250ml的三角瓶中接入装液量为50ml的种子培养基，加入步骤①中完成活化的菌种，在培养温度37℃、转速180r/min条件下培养18小时；

③摇瓶培养：分别取1ml步骤②中完成培养的种子液，接入盛有50ml发酵培养基的200ml的三角瓶中，置摇床中，在培养温度为30℃、转速为160r/min条件下振荡培养12～24小时。

作为本发明的优选，步骤③中的培养时间为18～22小时。

作为本发明的优选，步骤③中摇瓶培养的初始ph值为6.5～7.5。

作为本发明的优选，步骤③中摇瓶培养的温度为35～42℃。

作为本发明的优选，步骤③中所述种子液的接种量为5％～9％，所述三角瓶的装液量为20％～40％。

本发明的提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质的活性的发酵方法有以下优点：本发明的提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质的活性的发酵方法通过对蜡样芽孢杆菌培养的条件进行筛选，然后通过比较各个条件下对于稻纵卷叶螟的死亡率的影响，确定提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法，在本方法中确定了适宜蜡样芽孢杆菌产出杀灭稻纵卷叶螟的物质的活性各个条件，确保生产的蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质的活性保持在较高水平，使得蜡样芽孢杆菌产的物质杀灭稻纵卷叶螟的死亡率保持在62％～95.8％。

【附图说明】

图1为实施例34的培养时间对蜡样芽孢杆菌生物量的影响图。

图2为实施例34的培养时间对稻纵卷叶螟死亡率影响图。

图3为实施例35至40的初始ph对蜡样芽孢杆菌生物量影响图。

图4为实施例35至40的初始ph对稻纵卷叶螟死亡率影响图。

图5为实施例41至45的培养温度对蜡样芽孢杆菌生物量影响图。

图6为实施例41至45的培养温度对稻纵卷叶螟死亡率的影响图。

图7为实施例46至50的装液量对蜡样芽孢杆菌生物量的影响图。

图8为实施例46至50的装液量对稻纵卷叶螟死亡率的影响图。

图9为实施例51至55的接种量对蜡样芽孢杆菌生物量的影响图。

图10为实施例51至55的接种量对稻纵卷叶螟死亡率的影响图。

【具体实施方式】

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例。本发明用到的材料与试验方法

1.1、材料

1.1.1蜡样芽孢杆菌的菌株(seb3)采自广东中山林海滩涂树林中纯水黄皮种子，供试验用昆虫来自广东省农业科学院植物保护研究所提供的生长7天的稻纵卷叶螟。

1.1.2培养基

种子培养基(w/v)：蛋白胨1％、酵母浸出物0.5％、氯化钠1％，自然ph值。基础发酵培养基(w/v)：蔗糖1％、蛋白胨1％、磷酸氢二钠0.2％、磷酸二氢钠0.2％，ph值7.0。

1.1.3主要试剂

碳源：废糖蜜、蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖；

氮源：酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵；

无机盐：硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠、氯化钙；纯水。

1.1.4仪器设备

c1000touchpcr仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)，allegrax-15r台式冷冻离心机(贝克曼库尔特公司)，innova44r摇床(美国nbs)，旋转蒸发仪re-52(上海赛墨科技生物发展有限公司)，precision高性能微生物培养箱(赛默飞世尔科技中国有限公司)，超低温冰箱(美国thermo)，zhs-100ch恒温培养箱(上海喆图)，高压蒸汽灭菌锅(三洋mls-3750)。

上述培养基、试剂与仪器均为可通过市售购买获得的常规产品。

1.2方法

1.2.1培养方法

①菌种活化：将保存的蜡样芽孢杆菌的菌种转接到斜面培养基上，37℃培养24小时，备用。

②种子液的制备：在250ml的三角瓶中接入装液量为50ml的种子培养基，加入一环活化即步骤①完成活化培养的菌种，在37℃、转速180r/min条件下培养18小时。

③摇瓶培养：分别取1ml步骤②中完成培养的种子液，接入盛有50ml基础发酵培养基的200ml的三角瓶中，置摇床中，在培养温度为30℃、转速为160r/min条件下振荡培养12小时。

1.2.2测定方法

活菌总数测定采用稀释平板计数法；菌体生长曲线的测定采用比浊法，测定菌液的od600nm；ph值测定仪测定菌液ph值。

发酵液毒力检测使用浸渍处理法，将发酵液浓缩20倍，再与灭菌水按7:20的比例混和稀释成待用药液，在一次性饮用塑料杯中装入待用药液10ml，用吸管接入刚进入成熟期不超过48h的稻纵卷叶螟30头，每个杯子为一个处理，每个处理重复3次，同时设无菌培养液为对照，24h后调查死亡虫数，计算死亡率。

1.2.3统计分析本文所有统计分析均用sas9.4软件完成(sasinstituteinc.2014)。

本发明采用单因素和正交试验研究蜡样芽孢杆菌发酵培养的物质基础，即确定适合蜡样芽孢杆菌发酵培养基适于蜡样芽孢杆菌繁殖的最佳碳源、氮源、无机盐等营养物质的条件，进而提供一种适于蜡样芽孢杆菌繁殖的发酵培养基。

实施例1至7：碳源，分别用废糖蜜、玉米淀粉、废糖蜜和玉米淀粉(废糖蜜与玉米淀粉的质量比为1:1)、1％的葡萄糖溶液、可溶性淀粉、麦芽糖等量替代培养方法1.2.1的基础发酵培养基中的蔗糖，其他成分不变，制成蜡样芽孢杆菌培养基，然后用制得的蜡样芽孢杆菌培养基取代培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中的基础发酵培养基进行发酵培养，12小时后测定发酵液中的活菌含量，记录在表1中，以确定最佳碳源。

表1：不同碳源培养结果表

注：活菌数单位：10⁹cfu·ml^－1

从表1从可以得出，实施例2采用废糖蜜作为碳源制作的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量最高，达到6.82×10⁹cfu·ml^－1，废糖蜜最适合作为蜡样芽孢杆菌培养基的碳源；其次为实施例3采用废糖蜜和玉米淀粉的混合物[m(废糖蜜):m(玉米粉)＝1:1]作为碳源制作的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量较高，达到6.35×10⁹cfu·ml^－1，也较适合作为蜡样芽孢杆菌培养基的碳源；选用实施例2和实施例3的碳源制作的培养基可以提高蜡样芽孢杆菌活菌数量，从而便于解决蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题。

实施例8至15：氮源，分别用1％的酵母浸出物、牛肉膏、1％尿素、氯化铵、酵母浸出物和蛋白胨的混合物(酵母浸出物和蛋白胨的质量比为1:1)、酵母浸出物和蛋白胨以及氯化铵的混合物(酵母浸出物和蛋白胨以及氯化铵的质量比为2:2:1)、酵母浸出物和蛋白胨以及尿素的混合物(酵母浸出物和蛋白胨以及尿素的质量比为2:2:1)等量替代培养方法1.2.1的基础发酵培养基中的蛋白胨，其他成分不变，制成蜡样芽孢杆菌培养基，然后用制得的蜡样芽孢杆菌培养基取代培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中的基础发酵培养基进行发酵培养，12小时后测定发酵液中的活菌含量，记录在表2中，以确定最佳氮源。

表2：不同氮源培养结果表

注：活菌数单位：10⁹cfu·ml^－1

从表2可以得出，蜡样芽孢杆菌在有机氮源中的生长与发酵均明显优于无机氮源，利用有机氮源发酵后，蜡样芽孢杆菌活菌数在5.36×10⁹cfu·ml－1以上。实施例8采用1％的牛肉膏作为氮源制作的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量最高，蜡样芽孢杆菌活菌数达到5.73×10⁹cfu·ml^-1。其次为实施例9采用酵母浸出物、蛋白胨和氯化铵的混合物(酵母浸出物和蛋白胨以及氯化铵的质量比为2:2:1)作为氮源制作的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量较高，蜡样芽孢杆菌活菌数达到5.51×10⁹cfu·ml^-1。接着为实施例10采用酵母浸出物和蛋白胨的混合物(酵母浸出物和蛋白胨的质量比为1:1)作为氮源制作的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量高，蜡样芽孢杆菌活菌数达到5.48×10⁹cfu·ml^-1；选用实施例8、实施例9和实施例10的氮源制作的培养基可以提高蜡样芽孢杆菌活菌数量，从而便于解决蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题。

实施例16至23：无机盐，分别用0.5‰的硫酸锰、0.4％的硫酸锰、0.4％的硫酸镁、0.4％的硫酸亚铁、0.4％的氯化钠、0.4％的氯化钙替代培养方法1.2.1的基础发酵培养基中的磷酸二氢钠(0.2％)和磷酸氢二钠(0.2％)，其他成分不变，制成蜡样芽孢杆菌培养基，然后用制得的蜡样芽孢杆菌培养基取代培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中的基础发酵培养基进行发酵培养，12小时后测定发酵液中的活菌含量，记录于表3中，以确定最适于蜡样芽孢杆菌繁殖的无机盐。

表3：不同无机盐培养结果表

注：活菌数单位：10⁹cfu·ml^－1

从表3可以得出，实施例18为不加无机盐制作的蜡样芽孢杆菌培养基，做空白对照组，其蜡样芽孢杆菌活菌数为4.77×10⁹cfu·ml^-1，而添加无机盐的蜡样芽孢杆菌培养基，其活菌数均在4.77×10⁹cfu·ml^-1左右，钠、镁、铁、钙和低浓度的锰离子对蜡样芽孢杆菌升温生长与发酵影响不大，因此选用蜡样芽孢杆菌活菌数较高的nacl作为适合蜡样芽孢杆菌生长的蜡样芽孢杆菌培养基的无机盐；。

实施例24至32：在实施例2的蜡样芽孢杆菌培养基成分：1％废糖蜜、1％蛋白胨、0.2％磷酸氢二钠、0.2％磷酸二氢钠及余量纯水的基础上，将废糖蜜选取1％、2％、3％三个水平；将实施例2的蜡样芽孢杆菌培养基成分1％蛋白胨用牛肉膏替代，选取0.5％、1％、1.5％三个水平；将实施例2的蜡样芽孢杆菌培养基成分0.2％磷酸氢二钠、0.2％磷酸二氢钠用氯化钠替代，分别选取0.1％、0.3％、0.5％三个水平，按照表4所示的营养成分比正交配制实施例24至32的蜡样芽孢杆菌培养基，然后用制得的蜡样芽孢杆菌培养基取代培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中的基础发酵培养基进行发酵培养，12小时后测定发酵液中的蜡样芽孢杆菌活菌含量，记录于表4中，以筛选最适合蜡样芽孢杆菌生长的培养基，并将统计结果进行分析。

表4：蜡样芽孢杆菌培养基成分正交培养试验结果统计表

注：活菌数单位：10⁹cfu·ml^－1。

i1为第一列中对应水平的活菌数的数据和；i2为第二列中对应水平的活菌数的数据和；i3为第三列中对应水平的活菌数的数据和；

k1为1水平上活菌数数据的综合平均；k2为2水平上活菌数数据的综合平均；k3为3水平上活菌数数据的综合平均；r为为该因素的极差。

由表4可知，最适宜蜡样芽孢杆菌生长的蜡样芽孢杆菌培养基为实施例28的蜡样芽孢杆菌发酵培养基，由2％废糖蜜、1％牛肉膏、0.5％氯化钠和余量的水组成，培养得到的蜡样芽孢杆菌活菌数最高，达到7.15×10⁹cfu·ml^-1；然后较适合蜡样芽孢杆菌生长的蜡样芽孢杆菌培养基为是实施例29的蜡样芽孢杆菌发酵培养基，由2％废糖蜜、1.5％牛肉膏、0.1％氯化钠和余量的水组成，培养得到的蜡样芽孢杆菌活菌数较高，达到6.4×10⁹cfu·ml^-1；接着适合蜡样芽孢杆菌生长的蜡样芽孢杆菌培养基为是实施例27的蜡样芽孢杆菌发酵培养基，由2％废糖蜜、0.5％牛肉膏、0.3％氯化钠和余量的水组成，培养得到的蜡样芽孢杆菌活菌数高，达到6.33×10⁹cfu·ml^-1；实施例28、实施例29、实施例27的蜡样芽孢杆菌培养基，使得蜡样芽孢杆菌活菌数都维持在较高的数量，即在6.0×10⁹cfu·ml^-1以上，从而便于解决蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题。

将表4中蜡样芽孢杆菌培养结果进行极差分析，分析结果见表5。

表5：蜡样芽孢杆菌的菌体增长情况正交试验方差分析表

注：f0.05(2,2)＝19.0,f0.01(2,2)＝99.0，前式表示f值和在自由度为(2,2)下，显著性水平分别为0.05和0.01下的f值

由表5的极差分析可知，各因子对活菌数产量影响大小为：废糖蜜>氯化钠>牛肉膏，对正交试验的方差分析表明，废糖蜜为极显著差异，氯化钠为显著差异，牛肉膏为不显著差异，因此，氮源(牛肉膏)可以取0.5～1.5％的浓度进行发酵，从而解决蜡样芽孢杆菌菌株大量繁殖难的问题。

实施例33：本实施例的蜡样芽孢杆菌培养基，由以下质量比的组分制成：2％废糖蜜和玉米淀粉的混合物、1％牛肉膏、0.5％氯化钠以及余量的纯水，所述废糖蜜和玉米淀粉的质量比为1:1，所述发酵培养基的ph值为6.5～7.5，用制得的蜡样芽孢杆菌培养基取代培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中的基础发酵培养基进行发酵培养，测得发酵培养12小时后本实施例的蜡样芽孢杆菌培养基培养的蜡样芽孢杆菌活菌数量达到6.85×10⁹cfu·ml^-1。由于废糖蜜成本较高，因此需要在不影响蜡样芽孢杆菌大量繁殖的前提下进一步降低培养的成本。由实施例3可知，用废糖蜜和玉米淀粉的混合物作为碳源制作的蜡样芽孢杆菌培养基，也可以使蜡样芽孢杆菌大量繁殖。与废糖蜜作相比，玉米淀粉的成本较低，本实施例的蜡样芽孢杆菌培养基采用废糖蜜和玉米淀粉的混合物可以降低一部分材料成本。

实施例1至33通过单因素和正交试验法来研究提供适于蜡样芽孢杆菌繁殖的芽孢杆菌繁殖培养基，以达到使蜡样芽孢杆菌能够更好更快地生长繁殖的目的，提高蜡样芽孢杆菌的活菌数量，使蜡样芽孢杆菌的活菌数达到5.73×10⁹cfu·ml^-1～7.15×10⁹cfu·ml^-1，解决菌株大量繁殖难的问题。

实施例34：将蜡样芽孢杆菌在35℃、220r/min条件下经500ml摇瓶液体发酵培养，摇瓶培养时选用实施例28的最适宜蜡样芽孢杆菌繁殖的蜡样芽孢杆菌发酵培养基取代基础发酵培养基，每隔2小时取发酵液，测定菌液的od600nm，培养24小时计菌落总数，绘制生长曲线，同时做发酵液毒力测试，如附图1所示，蜡样芽孢杆菌在6小时之后进入快速生长期，22小时达到平台期。在实际生产过程中应按照蜡样芽孢杆菌的生长特点进行控制，如果要发酵种子液，可以选择在快速生长后期18小时的发酵产物做种子，而大规模发酵生产则可以在22小时进行二次投料，以期获得更大的蜡样芽孢杆菌生物量，如附图2所示，稻纵卷叶螟的死亡率在蜡样芽孢杆菌的迟缓期、对数生长期和稳定期是不断升高的，在22小时达到88.3％，之后开始降低，这与蜡样芽孢杆菌的生长曲线规律基本一致。在大规模发酵培养12～24小时时段内蜡样芽孢杆菌发酵产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性较高，而18～22小时时段内蜡样芽孢杆菌发酵产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性处于最高范围内，与此相对应的蜡样芽孢杆菌发酵产生的物质杀灭稻纵卷叶螟的死亡率为83％～88.3％，优选22小时左右时段的蜡样芽孢杆菌发酵产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性最高，杀灭稻纵卷叶螟的死亡率达到88.3％。

实施例35至实施例40：ph主要通过影响菌体细胞膜电荷、膜渗透性以及营养物质离子化程度，影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中的ph难以控制，只能控制发酵液的初始ph。在实施例34的基础上，将培养方法1.2.1的步骤③摇瓶培养中将摇瓶内的培养物质的初始ph值分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在摇瓶发酵培养条件下培养22小时，然后用稀释平板计数法测其活菌数，同时测定发酵液毒力，按照初始ph值由小到大依次为实施例35至40。如附图3和附图4所示，初始ph值在5.5～8.0范围内蜡样芽孢杆菌均生长良好，说明蜡样芽孢杆菌对ph值的适应性较宽，其中初始ph值在6.5～7.5范围内蜡样芽孢杆菌活菌数较多，其对应的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性也处于一个较高的范围，与此相对应的蜡样芽孢杆菌发酵产生的物质杀灭稻纵卷叶螟的死亡率为83％～90.2％，实施例39的初始ph值为7.5时蜡样芽孢杆菌活菌数最多，而发酵液的毒力实验结果显示，在实施例38的初始ph值为7.0时稻纵卷叶螟的死亡率达到90.2，之后呈快速下降趋势。所以综合考虑蜡样芽孢杆菌生长特点及发酵液杀虫活性物质的产量，确定发酵初始ph值为7.0，即摇瓶内的培养物质初始ph为7.0时，蜡样芽孢杆菌发酵产的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性最高，杀灭稻纵卷叶螟的死亡率达到90.2％。

实施例41至45：温度主要通过改变酶反应速率来影响菌体的生长。一般培养基温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快。酶容易因过热而失去活性，表现为菌体容易衰老，影响最终产量。以实施例28和实施例38为基础，选取25、30、35、40、45℃作为摇床温度分别测定不同温度对发酵液活菌数的影响，在摇瓶发酵培养条件下培养22h，用稀释平板计数法测其活菌数，同时做发酵液毒力测试，按照温度由低到高分别为实施例41至45。如附图5和附图6所示，蜡样芽孢杆菌在25～40℃即实施例41至44的培养条件下均可良好生长，且活菌数随培养温度的升高呈缓慢增加趋势，较适宜的培养温度范围为35～42℃，与此相对应的蜡样芽孢杆菌发酵产生的物质杀灭稻纵卷叶螟的死亡率为80％～93.1％，45℃时活菌数明显降低，40℃时蜡样芽孢杆菌的活菌数最高，而发酵液的毒力实验表明稻纵卷叶螟的死亡率也是在实施例44的培养温度40℃时达到93.1％，所以在摇瓶培养最优发酵的培养温度为40℃时，蜡样芽孢杆菌发酵产的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性最高。

实施例46至50：以实施例28、实施例38和实施例44为基础，选取20、40、60、80、100ml5个装液量分别测定不同装液量对发酵液活菌数的影响，在摇瓶发酵培养条件下培养22小时，用稀释平板计数法测其活菌数，并测定发酵液的毒力，按照装液量由少到多依次为实施例46至50。如附图7和附图8所示，在振荡培养蜡样芽孢杆菌时，采用实施例46的20ml装液量时培养基内活菌数最多，此时发酵液能致稻纵卷叶螟死亡率达到94.5％，杀灭稻纵卷叶螟的物质活性最高，随着装液量的增大，活菌数呈下降趋势，发酵液的毒力也明显下降尤其是装液量从40ml增加到60ml时毒力迅速下降。表明蜡样芽孢杆菌的发酵是需氧性发酵，实验是通过改变装液量来调节通气量，装液量小则通气量大，培养基内溶氧水平高，更适合需氧的蜡样芽孢杆菌的菌体生长。装液量在由20％增加到40％时，蜡样芽孢杆菌发酵产的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性逐渐降低，但还保持在一定范围内，可以杀灭稻纵卷叶螟的死亡率为62％～94.5％。因此，在生产中可以通过加大发酵罐搅拌器的转速来提高溶氧水平，来提高发酵液杀虫活性物质浓度，并使杀灭稻纵卷叶螟的物质保持较高的活性。

实施例51至55：以实施例28、实施例38、实施例44和实施例46为基础，接种量分别选取1％、3％、5％、7％和9％，在摇瓶发酵培养条件下培养22小时，用稀释平板计数法测其活菌数同时测定发酵液的毒力，按照接种量由少到多依次分别为实施例51至55。如附图9和附图10所示，在接种量1％～9％范围内，蜡样芽孢杆菌的活菌数不断增加，发酵液的毒力也随接种量的增加而增强，在接种量5％～9％范围内，蜡样芽孢杆菌发酵液的毒力较接种量1％～5％时明显提高，杀灭稻纵卷叶螟的死亡率达到86％～95.8％，即蜡样芽孢杆菌发酵所产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性提高。在实施例55的接种量为9％时活菌数最高，稻纵卷叶螟的死亡率达到95.8％。所以接种量为9％时，蜡样芽孢杆菌发酵所产生的杀灭稻纵卷叶螟的物质活性最高。

由实施例35至实施例40可以得出适宜蜡样芽孢杆菌生长的培养基还应该具备的条件是ph值范围为5.5-8.0，较适宜的蜡样芽孢杆菌生长的培养基ph值范围为6.5～7.5，最适宜的蜡样芽孢杆菌培养基的ph值为7.0。

本发明的提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法通过在最适宜蜡样芽孢杆菌繁殖的蜡样芽孢杆菌发酵培养基的基础上，筛选出适于提高蜡样芽孢杆菌产杀稻纵卷叶螟物质活性的发酵方法：在初始ph值为7.0、摇瓶培养温度40℃、装液量20％(占培养容器的体积比)的蜡样芽孢杆菌发酵培养基等条件下培养22小时，使蜡样芽孢杆菌产的杀灭稻纵卷叶螟的物质的活性保持较高的水平，蜡样芽孢杆菌发酵产生的物质杀灭稻纵卷叶螟的死亡率为62％～95.8％进而杀灭害虫。

对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。