一种纯化学合成蛋白胨水参比培养基及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基，适用于食品、药品、化妆品中沙门氏菌以及大肠杆菌等革兰氏阴性致病菌的检测，构建一种客观、准确、可操作性强的培养基评价体系及相关参考培养基的质量标准。

背景技术：

天然培养基也称复合培养基，含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物，如蛋白胨、牛肉膏等。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，缺点是其为成分不明确的混合物，受其来源及法规等问题的限制，制作过程复杂，批次间差异大，且存在引入外源性病毒的安全隐患，可变因素多，质量难以控制，进而影响实验结果的准确性。因此，研制由分子结构清晰的纯化学成分组成的可溯源食品微生物参比培养基，构建客观、准确、可操作性强的培养基评价体系及相关参考培养基的质量标准，势在必行。

建立质控及相关参考培养基的质量标准，形成可实施的培养基评价规范和系列培养基参考物质，为我国培养基生产与检定提供稳定的自主标尺。规范我国食品安全抽检承检机构微生物检验工作，提升整体检验水平，提高抽检数据质量，为相关食品安全标准的执行与食品安全规划的落实提供必要的科学依据和参考物质来源，并为逐步摆脱我国食品检验对进口微生物相关参考物质高度依赖问题提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明为解决目前复合培养基因含有化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物导致质量难以控制，进而影响实验结果的准确性的技术问题，提供一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基及其制备方法和应用。

本发明所述的一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基是采用如下技术方案实现的：一种纯化学合成蛋白胨水参比培养基，所述培养基包括20种氨基酸，10种维生素，5种无机盐以及2种其他成分；

所述氨基酸配方如下：甘氨酸：5-80mg/l；l-精氨酸：100-1600mg/l；l-天冬酰胺：25-400mg/l；l-天冬氨酸：10-160mg/l；l-胱氨酸二盐酸盐：0-520mg/l；l-谷氨酸：10-160mg/l；l-谷氨酰胺：150-2400mg/l；l-组氨酸：7.5-120mg/l；l-羟辅氨酸：10-160mg/l；l-异亮氨酸：25-400mg/l；l-亮氨酸：25-400mg/l；l-赖氨酸单盐酸盐：25-400mg/l；l-苯丙氨酸：7.5-120mg/l；l-脯氨酸：10-160mg/l；l-丝氨酸：15-240mg/l；l-苏氨酸：10-160mg/l；l-色氨酸：2.5-40mg/l；l-酪氨酸：11.6-185.6mg/l；l-缬氨酸：5-80mg/l；甲硫氨酸：0-120mg/l；

所述维生素配方如下：生物素：0.1-1.6mg/l；氯化胆碱：1.5-24mg/l；叶酸：0.5-8mg/l；肌醇：17.5-280mg/l；烟酰胺：0.5-8mg/l；对氨基苯甲酸：0.5-8mg/l；盐酸吡哆醇：0.5-8mg/l；核黄素：0-1.6mg/l；盐酸硫铵：0.5-8mg/l；维生素b12：0.0025-0.04mg/l；

所述无机盐以及其他成分配方如下：氯化钠：1.25-20g/l；硫酸镁：0-0.2g/l；磷酸氢二钠：0.895-14.4g/l；氯化钾：0.1-1.6g/l；磷酸二氢钾0.375-6g/l；其他成分：还原型谷胱甘肽：0.5-8mg/l；葡萄糖：0-16g/l；

上述所有组分含量均指在1l水中的含量。

本发明经过大量富有创造性的劳动，明确给出了纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基中各个组分的组成以及具体的含量，消除了现有培养基批次间差异大，且存在引入外源性病毒的安全隐患，可变因素多，质量难以控制，进而影响实验结果的准确性的技术问题。微生物生长的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源，本发明中氨基酸为微生物的生长提供氮源，葡萄糖为微生物的生长提供碳源，维生素作为生长因子，还有无机盐和水，足以保证微生物的生长。本发明所述的氨基酸，维生素，无机盐以及其它两种成分的种类和数量都是确定的，在此基础上如果再加入其它组分的话，就无法达到本申请所述培养基所能达到的技术效果。

本发明所述的一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基的配制方法：按照纯化学合成蛋白胨水参比培养基称取各组分，将除去l-胱氨酸二盐酸盐、葡萄糖的其余组分溶于适量水中得到混合溶液；l-胱氨酸二盐酸盐单独配制，溶解时需加入少量1mol/l盐酸调节ph值，完全溶解后加入前述混合溶液中，加水定容至800ml，121℃高压灭菌15min；称取葡萄糖4g溶于200ml水中，用0.22µm滤膜过滤除菌后加入上述混合溶液中。

本发明所述的一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基，对沙门氏菌有良好的促生长能力，其增菌效果可以和市售天然蛋白胨水培养基相媲美。

本发明培养基适用于食品、药品、化妆品中沙门氏菌以及大肠杆菌等革兰氏阴性致病菌的检测。

附图说明

图1培养8h后不同培养基对沙门氏菌（atcc14028）的增菌效果。

具体实施方式

按照组分筛选试验拟定一种纯化学合成蛋白胨水（bpw）参比培养基的处方，进行最终确认。

处方1（bpw）：将筛选出的20种氨基酸、10种维生素、5种无机盐、还原型谷胱甘肽和葡萄糖按照如下配比混合：甘氨酸：20mg，l-精氨酸：400mg，l-天冬酰胺：100mg，l-天冬氨酸：40mg，l-谷氨酸：40mg，l-谷氨酰胺：600mg，l-组氨酸：30mg，l-羟辅氨酸：40mg，l-异亮氨酸：100mg，l-亮氨酸：100mg，l-赖氨酸单盐酸盐：100mg，l-苯丙氨酸：30mg，l-脯氨酸：40mg，l-丝氨酸：60mg，l-苏氨酸：40mg，l-色氨酸：10mg，l-酪氨酸：46.4mg，l-缬氨酸：20mg，甲硫氨酸：30mg，生物素：0.4mg，氯化胆碱：6mg，叶酸：2mg，肌醇：70mg，烟酰胺：2mg，对氨基苯甲酸：2mg，盐酸吡哆醇：2mg，核黄素：0.4mg，盐酸硫铵2mg，维生素b12：0.01mg，氯化钠：5g，硫酸镁：0.048g，磷酸氢二钠：3.57g，氯化钾：0.4g，磷酸二氢钾1.5g，还原型谷胱甘肽：2mg，加水500ml，溶解；l-胱氨酸二盐酸盐：130mg，加入50ml水，再加少量1mol/l盐酸调节ph值，完全溶解后加入上述混合溶液中，加水定容至800ml，121℃高压灭菌15min；称取葡萄糖4g溶于200ml水中，过滤除菌后加入上述灭菌后的混合溶液，摇匀。

处方2（bpw+）：将处方1中甲硫氨酸浓度调整为95mg/l，加入氯化铵4g/l，硫酸腺嘌呤10mg/l。

市售天然蛋白胨水（bpw）培养基(bd)：按厂家说明进行配制。

菌种活化：取鼠伤寒沙门氏菌atcc14028，接种至营养肉汤，36℃培养过夜，10倍系列稀释至10^-7稀释级（10-100cfu/ml），备用。

试验过程：取处方1试管2支，处方2试管2支，bpw（bd）试管2支，每支含培养基10ml，每支中均加入鼠伤寒沙门氏菌10-100cfu，置36℃培养8h后，从每支试管中取10μl接种至平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，36℃培养18-24h，计数；试验管继续置36℃培养至24h，取出，测定浊度值。

实验结果表明：培养8h后，处方1和处方2对沙门氏菌的促生长作用无明显差别，均达到了gb4789.28中大于100cfu的要求，且与市售bpw的增菌效果接近。如表1、图1所示。

培养24h后，处方1和处方2的浊度值均大于市售天然蛋白胨水（bpw）培养基。见表1。

处方2相较处方1，菌落数有少许优势，但不明显，从节省原料的角度出发，选用处方1（见表1所示）。

表1沙门氏菌在不同培养基中培养8h菌落计数与培养24小时浊度比对结果

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