一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用与流程

本发明属于鱼类育种
技术领域：
的分子标志技术，具体涉及一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用。
背景技术：
：罗非鱼(tilapia)是一种原产于非洲的热带性鱼类，隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(cichlidae)、罗非鱼属(亦称丽鲷科，丽鲷属)，约有100余种。因其具有生长快、食性杂、繁殖力和适应力强、无肌间刺和味道鲜美等特点，1976年成为联合国粮农组织fao向全世界推荐的优良养殖品种。目前已有75个国家和地区养殖罗非鱼，已成为一种世界性的淡水养殖鱼类。自1957年引种莫桑比克罗非鱼(oreochromismossambicus)以来，我国罗非鱼养殖产业不断发展壮大，目前我国已成为罗非鱼年产量世界第一的生产大国。2017年我国罗非鱼产量达158万吨，广东、海南、广西和云南等省份是我国罗非鱼的主要产地。目前，我国罗非鱼成鱼养殖主要品种有尼罗罗非鱼吉富品系(o.niloticus,giftstrain)、奥尼罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)和罗非鱼“粤闽1号”等。尼罗罗非鱼吉富品系是以四个非洲品系(埃及、肯尼亚、塞内加尔、加纳)和四个亚洲养殖品系(新加坡、泰国、以色列、中国台湾)的尼罗罗非鱼为基础群体，通过家系选育方法获得，其具有生长快、规格整齐、体形好、适应性强等优点，是我国目前养殖最为广泛的罗非鱼品种。但尼罗罗非鱼雄性率较低、抗病力较差，制约了我国罗非鱼养殖产量的进一步提高。通过遗传育种方法培育出生长速度快、雄性率高和抗病力强的罗非鱼新品种成为广大渔民的迫切需求和科研人员的研究的热点。奥利亚罗非鱼(o.aureus)虽然生长速度较慢，但由于其具有不同于尼罗罗非鱼的性别决定机制和抗病力强的特点，常常被用作全雄罗非鱼和抗病罗非鱼新品种培育的亲本。奥尼罗非鱼是由奥利亚罗非鱼为父本和尼罗罗非鱼为母本杂交获得的杂交种，其具有自然雄性率高、耐低氧和抗病力强等优点。罗非鱼“粤闽1号”(尼罗罗非鱼♀×超雄奥尼罗非鱼♂)是中国水产科学研究院珠江水产研究所近年来以尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼为基础群体，通过群体选育、家系选育和杂交育种技等术培育而成的全雄罗非鱼新品种。在上述罗非鱼主要养殖品种的培育过程中，涉及到尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种三种罗非鱼家系构建和种群遗传管理工作，操作不当容易导致种质混杂、遗传渐渗和过度近亲繁殖，从而出现鱼体生长速度减慢、成鱼规格差异大和抗病力减弱等种质退化现象，因此建立简便可靠、适用性较广的罗非鱼家系系谱分析方法具有重要意义。在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。以往主要通过分池养殖保种或采用电子标签标记等方法记录家系系谱信息，但分池保种需要占用大量池塘，成本较高；电子标签标记法虽然可以减少池塘的使用量，但标记工作量较大，且易出现标记丢失和鱼体损伤等现象。基于分子标记的鱼类亲权鉴定方法能够较好的避免以上传统系谱信息管理方法的弊端，其中微卫星标记法因具有数量多、分布广、多态性丰富、易检测、呈孟德尔共显性遗传等特点，成为目前在水生动物亲权鉴定中应用最为广泛的方法之一。在草鱼、凡纳滨对虾、建鲤、金乌贼、翘嘴鳜、大菱鲆和牙鲆等水生动物中均有微卫星亲权鉴定方法的报道，虽然在尼罗罗非鱼中已有微卫星亲权鉴定方法的报道，但在奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼中未见有微卫星亲权鉴定方法的报道。本发明旨在利用荧光微卫星标记建立适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的亲权鉴定方法，从而为其家系管理和种群遗传管理提供技术手段。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物，对13个微卫星位点进行分析，等位基因数目较多，多态性高，扩增产物稳定可靠，鉴定方法准确率达100％，在实际应用中准确率高达99.43％。本发明的第二个目的是提供利用上述适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物进行鉴定的方法。本发明的第三个目的是提供上述适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物和方法在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的家系亲权鉴定中的应用，对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的亲权鉴定、种群遗传管理和家系管理。上述发明目的通过以下技术方案实现：一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物，所述微卫星标记亲权鉴定引物共有13个引物对，分别为gm354、gm294、gm012、gm373、gm271、unh845、gm209、unh907、gm323、gm221、unh866、unh233、unh890，各引物对的正向引物、反向引物的核苷酸序列分别如seqidno.1～seqidno.26所示。一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定方法，包括如下步骤：(1)家系构建：分别通过人工繁育方法获得尼罗罗非鱼全同胞家系3个，奥利亚罗非鱼全同胞家系2个，奥尼罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)全同胞家系3个，各家系分别编号独立饲养；(2)基因组dna提取：分别采集步骤(1)中各家系的亲本和子代尾鳍样品，并采用动物组织微量dna提取试剂盒法提取尾鳍基因组dna；(3)多态性微卫星引物筛选：筛选出在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼这三种罗非鱼中扩增稳定、多态性和杂合度较高的微卫星引物；共筛选出以下13个微卫星位点的引物对：gm354、gm294、gm012、gm373、gm271、unh845、gm209、unh907、gm323、gm221、unh866、unh233、unh890，各引物对的正向引物、反向引物的核苷酸序列分别如seqidno.1～seqidno.26所示；(4)荧光标记微卫星引物pcr扩增和多重毛细管电泳分型：把步骤(3)中筛选得到的每对引物中正向引物的5’端标记上荧光标记，然后采用13对荧光标记微卫星引物分别对步骤(2)中获得的dna样品进行降落pcr扩增，pcr扩增产物根据其分子大小分成4组，第1组包括gm354、gm294、gm012和gm373，第2组包括gm271、unh845和gm209，第3组包括unh907、gm323和gm221，第4组包括unh866、unh233和unh890，扩增产物按上述分组混合后置于abi3730xl测序仪中进行多重毛细管电泳，从而对各微卫星位点进行基因型分型；(5)亲权鉴定：利用软件cervusv3.0分析基因型数据，根据孟德尔遗传规律确定子代与亲本间的亲子关系，完成亲权鉴定。进一步地，所述步骤(5)中，还包括亲权鉴定的准确率评估：根据实际家系系谱信息判别鉴定准确率。进一步地，还包括步骤(6)实际应用效果评价：构建罗非鱼“粤闽1号”(尼罗罗非鱼♀×超雄奥尼罗非鱼♂)全同胞家系5个，各家系分别编号独立饲养；采集各家系亲本和子代尾鳍样本，并采用步骤(2)中方法提取基因组dna；采用步骤(4)和(5)中方法进行微卫星位点基因型分型和亲权鉴定分析；根据实际家系系谱信息判别鉴定准确率。进一步地，所述步骤(4)中，微卫星位点gm354、gm373、gm271、unh907和unh866正向引物的5’端标记fam荧光，微卫星位点gm294、unh845、gm323和unh233正向引物的5’端标记hex荧光，微卫星位点gm012、gm209、gm221和unh890正向引物的5’端标记tmr荧光。进一步地，所述步骤(4)中，降落pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃～54℃降落退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；然后95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共22个循环，最后72℃延伸10min。与现有技术相比，本发明的上述技术方案的有益效果如下：1、本发明首次建立了适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的家系亲权鉴定方法，可为这三种罗非鱼在育种过程中的种群遗传管理和家系系谱信息管理提供技术支撑。2、本发明对13个微卫星位点进行分析，等位基因数目较多，多态性高，扩增产物稳定可靠，鉴定方法准确率达100％，在实际应用中准确率高达99.43％。3、本发明分别采用不同荧光标记的13对微卫星引物，扩增产物混合成4组后在abi3730xl测序仪中进行多重毛细管电泳分析，比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳微卫星分型方法效率提高3倍以上，并提高了基因分型的准确率。附图说明图1为13个微卫星位点组成的4个多重毛细管电泳分型结果，其中(a)为gm354、gm294、gm012和gm373位点的分型结果，(b)为gm271、unh845和gm209位点的分型结果，(c)unh907、gm323和gm221位点的分型结果，(d)为unh866、unh233和unh890位点的分型结果。图2为尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼家系混合群体中不同微卫星位点数的累计非亲排除率，其中ce-1p为第一亲本累计排除率，ce-2p为第二亲本累计排除率，ce-pp为双亲累计排除率。图3为不同微卫星位点数下尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼家系混合群体的双亲模拟鉴定率。图4为尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼共8个家系的upgma聚类分析结果，其中1#、2#、3#为尼罗罗非鱼家系，4#、5#为奥利亚罗非鱼家系，6#、7#、8#为奥尼罗非鱼家系。图5为罗非鱼“粤闽1号”5个家系子代的亲权鉴定结果，其中ym1家系亲本为ym1-f和ym1-m，ym2家系亲本为ym2-f和ym2-m，ym3家系亲本为ym3-f和ym4-m，ym4家系亲本为ym4-f和ym4-m，ym5家系亲本为ym5-f和ym5-m，ym6家系亲本为ym4-f和ym5-m。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。实施例1一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定方法，包括如下步骤：1.家系构建：采用本实验室保种的尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼亲本，待其性成熟后，采用人工受精方法构建3个尼罗罗非鱼全同胞家系、2个奥利亚罗非鱼全同胞家系和3个奥尼罗非鱼(尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂)全同胞家系。各家系分别编号独立饲养，待鱼苗孵化后2个月后分别采集各家系亲本和32～35尾子代尾鳍样本作为亲权鉴定的材料。2.基因组dna提取：采用动物组织微量dna提取试剂盒(magen)提取步骤1中各家系的亲本和子代罗非鱼的尾鳍基因组dna。3.多态性微卫星引物筛选：从尼罗罗非鱼基因组高密度遗传连锁图谱的每个连锁群中随机选取2～3个微卫星位点，共选择72个微卫星位点，从genbank中查询相应微卫星位点的引物序列进行合成。利用上述72对微卫星引物分别对10尾尼罗罗非鱼、10尾奥利亚罗非鱼和10尾奥尼罗非鱼dna进行扩增，通过聚丙烯酰胺电泳方法筛选在这3种罗非鱼中均扩增稳定、多态性较高、杂合度较高的引物，共筛选出以下13个微卫星位点的引物：gm354、gm294、gm012、gm373、gm271、unh845、gm209、unh907、gm323、gm221、unh866、unh233、unh890，引物序列信息见表1；4.荧光标记微卫星引物pcr扩增和多重毛细管电泳分型：把步骤3中筛选得到的每对引物中正向引物的5’端标记上荧光标记：微卫星位点gm354、gm373、gm271、unh907和unh866位点正向引物的5’端标记荧光fam，微卫星位点gm294、unh845、gm323和unh233正向引物的5’端标记荧光hex，微卫星位点gm012、gm209、gm221和unh890正向引物的5’端标记标记荧光tmr(见表1)。然后采用13对荧光标记微卫星引物分别对步骤2中获得的dna样品进行降落pcr扩增，pcr反应体系为10μl，其中2×taqpcrmastermix5.0μl，模板(基因组dna)1.0μl，上游引物(浓度为10μm)0.5μl，下游引物(浓度为10μm)0.5μl，无菌双蒸水h2o3.0μl。降落pcr扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，62℃～54℃降落退火30s，72℃延伸30s，共10个循环；然后95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共22个循环，最后72℃延伸10min。pcr扩增产物根据其分子大小分成4组，第1组包括gm354、gm294、gm012和gm373，第2组包括gm271、unh845和gm209，第3组包括unh907、gm323和gm221，第4组包括unh866、unh233和unh890，扩增产物按上述分组混合后置于abi3730xl测序仪中进行多重毛细管电泳，从而对各微卫星位点进行基因型分型。将毛细管电泳检测结果导入到genemarker软件中进行数据整理，导出每对引物峰图及其等位基因大小(见图1)。表1.13个微卫星位点扩增引物序列信息及其修饰荧光种类5.亲权鉴定与准确率判断：采用cervusv3.0软件分析微卫星引物的遗传参数、等位基因频率分析、模拟分析和亲权鉴定，确定待测子代与亲本间的亲子关系。最后根据记录的实际家系系谱信息判别鉴定准确率。6.聚类分析：采用popgen32软件分析各家系之间的遗传距离，采用mega4.1软件中upgma方法构建系统进化树，从而进一步验证13个微卫星位点亲权鉴定结果的可靠性。7.结果与分析：遗传参数分析结果表明：13个微卫星位点中有11个为高度多态性位点(pic≥0.5)，2个为中度多态性位点(0.5>pic≥0.25)，平均多态性信息含量为0.687，平均等位基因为7.08，平均观测杂合度为0.580，平均期望杂合度为0.724，这说明13对微卫星引物的多态性和杂合度较高，可用于亲权鉴定分析(见表2)。各微卫星位点的模拟排除率见表3，不同微卫星位点数目下的累计非亲排除率和双亲模拟鉴定率分别如图2和图3所示，实际亲权鉴定率和错误率见表4。结果表明：第一亲本累计排除率达到99％以上只需3个位点，第二亲本累计排除率达99％以上需要5个位点，双亲累计排除率达到99％以上需要11个位点，13个位点的双亲累计排除率可达99.28％。已知双亲性别时，模拟双亲鉴定率到达100％需要8个以上微卫星位点，而实际鉴别率达100％时需要10个以上位点；双亲性别未知时，模拟双亲鉴别率和实际鉴别率达100％时均需要9个以上微卫星位点。采用13个微卫星位点的对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼3种罗非鱼共8个家系混合群体子代的实际鉴定率达到100％，准确率为100％。基于13个微卫星位点的聚类分析结果表明：尼罗罗非鱼家系(1#、2#和3#)独自聚为一支，奥尼罗非鱼家系(6#、7#、8#)和奥利亚罗非鱼家系(4#、5#)家系聚为一大支，其中奥利亚罗非鱼2个家系聚为一小支，这也进一步说明13个微卫星位点能够完全将这三种罗非鱼家系进行区分(见表5和图4)。表2.13个微卫星位点在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼与奥尼罗非鱼家系混合群体中的遗传参数分析表3.13个微卫星位点在尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼与奥尼罗非鱼家系混合群体中的模拟排除率表4不同微卫星位点数目下的实际亲权鉴定率和错误率表5尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼和奥尼罗非鱼共8个家系间的遗传距离和遗传相似性指数家系1#2#3#4#5#6#7#8#1#/0.58600.78210.07660.07920.52930.24040.26352#0.5344/0.57180.07500.08110.41010.27160.27393#0.24580.5590/0.11030.10800.63050.27460.24274#0.97540.96790.9108/0.95600.64800.50390.64495#0.99070.98280.98520.0450/0.61070.48520.62116#0.63610.89140.46130.43390.4931/0.71450.70067#0.88010.84670.84410.68540.72310.3362/0.55528#0.85250.82640.87320.43860.47630.35580.5884/注：其中1#、2#、3#家系为尼罗罗非鱼家系，4#、5#为奥利亚罗非鱼家系，6#、7#、8#为奥尼罗非鱼家系，对角线左下部分为遗传距离，对角线右上部分为遗传相似性指数实施例2实际应用效果评价：罗非鱼“粤闽1号”家系亲权鉴定1.家系构建与取样：选取5尾雌性尼罗罗非鱼作为母本，5尾超雄奥尼罗非鱼(以超雄尼罗罗非鱼为父本，奥利亚罗非鱼为母本，其杂交子代再与超雄尼罗罗非鱼回交后获得)作为父本，一对一进行配对构建5个全同胞家系，自然产苗后采集各家系亲本和35尾子代的尾鳍样本。2.采用实施例1中步骤2的方法提取上述5个罗非鱼“粤闽1号”全同胞家系亲本和子代的基因组dna；采用实施例1中步骤4的方法采用13对荧光标记微卫星引物进行pcr扩增和abi3730xl测序仪多重毛细管电泳分型；采用实施例1中步骤5的方法进行亲权鉴定与准确率判断。3.亲权鉴定结果与分析：13对微卫星引物在罗非鱼“粤闽1号”家系中的遗传参数分析结果表明，其平均等位基因数为5.62，平均观测杂合度为0.628，平均期望杂合度为0.680，平均多态性信息含量为0.637(见表6)，这表明这些引物在罗非鱼“粤闽1号”家系中的多态性和杂合度较高，适合用于亲权鉴定分析。模拟非亲排除率和累计非亲排除率分析结果表明，13个微卫星位点的第一亲本累计排除率为100％，第二亲本累计排除率为100％，双亲累计排除率为99.82％(见表7)。亲权鉴定结果显示，5个家系共175尾子代被鉴定为6个家系，鉴定率为100％；与实际家系系谱信息进行比较表明，其中174尾能找到其正确父母本，只有1尾子代的父本鉴定错误，鉴定准确率为99.43％(见图4)。表6.13个微卫星位点在罗非鱼“粤闽1号”5个家系中的遗传参数分析表7.13个微卫星位点在罗非鱼“粤闽1号”5个家系中的模拟非亲排除率以及不同位点数目下的累计非亲排除率以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所<120>一种适用于尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交种的微卫星标记亲权鉴定引物、方法及应用<160>26<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>16<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>1cgggagagcaggtcag16<210>2<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>2cacgttcagggttactgtgtt21<210>3<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>3gctcgtcctatctttagaaca21<210>4<211>16<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>4aaaccagcccgctatt16<210>5<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>5ccattgggtgttcaaataaa20<210>6<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>6ggctaacagggcacttctta20<210>7<211>19<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>7ggcaccatctctaaggaaa19<210>8<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>8taaaggggacaaatgtgaaat21<210>9<211>19<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>9gcagctggatcagtctctg19<210>10<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>10tgggaagtcgttcatacaaag21<210>11<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>11gccgactccaacttgctact20<210>12<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>12atcccctacacggacaagtg20<210>13<211>18<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>13aaagcacccagatgttca18<210>14<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>14gctgctgataattcattcatt21<210>15<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>15caggaccgactctgcaagat20<210>16<211>23<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>16gagctcttttgttgttcaaaatc23<210>17<211>16<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>17cgcttcctgaaccaaa16<210>18<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>18gttctcctctgtatcccatta21<210>19<211>21<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>19tacagaagtcgaggcgagatg21<210>20<211>19<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>20gtggtggcgattgtgtcat19<210>21<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>21actcccgctgttgctgttag20<210>22<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>22gaggggagcctacaacgtaa20<210>23<211>17<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>23tgccgccatctatctat17<210>24<211>23<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>24aaacacaaagtgtgagacagata23<210>25<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>25aaaagcatccctgcttctca20<210>26<211>20<212>dna<213>罗非鱼(tilapia)<400>26tggctgttgcaagacacatt20当前第1页12