一种黄曲条跳甲细胞色素P450基因及其应用

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因及其应用。

背景技术：

黄曲条跳甲phyllotretastriolata(fabricius)是鞘翅目(coleoptera)、叶甲科害虫，主要危害十字花科蔬菜，如白菜、芥蓝、油菜、菜心等。其一生经历四个阶段，分别是卵、幼虫、成虫和蛹这四个时期，幼虫生活在土壤中，主要以植物的根皮为食，常常会造成缺苗断垄的现象出现，而成虫主要以十字花科植物的嫩叶为食。

目前国内外关于黄曲条跳甲防治的研究，主要集中在化学防治，物理防治，生物防治和转基因技术。通过利用非嗜食性寄主的植物次生物质作为防治黄曲条跳甲的一个方向，通过提取出一些其他植物次生物质与化学农药的混合试剂，对黄曲条跳甲的防治有一定的作用。在作物栽培中，将十字花科植物与非十字花科植物进行轮作同样也被用来防治黄曲条跳甲的一种田间常用方法，但这些方法的防治效果并不理想。对十字花科蔬菜喷洒农药，只能够针对地面上的害虫，而无法对土壤里的幼虫产生作用，不仅无法杀死土中幼虫、蛹和卵，治标不治本，而且还会造成严重的环境污染，降低蔬菜品质，影响人们的身体健康。与此同时，杀虫剂的滥用会导致黄曲条跳甲产生抗药性。由此，为了能够有效地控制黄曲条跳甲又能不对环境造成危害的防治新技术就成了重中之重。转基因抗虫技术，通过在植物中表达抗虫毒素基因改良作物抗虫性状，虽具广谱性、高抗性等优点，但也会诱导害虫产生抗性，另外特异性不高，对环境和生物群体的安全隐患较大，也没有得到消费者的一致认可。

随着分子生物技术的发展，rnai技术在昆虫防治领域的应用也越来越多，目前在双翅目，膜翅目等昆虫中的试验中取得了良好的防治效果。在双翅目蚊类中，利用rnai技术对冈比亚按蚊抗菌肽基因defensin进行沉默，鉴定该基因的功能，进而拉开了应用rnai技术为研究蚊子的基因功能的新的序幕。应用rnai技术研究最多的膜翅目昆虫是意大利蜜蜂，通过构建相关基因的dsrna成功降低意大利蜜蜂成虫基因的表达。

细胞色素p450分布广泛，已报道的对p450基因的研究大都集中在家蝇、家蚕、棉铃虫、赤拟谷盗、黑腹果蝇、埃及伊蚊、北美黑尾凤蝶、蚜虫等经济型昆虫、卫生型昆虫和农业昆虫。但对黄曲条跳甲细胞色素p450基因及其rnai的研究未见报导。本发明通过黄曲条跳甲的转录组测序，获得一个在跳甲中高表达的细胞色素p450基因，通过对ncbi数据库进行blast分析发现，该基因序列和其他已知p450同源基因的相似度低于80％。我们选取一个250bp的基因片段作为靶点，用于构建rnai表达载体。通过序列比对分析，发现该片段序列和ncbi数据库中其他同源基因的相似度低于73％，说明该靶点具有非常高的特异性。通过克隆黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段及构建其rnai的表达载体，对dsrna的表达条件进一步优化，并通过喂食证明可以有效杀死黄曲条跳甲，跳甲死亡率可达61.5％，显著高于对照组，因此可以应用于黄曲条跳甲的防治。

技术实现要素：

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因及其应用。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。

一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段的获得方法，以含有核苷酸序列如seqidno：1所示的质粒为模板，通过带有酶切位点kpni的上游引物seqidno：3和带有酶切位点saci的下游引物seqidno：4进行pcr扩增得到黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段。

一种含黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段的dsrna表达载体，所述表达载体的构建方法为：利用fastdigestkpni和fastdigestsaci，37度条件下分别对可以产生dsrna的载体质粒和黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段进行双酶切；

对可以产生dsrna的载体质粒酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收大片段，去掉小片段；

利用普通dna产物纯化试剂盒对p450的酶切产物进行纯化；

于25℃下连接切胶回收的可以产生dsrna的载体质粒产物和纯化得到的p450产物；

优选地，可以产生dsrna的载体质粒为l4440质粒。

上述所述的表达载体构建得到的高效表达系统。

上述所述的高效表达系统的制备方法，包括将所述表达载体转染至宿主细胞中，即得。

进一步地，所述宿主细胞为rnaseiii缺失宿主细胞，优选地，所述rnaseiii缺失宿主细胞为ht115(de3)感受态细胞。

一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段的dsrna的合成方法，将上述所述的表达系统或制备得到的表达系统经iptg诱导获得与目标片段相对应的dsrna。

上述所述方法合成的黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段的dsrna。

上述所述的黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段的dsrna在杀死黄曲条跳甲中的应用。

本发明的有益效果为：黄曲条跳甲细胞色素p450基因的核苷酸序列如seqidno：1所示，该基因序列和其他已知p450同源基因的相似度低于80％；本发明选取一个250bp的基因片段作为靶点，其核苷酸序列如seqidno：2所示，该片段序列和ncbi数据库中其他同源基因的相似度低于73％。通过克隆黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段，连入l4440载体，将重组质粒转入大肠杆菌ht115感受态细胞，经iptg诱导获得与目标片段相对应的dsrna，通过喂食含有dsrna的食物证明可以有效杀死黄曲条跳甲，跳甲死亡率可达61.5％，可以应用于黄曲条跳甲的防治。

本文研究了dsrna在室温下的稳定性，结果显示，在室温下放置了72h也没有发生降解，解决了如何获得含量丰富而且易于生产使用的dsrna，通过高压细胞破碎法可以做到投入少，有效率且大量制备的dsrna。

附图说明

图1为p450扩增结果，其中m：dl5000dnamarker；1：细胞色素p450基因片段；

图2a为l4440质粒图谱及多克隆位点；图2b为sacⅰ和kpnⅰ酶切l4440质粒结果，其中m：dl5000dnamarker；1、2、3：l4440质粒；

图3为菌落pcr鉴定，其中m：dl2000dnamarker；1、2、3、4、5、6、7：重组质粒l4440-p450；8：阴性对照；

图4为dsrna及经dnaseⅰ和rnasea消化分析结果，其中m：dl2000dnamarker；1：提取物经dnaseⅰ消化处理；2：提取物经rnasea消化处理；3：提取物先后经dnaseⅰ和rnasea消化处理；4：未经处理的提取物对照组；

图5为不同条件iptg对诱导dsrna表达的影响，其中m：dl2000dnamarker；1、2、3：0mmiptg诱导时间分别为2h，3h，4h；4、5、6：0.2mmiptg诱导时间分别为2h，3h，4h；7、8、9：0.4mmiptg诱导时间分别为2h，3h，4h；10、11、12：0.8mmiptg诱导时间分别为2h，3h，4h；

图6为dsrna的稳定性检测结果，其中m：dl2000dnamarker；1-6：dsrna分别在室温下放置0h、12h、24h、36h、48h、72h；箭头指示dsrna条带位置；

图7为dsrna杀虫死亡率统计。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。

实验材料

黄曲条跳甲成虫采自深圳市龙华基地，主要是在十字花科蔬菜的心叶和叶表位置。将其置于培养室(温度保持在28℃，相对湿度75％，光照强度设置为60％lx，周期l:d＝14:10)中，以新鲜小白菜嫩叶喂食。

实验中所需要的主要试剂包括trizol；dnamarkerdl2000；dnamarkerdl5000；11×dna/rnaloadingbuffer；t4dnaligase；10×t4dnaligasebuffer；10×fastdigasegreenbuffer；sacⅰ(fastdigase)；kpnⅰ(fastdigase)；异丙醇；75％乙醇；氯仿；depc水；去离子水(ddh2o)；液氮；easyscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒；普通dna产物纯化试剂盒；ht115(de3)感受态细胞。

野生型的大肠杆菌因为其本身基因带有rnaseⅲ，该酶可以识别并且切割dsrna，所以通过野生型大肠杆菌来诱导表达生产dsrna的方法行不通。相反，ht115(de3)是缺陷型大肠杆菌，不具有rnaseⅲ，因此可以用于表达dsrna，此外，l4440含有双向t7启动子和lac乳糖操纵子，因此本文研究即通过ht115感受态细胞来转化重组质粒l4440-p450，以此来表达dsrna。

实施例1黄曲条跳甲总rna的提取及cdna的合成

取黄曲条跳甲成虫约30只，用ddh2o冲洗干净，用滤纸吸干，加入液氮迅速研磨，研磨至白色粉末状，利用trizol法提取黄曲条跳甲总rna。通过使用easyscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒对黄曲条跳甲总rna进行反转录得到单链cdna，其核苷酸序列如seqidno：1所示。该黄曲条跳甲细胞色素p450基因(c13467_g1_i1)表达量高，该基因和其他已知p450同源基因的相似度低于80％，特异性强，是黄曲条跳甲特异性基因。该基因的高效表达对于跳甲的代谢及生长发育非常重要，通过rnai沉默该基因使得该基因的表达量降低，影响跳甲的正常代谢及生长发育，因此可以达到杀死该害虫的效果。且由于该基因的特异性强，一般不会对其他昆虫或其他生物造成危害。

实施例2黄曲条跳甲细胞色素p450基因的克隆

使用primer5.0软件进行设计引物，在上游引物的5’端和下游引物5’端分别加上kpnⅰ、sacⅰ酶切位点(如下表所示为带有酶切位点的p450引物，ggtacc为kpni酶切位点，ggtacc为saci酶切位点)。以反转录获得的cdna为模板，通过带有酶切位点(kpni,saci)的引物pcr扩增得到黄曲条跳甲细胞色素p450基因片段，大小约为250bp，如图1所示，该基因片段与其他已知同源基因的相似度低于73％。pcr反应体系为：25μl2×transtaqhifipcrsupermixⅱ,上下游引物各1ul,模板2ul,ddh2o补足至50ul.扩增程序为：:94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，36个循环；72℃延伸5min。

实施例3黄曲条跳甲p450干扰载体的构建

利用fastdigestkpni和fastdigestsaci,37度条件下分别对l4440质粒和p450pcr回收产物进行双酶切2h。对l4440质粒酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收大片段，去掉小片段；利用普通dna产物纯化试剂盒对p450的酶切产物进行纯化。于25℃下连接切胶回收的l4440产物和纯化得到的p450产物反应2h，连接产物转化ht115(de3)感受态细胞，在恒温培养摇床下37℃，250r/min培养60min，然后涂布于lb固体培养基(100mg/lamp)，在37℃恒温培养箱中过夜培养至菌落长出。挑选白色菌落，对白色单菌落进行菌落pcr鉴定，将筛选鉴定成功的阳性单克隆测序，比对测序结果，选取构建成功的l4440-p450重组质粒。

l4440质粒大小为2790bp，自身带有双向t7启动子，如图2a所示。在本实验中，在多克隆位点选取sacⅰ和kpnⅰ进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳分析显示l4440质粒经双酶切后产生两个片段，大片段大小为2700bp左右，小片段大小为138bp左右，电泳图上小片段基因的亮度很低，酶切产物的效率较好，对酶切产物进行切胶回收，保留大片段产物，去掉小片段产物，如图2b所示。

对p450pcr扩增产物进行双酶切，并对该产物进行纯化。而后，在连接体系下将两种产物连接，接着将连接产物转化到大肠杆菌ht115感受态细胞中，并且进行了抗性筛选与测序比对，如图3显示，经过菌落pcr鉴定，转化连接质粒与预期结果相符合，说明重组质粒构建成功，将重组质粒命名为l4440-p450质粒。

实施例4dsrna诱导表达及纯化

将l4440-p450重组质粒转化至ht115。取20μl至10ml新鲜lb液体培养基(含100mg/lamp)，37℃、220r/min的恒温培养摇床中震荡培养16h，吸取培养后的菌液2ml，加入到装有100ml新鲜液体培养基(含100mg/lamp)的锥形瓶中，培养至对数生长期，此时od600＝0.5左右，震荡培养时间一般为3到4h。加入iptg进行诱导，iptg的最终浓度为0.4mm，放回恒温培养摇床中，继续以37℃，220r/min的条件震荡培养4h。利用trizol法提取dsrna，加入30μlddh2o。吸取适量上述样品，分别用dnaseⅰ、rnasea消化处理，鉴定dsrna，其琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。dnaseⅰ主要用来降解提取物中的dna分子，而rnasea则可以消化单链rna。经trizol提取的dsrna先后经dnaseⅰ和rnasea处理后仍然保持稳定，说明成功得到了dsrna。

实施例5dsrna诱导条件的优化

dsrna是由iptg诱导的，因此可以从iptg的浓度以及培养时间两方面进行梯度实验，以选择适合dsrna高效表达的诱导条件。首先是iptg的浓度，吸取经l4440-p450重组载体转化的ht115菌液以1：50的比例分别加入到4个锥形瓶中，每个瓶子含100ml新鲜lb液体培养基(100mg/lamp)，设置iptg的最终浓度分别为0mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm。然后，当od600＝0.5时，加入iptg，设置iptg的诱导培养时间，设置时间分别为2h、3h、4h。不同浓度下的iptg分别诱导培养三个不同时间。其他条件不变。

不同浓度、不同时间提取得到的dsrna先放置在-20℃冰箱中保存，全部提取完毕后通过琼脂糖凝胶电泳检测不同iptg浓度诱导不同时间的dsrna的表达量。

由图5可以看出，未经iptg诱导的菌液不能产生dsrna；当iptg浓度较低时(0.2-0.4mm)，在iptg浓度相同的条件下，诱导的时间不同则会导致产生的不同亮度的条带，随着时间增加，条带的亮度增加，这表明dsrna的表达量会随着时间延长而增大，其中在4h时，dsrna的表达量最大(图5中6和9)，但当iptg浓度较高时(0.8mm)，dsrna的表达量在诱导3h时最大(图5中11)；在iptg诱导时间相同时，不同浓度的iptg诱导dsrna表达量不同，在0.2-0.4mmiptg诱导下dsrna表达量相对较高。因此，根据dsrna诱导条件优化的结果，认为0.2-0.4mmiptg诱导4h会产生相对较高表达量的dsrna。

实施例6dsrna稳定性检测

利用高压细胞破碎仪破碎iptg诱导后的菌液，通过异丙醇沉淀对dsrna进行粗提，然后放置于室温下0h、12h、24h、36h、48h、72h，每个时间段吸取一部分dsrna于-20℃保存，最后一起经过琼脂糖电泳检测，比较判断dsrna在室温下的稳定性。

由图6可以发现dsrna在室温下基本不发生降解，说明dsrna在室温下能够保持稳定，因此后续研究抗黄曲条跳甲实验可以通过喷洒破碎后的菌液检测杀虫效果。

实施例7dsrna杀虫试验

dsrna饲喂法主要是通过向昆虫饲喂人工饲料、表达dsrna的作物、具有诱导dsrna作用效应地菌株或者直接将dsrna喷洒于作物表面。饲喂方法操作简单，投入成本较低，容易实现，以最原始自然的输入方式进入害虫体内，达到沉默基因的目的。

通过无菌水稀释配制浓度为200ng/ml的p450dsrna溶液，将菜心嫩叶分别于p450dsrna溶液和对照液(ddh2o)中浸泡一至两分钟，使其表面充分接触到dsrna溶液，每隔24小时，更新浸泡叶片用于饲喂黄曲条跳甲，观察记录黄曲条跳甲的生长状态及统计死亡率。对照组和测试组分别设置三个重复，每个重复中有20只黄曲条跳甲成虫用于饲喂实验。

通过饲喂ddh2o和p450-dsrna浸泡过的菜心嫩叶，观察发现最初三至四天，对照组和测试组中的黄曲条跳甲成虫生长发育未受到明显的影响，第五天测试组开始表现出rnai效应，陆续有黄曲条跳甲死亡出现，在15天左右，p450dsrna表现出明显的抑制作用，测试组成虫死亡率达百分之五十以上，死亡率均值达到61.5％，显著高于对照组，如图7所示。

rnai的过程由以下几步完成。第一步是rnai的起始阶段，外源导入的dsrna被核酸内切酶dicer切割成21-25bp片段的sirna；第二步是sirna的装配阶段，sirna在argonaute等酶的作用下被装载至risc复合体，在此复合体形成后双链rna的一条链被降解，而risc复合体上装载并被激活的单链rna称为向导链；第三步是rnai的效应阶段，进入risc复合体的sirna通过序列互补方式找到靶标mrna序列并与其结合，导致靶标mrna的翻译抑制或通过一些核酸内切酶的作用将其切割为短片段rna，从而引起对靶标基因的沉默效应。

rnai防治害虫主要是rnai非细胞自主性的应用。非细胞自主性rnai包括环境rnai和系统性rnai，环境rnai为细胞从外界环境中吸收dsrna，系统性rnai为多细胞生物体内的沉默信号在细胞或者组织间转运。将目标基因的dsrna喷洒在作物叶上，害虫通过取食叶片使得dsrna到达害虫的中肠并被害虫吸收，这一过程为环境rnai；而中肠细胞吸收了dsrna后，沉默信号通过系统性rnai的转运过程到达目标基因的表达细胞或组织中，诱发目标基因的特异性沉默。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

sequencelisting

<110>深圳大学

<120>一种黄曲条跳甲细胞色素p450基因及其应用

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<212>dna

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