双特异性抗体的制作方法

本发明涉及能够分别与pd-1和cd3特异性结合的双特异性抗体(以下，其缩写为“pd-1/cd3双特异性抗体”)，以及含有该双特异性抗体作为有效成分的药物组合物，及其药物治疗用途。

背景技术：

pd-1是属于免疫球蛋白家族的免疫抑制受体，并且是具有抑制通过抗原受体的刺激而活化的t细胞的免疫激活信号的功能的分子。从对pd-1敲除小鼠等的分析，已知pd-1信号在抑制自身免疫性疾病如自身免疫性扩张型心肌病、狼疮样综合征、自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、i型糖尿病和类风湿关节炎中起重要作用。因此，指出的是，增强pd-1信号的试剂可以是自身免疫性疾病的预防或治疗剂。

之前，已知识别pd-1的双特异性抗体是增强pd-1信号的试剂(专利参考文献1至3)。双特异性抗体由通过遗传工程而彼此连接的识别作为t细胞受体复合物成员的cd3的抗体的抗原识别位点和识别pd-1的抗体的抗原识别位点组成。双特异性抗体具有通过增加将pd-1带到t细胞受体复合物附近的频率来增强pd-1针对t细胞受体复合物的抑制信号的作用。此外，专利文献还指出，pd-1双特异性抗体可以用于预防或治疗自身免疫性疾病。

顺便提及，在蛋白质配制剂中，已经关注施用后立即发生的称为输注反应或细胞因子释放综合征的不良反应的表达。需要减少或抑制此类反应的配制剂。

在本发明的pd-1/cd3双特异性抗体中，充分降低了被认为是上述不良反应的原因的施用后的细胞因子产生刺激。因此，pd-1/cd3双特异性抗体有望成为抑制相关不良反应的表达的药物。

迄今尚未报道具有此类特征的双特异性抗体。

引文列表

专利参考文献

专利参考文献1：国际公开号wo2003/011911

专利参考文献2：国际公开号wo2004/072286

专利参考文献3：国际公开号wo2013/022091

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的是提供一种用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病等的新药剂。

问题的解决方案

本发明的发明人已经进行了认真的研究，并且专注于本发明的pd-1/cd3双特异性抗体作为能够解决上述问题的试剂。本发明人进一步证实了pd-1/cd3双特异性抗体可以是减少称为输注反应或细胞因子释放综合征的反应的表达的试剂，并已经完成了本发明。

此外，本发明的发明人已经发现，pd-1/cd3双特异性抗体具有允许pd-1和作为其配体的pd-l1之间的相互作用的特征，并发现此类特征有助于增强或维持pd-1/cd3双特异性抗体的作用。

也就是说，本发明涉及以下：

[1]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有选自以下的任一种vh：

(a)重链可变区(以下，“重链可变区”可以缩写为“vh”)，其具有

(a)包含seqidno.6中所示的氨基酸序列的重链可变区的互补决定区1(以下，“重链可变区的互补决定区1”可以缩写为“vh-cdr1”)；

(b)包含seqidno.7中所示的氨基酸序列的重链可变区的互补决定区2(以下，“重链可变区的互补决定区2”可以缩写为“vh-cdr2”)；和

(c)包含seqidno.8中所示的氨基酸序列的重链可变区的互补决定区3(以下，“重链可变区的互补决定区3”可以缩写为“vh-cdr3”)；

(b)vh，其具有

(a)包含seqidno.9中所示的氨基酸序列的vh-cdr1；

(b)包含seqidno.10中所示的氨基酸序列的vh-cdr2；和

(c)包含seqidno.11中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

(c)vh，其具有

(a)包含seqidno.12中所示的氨基酸序列的vh-cdr1；

(b)包含seqidno.13中所示的氨基酸序列的vh-cdr2；和

(c)包含seqidno.14中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

(d)vh，其具有

(a)包含seqidno.15中所示的氨基酸序列的vh-cdr1；

(b)包含seqidno.16中所示的氨基酸序列的vh-cdr2；和

(c)包含seqidno.17中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；和

(e)vh，其具有

(a)包含seqidno.18中所示的氨基酸序列的vh-cdr1；

(b)包含seqidno.19中所示的氨基酸序列的vh-cdr2；和

(c)包含seqidno.20中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

其中与cd3特异性结合的第二臂含有vh，其具有

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1；

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2；和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[2]根据前述项[1]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中在选自与pd-1特异性结合的第一臂中的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的任何一个或多个vh-cdr中，一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代；和/或在选自与cd3特异性结合的第二臂中的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的任何一个或多个vh-cdr中，一个至五个任意氨基酸残基可以分别用其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代。

[3]根据前述项[1]或[2]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中(i)与pd-1特异性结合的第一臂的vh具有：

(a)包含seqidno.6中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.7中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.8中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

(ii)与cd3特异性结合的第二臂的vh具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[4]根据前述项[1]或[2]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中(i)与pd-1特异性结合的第一臂的vh具有：

(a)包含seqidno.9中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.10中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.11中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

(ii)与cd3特异性结合的第二臂的vh具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[5]根据前述项[1]或[2]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中(i)与pd-1特异性结合的第一臂的vh具有：

(a)包含seqidno.12中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.13中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.14中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

(ii)与cd3特异性结合的第二臂的vh具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[6]根据前述项[1]或[2]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中(i)与pd-1特异性结合的第一臂的vh具有：

(a)包含seqidno.15中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.16中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.17中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

(ii)与cd3特异性结合的第二臂的vh具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[7]根据前述项[1]或[2]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中(i)与pd-1特异性结合的第一臂的vh具有：

(a)包含seqidno.18中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.19中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.20中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；并且

(ii)与cd3特异性结合的第二臂的vh具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[8]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有vh，其具有：

(a)vh-cdr1，其包含由hyj¹lh表示的氨基酸序列[其中j¹表示g(甘氨酸)或a(丙氨酸)，并且由j¹或其他表示的字母分别表示一字母氨基酸缩写]，

(b)vh-cdr2，其包含由wj²ntntu²nptx²aqgftg表示的氨基酸序列[其中j²表示l(亮氨酸)或i(异亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)或g(甘氨酸)，x²表示f(苯丙氨酸)或y(酪氨酸)，并且由j²、u²或x²或其他表示的字母分别表示与上文相同]，和

(c)vh-cdr3，其包含由gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v表示的氨基酸序列[其中j³表示m(甲硫氨酸)或l(亮氨酸)，u³表示h(组氨酸)或y(酪氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)或y(酪氨酸)，z³表示d(天冬氨酸)或e(谷氨酸)，并且由j³、u³、x³或z³表示的字母或其他字母表示与上文相同]，并且；

其中与cd3特异性结合的第二臂含有vh，其具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[9]根据前述项[8]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中

(a)j¹表示g(甘氨酸)，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)，x²表示f(苯丙氨酸)，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)，并且z³表示d(天冬氨酸)；

(b)j¹表示g(甘氨酸)，j²表示i(异亮氨酸)，u²表示g(甘氨酸)，x²表示y(酪氨酸)，j³表示l(亮氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示y(酪氨酸)，并且z³表示e(谷氨酸)；

(c)j¹表示a(丙氨酸)，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)，x²表示y(酪氨酸)，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示y(酪氨酸)，x³表示y(酪氨酸)，并且z³表示d(天冬氨酸)；或

(d)j¹表示a(丙氨酸)，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)，x²表示f(苯丙氨酸)，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)，并且z³表示d(天冬氨酸)。

[10]根据前述项[1]至[9]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh中框架区(以下，“框架”可以缩写为“fr”)中的框架区1(以下，可以缩写为“fr1”)、框架区2(以下，可以缩写为“fr2”)和框架区3(以下，可以缩写为“fr3”)分别对应于由种系v基因ighv7-4-1或其具有体细胞突变的基因编码的氨基酸序列。

[11]根据前述项[10]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh中的框架4(以下，“框架4”可以缩写为“fr4”)区包括由种系j基因jh6c或其具有体细胞突变的基因编码的氨基酸序列(排除vh-cdr3区中包括的氨基酸序列)。

[12]根据前述项[10]或[11]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh中的fr区由具有体细胞突变的种系v基因ighv7-4-1编码，并且其中fr区含有fr1区，其中在seqidno.21中所示的氨基酸序列中分别通过体细胞突变，位置13处的赖氨酸被或者可以被谷氨酰胺取代，位置16处的丙氨酸被或者可以被缬氨酸取代，或位置19处的赖氨酸被或者可以被甲硫氨酸取代，或者以或可以以其多种的任意组合进行。

[13]根据前述项[10]至[12]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂中vh的fr区由具有体细胞突变的种系v基因ighv7-4-1编码，并且其中fr区含有fr2区，其中在seqidno.21中所示的氨基酸序列中通过体细胞突变，位置37处的缬氨酸被或者可以被亮氨酸取代。

[14]根据前述项[10]至[13]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂中vh的fr区由具有体细胞突变的种系v基因ighv7-4-1编码，并且其中fr区含有fr3区，其中在seqidno.21中所示的氨基酸序列中分别通过体细胞突变，位置77处的丝氨酸被或者可以被苏氨酸取代，或位置84处的半胱氨酸被或者可以被丝氨酸或天冬酰胺取代，或者以或可以以其多种的任意组合进行。

[15]根据前述项[10]至[14]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh的fr4区由具有体细胞突变的种系j基因jh6c(排除编码vh-cdr3的基因区)编码，并且在fr4区的氨基酸序列(trp-gly-lys-gly-thr-thr*-val-thr-val-ser-ser)(seqidno.41)中，赖氨酸(lys)被或可以被谷氨酰胺或天冬酰胺取代，和/或标有星号的苏氨酸(thr)被或可以被亮氨酸取代。

[16]根据前述项[1]至[15]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

[17]根据前述项[1]和[3]至[7]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列。

[18]根据前述项[1]至[17]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

[19]根据前述项[1]和[3]至[18]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[20]根据前述项[1]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[21]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；并且其中与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

[22]根据前述项[1]或[3]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含seqidno.1中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[23]根据前述项[1]或[4]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含seqidno.2中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[24]根据前述项[1]或[5]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含seqidno.3中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[25]根据前述项[1]或[6]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含seqidno.4中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[26]根据前述项[1]或[7]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh包含seqidno.5中所示的氨基酸序列；并且与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[27]根据前述项[1]至[26]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂和/或与cd3特异性结合的第二臂分别具有轻链可变区(以下，“轻链可变区”可以缩写为“vl”)，其具有

(a)包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的轻链可变区的互补决定区1(以下，“轻链可变区的互补决定区1”可以缩写为“vl-cdr1”)；

(b)包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的轻链可变区的互补决定区2(以下，“轻链可变区的互补决定区2”可以缩写为“vl-cdr2”)；和

(c)包含seqidno.28中所示的氨基酸序列的轻链可变区的互补决定区3(以下，“轻链可变区的互补决定区3”可以缩写为“vl-cdr3”)。

[28]根据前述项[1]至[27]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂和/或与cd3特异性结合的第二臂分别具有包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl。

[29]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，其中(a)与pd-1特异性结合的第一臂具有包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列的vh；和包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl；并且

(b)与cd3特异性结合的第二臂具有包含seqidno.36中所示的氨基酸序列的vh；和包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl。

[30]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，

其中与pd-1特异性结合的第一臂(1)与具有vh和vl的与pd-1特异性结合的第一臂交叉竞争与pd-1的结合，vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，vl包含seqidno.25的氨基酸序列，或(2)与具有相同vh和vl的与pd-1特异性结合的单克隆抗体的可变区交叉竞争与pd-1的结合。

[31]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，其中以下项与pd-1特异性结合的第一臂交叉竞争与pd-1的结合：(1)具有vh和vl的与pd-1特异性结合的第一臂，vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，vl包含seqidno.25的氨基酸序列，或(2)具有相同vh和vl的与pd-1特异性结合的单克隆抗体的可变区。

[32]根据项[30]或[31]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂进一步(1)与具有vh和vl的与cd3特异性结合的第二臂交叉竞争与cd3的结合，所述vh包含seqidno.36所示的氨基酸序列，所述vl包含seqidno.25中所示的氨基酸序列，或(2)与具有相同vh和vl的与cd3特异性结合的单克隆抗体的可变区交叉竞争与cd3的结合。

[33]根据项[30]或[31]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂含有vh，其具有：

(a)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

[34]根据前述项[30]、[31]和[33]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列，或与其氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

[35]根据前述项[30]或[31]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂的vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

[36]根据前述项[30]、[31]和[33]至[35]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂具有vl，其具有：

(a)包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的vl-cdr1；

(b)包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的vl-cdr2；和

(c)包含seqidno.28中所示的氨基酸序列的vl-cdr3。

[37]根据前述项[30]、[31]和[33]至[35]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与cd3特异性结合的第二臂具有包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl。

[38]根据前述项[1]至[37]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中pd-1/cd3双特异性抗体是igg抗体。

[39]根据前述项[38]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中前述项[38]中的igg抗体是igg1或igg4抗体。

[40]根据前述项[38]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中前述项[38]中的igg抗体是igg1抗体。

[41]根据前述项[38]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中前述项[38]中的igg抗体是igg4抗体。

[42]根据前述项[40]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中分别在前述项[40]中的igg1抗体的两个重链恒定区中，根据eu编号系统的位置235处的亮氨酸被甘氨酸取代，和/或根据eu编号系统的位置236处的甘氨酸被精氨酸取代。

[43]根据前述项[40]或[42]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸以及根据eu编号系统的位置366处的苏氨酸两者均被赖氨酸取代，并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且根据eu编号系统的位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代。

[44]根据前述项[40]或[42]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且根据eu编号系统的位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代；并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸和根据eu编号系统的位置366处的苏氨酸两者均被赖氨酸取代。

[45]根据前述项[40]和[42]至[44]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中在前述项[40]和[42]至[44]中任一项的igg1抗体的两个重链恒定区中，根据eu编号系统的位置447处的赖氨酸是缺失的。

[46]根据前述项[41]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中在前述项[41]中的igg4抗体的两个重链恒定区中，根据eu编号系统的位置228处的丝氨酸分别被脯氨酸取代。

[47]根据前述项[1]至[38]、[40]、[42]和[44]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链具有包含seqidno.23中所示的氨基酸序列的重链恒定区。

[48]根据前述项[1]至[38]、[40]、[42]、[44]和[47]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链具有包含seqidno.24中所示的氨基酸序列的重链恒定区。

[49]根据前述项[1]至[48]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中具有与pd-1特异性结合的第一臂的vl的轻链和/或具有与cd3特异性结合的第二臂的vl的轻链具有包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

[50]pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其具有与pd-1特异性结合的第一臂和与cd3特异性结合的第二臂，其中：

(a)具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链具有vh和重链恒定区，vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，重链恒定区包含seqidno.23中所示的氨基酸序列；

(b)具有与pd-1特异性结合的第一臂的vl的轻链具有包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl，和包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区；

(c)具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链具有包含seqidno.36中所示的氨基酸序列的vh，和包含seqidno.24中所示的氨基酸序列的重链恒定区；并且

(d)具有与cd3特异性结合的第二臂的vl的轻链具有包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl，和包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

[51]根据前述项[1]至[50]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂允许pd-1和pd-l1之间的相互作用。

[52]根据前述项[1]至[51]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中细胞因子生成是充分降低的。

[53]根据前述项[1]至[50]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，并且其中细胞因子生成是充分降低的。

[54]根据前述项[52]或[53]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中细胞因子包括至少il-2、ifn-γ或tnf-α。

[55]根据前述项[1]至[54]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中pd-1是人pd-1，且cd3是人cd3。

[56]根据前述项[1]至[55]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中cd3是cd3ε。

[57]根据前述项[1]至[56]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中pd-1/cd3双特异性抗体是单克隆抗体。

[58]根据前述项[1]至[57]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，其中pd-1/cd3双特异性抗体是分离的抗体。

[1-1]药物组合物，其包括根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段和药学上可接受的载体。

[2-1]用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分。

[2-2]根据前述项[2-1]的药剂，其中自身免疫性疾病包括贝赫切特氏病(behcet'sdisease)、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化(系统性硬皮病和进行性系统性硬化)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(periarteritisnodosa)(结节性多动脉炎和显微镜下多血管炎(microscopicpolyangiitis))、主动脉炎综合征(高安动脉炎(takayasu’sarteritis))、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年型特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、舍格伦氏综合征(sjogren'ssyndrome)、成人斯蒂尔氏病(adultstill'sdisease)、血管炎、变应性肉芽肿性血管炎、超敏感性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、anca相关血管炎(例如，肉芽肿病伴多血管炎和嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎)、寇甘氏综合征(cogan'ssyndrome)、rs3pe、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、igg4相关疾病(例如，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰岛炎)、格-巴二氏综合征(guillain-barresyndrome)、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肺出血肾炎综合征(goodpasture'ssyndrome)、快速进行性肾小球肾炎、巨幼细胞贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少、特发性血小板减少性紫癜、巴塞多病(basedowdisease)(格雷夫斯病(graves'disease)(甲状腺功能亢进))、桥本病(hashimotodisease)、自身免疫性肾上腺皮质功能不全、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生氏病(addison'sdisease)(慢性肾上腺皮质功能减退)、特发性艾迪生氏病、i型糖尿病、缓慢进行性i型糖尿病(成人潜伏性自身免疫性糖尿病)、局灶性硬皮病(focalscleroderma)、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性iga大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解、斑秃、白癜风、寻常性白癜风、视神经脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘多神经病、多灶性运行神经病、结节病、巨细胞性动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病(haradadisease)、自身免疫性视神经病变、特发性无精子症、习惯性流产、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(crohn'sdisease))、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹、移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性慢性鼻鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

[2-3]用于预防移植物抗宿主病(gvhd)、抑制移植物抗宿主病(gvhd)的症状进展或复发和/或治疗移植物抗宿主病(gvhd)的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分。

[2-4]用于预防i型糖尿病、抑制i型糖尿病的症状进展或复发和/或治疗i型糖尿病的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分，并且其与选自以下的任一种或多种一起施用：胰岛素配制剂(例如，人胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素等)、磺酰脲剂(例如，格列本脲(glibenclamide)、格列齐特(gliclazide)或格列美脲(glimepiride))、速效胰岛素分泌促进剂(例如，那格列奈(nateglinide))、双胍制剂(例如，二甲双胍)、胰岛素抵抗改善剂(例如，吡格列酮(pioglitazone))、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)等)、糖尿病神经病变治疗剂(例如，依帕司他(epalrestat)、美西律(mexiletine)、咪达普利(imidapril)等)、glp-1类似物制剂(例如，利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利西那肽(lixisenatide)等)和dpp-4抑制剂(西格列汀(sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、阿格列汀(alogliptin)等)。

[2-5]用于预防多发性硬化、抑制多发性硬化的症状进展或复发和/或治疗多发性硬化的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分，并且其与选自以下的任一种或多种一起施用：类固醇剂(例如，醋酸可的松、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、醋酸氟可的松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙乙酸丁酯、泼尼松龙磷酸钠、醋酸卤泼尼松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、曲安西龙(triamsinolone)、醋酸曲安西龙、曲安奈德(triamsinoloneacetonide)、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、棕榈酸地塞米松、醋酸帕拉米松或倍他米松等)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷(glatirameracetate)、米托蒽醌、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、克拉屈滨、促肾上腺皮质激素(acth)、促皮质素、咪唑立宾、他克莫司、芬戈莫德(fingolimod)和阿仑珠单抗。

[2-6]用于预防系统性红斑狼疮、抑制系统性红斑狼疮的症状进展或复发和/或治疗系统性红斑狼疮的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分，并且其与选自以下的任一种或多种一起施用：类固醇剂(例如，前述项[2-5]中提及的类固醇剂)、免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司或芬戈莫德)和贝利木单抗(belimumab)。

[2-7]用于预防类风湿关节炎、抑制类风湿关节炎的症状进展或复发和/或治疗类风湿关节炎的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分，并且其与选自以下的任一种或多种一起施用：类固醇剂(例如，前述项[2-5]中提及的类固醇剂)、抗风湿剂(例如，甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、布西拉明(bucillamine)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾、他克莫司等)、抗细胞因子剂(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、托珠单抗(tocilizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(sertolizumab))和阿巴西普(abatacept)。

[2-8]用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的药剂，其含有根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段作为活性成分，并且其与前述项[2-4]至[2-7]中所述的任一种或多种试剂一起施用。

[2-9]用于预防前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病、抑制前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的症状进展或复发和/或治疗前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的药剂，将其施用于患者，所述患者被施用前述项[2-4]至[2-7]中所提及的药物的任一种或多种。

[2-10]用于预防前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病、抑制前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的症状进展或复发和/或治疗前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的药剂，将其在施用前述项[2-4]至[2-7]中所提及的药物的任一种或多种之后施用。

[2-11]用于预防前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病、抑制前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的症状进展或复发和/或治疗前述项[2-4]至[2-8]中所提及的疾病的药剂，将其在施用前述项[2-4]至[2-7]中所提及的药物的任一种或多种之前施用。

[3-1]静脉内注射配制剂，其包括前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段和药学上可接受的载体。

[3-2]根据上述[3-1]的静脉内注射配制剂，其用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展、抑制自身免疫性疾病的复发和/或治疗自身免疫性疾病。

[3-3]根据前述项[3-1]或[3-2]的静脉内注射配制剂，其用于滴注。

[4-1]分离的多核苷酸或其片段，其编码具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链，所述与pd-1特异性结合的第一臂构成选自前述项[1]至[58]的pd-1/cd3双特异性抗体中的任一个。

[4-2]分离的多核苷酸或其片段，其编码与pd-1特异性结合的第一臂的vh，所述与pd-1特异性结合的第一臂构成选自前述项[1]至[58]的pd-1/cd3双特异性抗体中的任一个。

[4-3]根据前述项[4-1]或[4-2]的分离的多核苷酸或其片段，其中与pd-1特异性结合的第一臂的vh由包含选自seqidno.30至34的任一个中所示的序列的多核苷酸编码。

[4-4]分离的多核苷酸或其片段，其具有包含选自seqidno.30至34的任一个中所示的序列的多核苷酸。

[5-1]表达载体，其具有根据前述项[4-1]至[4-4]中任一项的多核苷酸。

[6-1]动物细胞，所述动物细胞中转染有前述项[5-1]的表达载体，或者所述动物细胞由转染的载体转化。

[7-1]用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的方法，其包括将有效量的根据前述项[1]至[58]中任一项的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段施用于患者。

[8-1]选自前述项[1]至[58]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段，用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病。

[9-1]选自前述项[1]至[58]的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段在制备用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

[10-1]分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其与具有vh和vl的与pd-1特异性结合的抗体交叉竞争与pd-1的结合，所述vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，所述vl包含seqidno.25的氨基酸序列。

[10-2]分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中由具有vh和vl的与pd-1特异性结合的抗体与分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段交叉竞争与pd-1的结合，所述vh包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列，所述vl包含seqidno.25的氨基酸序列。

[10-3]分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其具有选自以下的任一种vh：

(a)vh，其具有

(a)包含seqidno.6中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.7中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.8中所示的氨基酸序列的vh-cdr3，

(b)vh，其具有

(a)包含seqidno.9中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.10中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.11中所示的氨基酸序列的vh-cdr3，

(c)vh，其具有

(a)包含seqidno.12中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.13中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.14中所示的氨基酸序列的vh-cdr3，

(d)vh，其具有

(a)包含seqidno.15中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.16中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.17中所示的氨基酸序列的vh-cdr3，和(e)vh，其具有

(a)包含seqidno.18中所示的氨基酸序列的vh-cdr1，

(b)包含seqidno.19中所示的氨基酸序列的vh-cdr2，和

(c)包含seqidno.20中所示的氨基酸序列的vh-cdr3，和vl，其具有

(a)包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的vl-cdr1，

(b)包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的vl-cdr2，和

(c)包含seqidno.28中所示的氨基酸序列的vl-cdr3。

[10-4]根据前述项[10-3]的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中在选自vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的任何一个或多个cdr中，一个至五个任意氨基酸残基可以用其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代。

[10-5]根据前述项[10-3]或[10-4]的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其具有包含选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5的任一个中所示的氨基酸序列的vh，或包含具有其氨基酸序列的至少80％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列的vh，以及包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl。

[10-6]根据前述项[10-1]至[10-5]中任一项的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中pd-1是人pd-1。

[10-7]根据前述项[10-1]至[10-6]中任一项的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中抗pd-1抗体是igg抗体。

[10-8]根据前述项[10-7]的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中前述项[10-7]中所述的igg抗体是igg1抗体或igg4抗体。

[10-9]根据前述项[10-7]的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中前述项[10-7]中所述的igg抗体是igg1抗体。

[10-10]根据前述项[10-7]的分离的抗pd-1单克隆抗体或其抗体片段，其中前述项[10-7]中所述的igg抗体是或igg4抗体。

发明效果

由于本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的细胞因子产生的可诱导性降低，施用后的输注反应或细胞因子释放综合征的发生得以抑制。此外，pd-1/cd3双特异性抗体允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，并有望增强或维持对预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的作用。

附图说明

图1显示共同轻链的vl和恒定区的每个氨基酸序列。

图2显示共同轻链的vl中的每个cdr氨基酸序列。

图3显示分别由种系v基因ighv7-4-1和ighv3-33编码的氨基酸序列。

图4显示与pd-1特异性结合的抗体(以下，可以缩写为“抗pd-1抗体”)的每个克隆的vh与种系基因ighv7-4-1和jh6c之间的序列比对。在附图中，每个克隆的氨基酸序列中，“-”表示与相应的种系基因ighv7-4-1或jh6c相同的氨基酸，而具有每个氨基酸的简化字符的部分表示不同于种系基因的氨基酸。

图5显示每个抗pd-1抗体克隆的vh氨基酸序列。

图6显示每个抗pd-1抗体克隆的vh中的每个cdr氨基酸序列。

图7显示作为与cd3特异性结合的抗体(以下，可以缩写为“抗cd3抗体”)的cd3-2克隆的vh氨基酸序列。

图8显示作为抗cd3抗体的cd3-2克隆的vh中每个cdr的氨基酸序列。

图9显示pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的每条重链中恒定区的氨基酸序列。

图10显示wo2005/118635中所述的抗cd3抗体克隆15c3的vh氨基酸序列。注意，带下划线的氨基酸表示第55个甘氨酸，其在产生克隆cd3-1时被转化为丙氨酸。

图11显示biacore测量结果，其证明了每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆与pd-1和cd3的结合活性。

图12显示流式细胞术，其证明了每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆对pd-1和cd3的同时结合特性。

图13显示流式细胞术，其证明了每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆对pd-1/pd-l1相互作用的影响。

图14显示每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆对活化人t细胞产生ifn-γ的作用。这里注意在附图中，“ctrl”表示对照组。

图15显示pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆(pd1-1(bi)和pd1-2(bi))在实验性变应性脑脊髓炎小鼠模型(eae模型)中的治疗作用。

图16显示pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆(pd1-3(bi)和pd1-4(bi))在实验性变应性脑脊髓炎小鼠模型中的治疗作用。

图17显示pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆(pd1-5(bi)和pd1-6(bi))在实验性变应性脑脊髓炎小鼠模型中的治疗作用。

图18显示每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆对人外周血单个核细胞产生细胞因子的作用的结果。

图19显示pd1-5(bi)针对每个pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆与pd-1的结合的交叉竞争活性。

具体实施方式

人中的pd-1(程序性细胞死亡-1)是一种膜型蛋白，由genbank登录号np_005009代表的氨基酸序列组成。在本说明书中，除非另外明确定义，否则术语“pd-1”可以用作包括其所有同等型及其变体的含义，其中本发明中“与pd-1特异性结合的第一臂”的表位是保守的。在本发明中，pd-1优选是人pd-1。

cd3是通过与t细胞受体缔合形成t细胞受体复合物的膜型蛋白。在本说明书中，除非另外明确定义，否则术语“cd3”可以用作包括亚型(ε、δ、γ和ζ亚型)及其变体的含义，其中本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”的表位是保守的。在本发明中，cd3优选是cd3ε，和人cd3，且更优选是人cd3ε。

在本说明书中，术语“分离”意指通过从含有从宿主细胞中提取的多种或无数数量的组分的杂质中进行鉴定、分开和/或纯化而获得的单一基本纯的组分。

在本说明书中，术语“单克隆抗体”意指从与相同特定抗原结合的基本上均质的抗体群体获得的抗体。

在本说明书中，术语“双特异性抗体”意指对两个不同的抗原分子或分子中的表位具有结合特异性的抗体，此外，术语“双特异性单克隆抗体”意指从基本上均质的抗体群体获得的双特异性抗体。

本发明涉及能够与pd-1和cd3特异性结合的双特异性抗体(在本说明书中，可以缩写为“pd-1/cd3双特异性抗体”)。在本发明中，pd-1/cd3双特异性抗体优选为pd-1/cd3双特异性单克隆抗体，并且更优选为分离的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体，并且进一步优选为分离的人pd-1/人cd3双特异性单克隆抗体。在本文中，“分离的人pd-1/人cd3双特异性单克隆抗体”意指人pd-1和人cd3的分离的双特异性单克隆抗体。

pd-1双特异性抗体的示例性实施方案包括，例如双抗体(diabodies)、双特异性sc(fv)2、双特异性微型抗体(minibodies)、双特异性f(ab')2、双特异性杂交抗体、共价双抗体(双特异性dart)、双特异性(fvcys)2、双特异性f(ab'-拉链)2、双特异性(fv-拉链)2、双特异性三链抗体和双特异性mab²等。

双抗体是单链肽的二聚体，其中识别不同抗原的vh和vl通过肽接头彼此连接(proc.natl.acad.sci.usa,1993,第90卷,第14期,第6444-6448页)。

双特异性sc(fv)2是以下述方式修饰的低分子抗体，所述方式使得识别不同抗原的两个抗体中的两对vh/vl通过肽接头彼此连接成连续的单链形式(参见j.biologicalchemistry,1994,269:第199-206页)。

双特异性f(ab')2是低分子抗体，其中识别两种不同抗原的抗体的fab'片段通过例如二硫键共价键合。

双特异性微型抗体是低分子抗体，其中以使得抗体的恒定区ch3结构域与识别不同抗原的scfv连接的此类方式修饰的低分子抗体片段通过例如ch3上的二硫键共价键合(参见biochemistry,1992,第31卷,第6期,第1579-1584页)。

双特异性杂交抗体是完整的抗体，其中识别两种不同抗原的重链/轻链复合物通过例如二硫键彼此共价结合。

在本发明中，优选的双特异性抗体的形式的实例包括双特异性杂交抗体。

可以例如使用杂交的杂交瘤方法从杂交瘤产生双特异性杂交抗体(参见us4474893)。或者，可以通过从共表达四种分别编码识别不同抗原的抗体的重链和轻链的cdna的哺乳动物细胞分泌而产生双特异性杂交抗体。

本发明中使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法(参见，例如，kohlerandmilstein等,natur(1975),第256卷,第495-97页,hongo等,hybridoma(1995),第14卷,第3期,第253-260页,harlow等,antibodies:alaboratorymanual,(coldspringharborlaboratorypress(1988),第2期)和hammerling等,monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas,第563-681页(elsevier,n.y.,1981))、重组dna方法(参见，例如us4816567)、噬菌体展示方法(参见，例如ladner等,us5223409,us5403484和us5571698,dower等,us5427908和us5580717,mccafferty等,us5969108和us6172197,以及griffiths等,us5885793,us6521404,us6544731,us6555313,us6582915和us6593081)产生。

当施用于人时，抗体或单克隆抗体可以以嵌合抗体、人源化抗体或完整人抗体的形式产生，以减少或消除其抗原性。

术语“嵌合抗体”意指其恒定区序列和可变区序列衍生自不同哺乳动物的抗体。嵌合抗体的实例包括其可变区序列衍生自小鼠抗体而恒定区序列衍生自人抗体的抗体。嵌合抗体可以通过使用熟知的方法将编码从上述产生抗体的杂交瘤分离的抗体可变区的基因与编码人衍生的抗体的恒定区的基因连接来产生(参见例如cabilly等,us4816567)，所述杂交瘤通过熟知的技术通过杂交瘤方法、重组dna方法或噬菌体展示方法分离。

术语“人源化抗体”意指通过例如将衍生自人以外的哺乳动物(如小鼠)的种系的抗体的互补决定区(cdr)序列嫁接到人抗体的人构架序列中来制备的抗体。另外，人源化抗体可以通过使用熟知的方法将编码从上述产生抗体的杂交瘤(其通过上述方法分离)分离的抗体的cdr的基因与编码人衍生的抗体的框架区的基因连接来产生(参见，例如，winter,us5225539和us5530101；queen等,us5585089和us6180370)。

术语“人抗体”或“完整的人抗体”意指其中由框架区和cdr区组成的可变区和恒定区两者均衍生自人种系免疫球蛋白序列的抗体。要在本发明中使用的人抗体可以通过使用转化为产生人抗体的小鼠的方法产生，例如humab小鼠(参见，例如，lonbergandkay等us5545806,us5569825,us5625126,us5633425,us5789650,us5877397,us5661016,us5814318,us5874299和us5770429)，km小鼠(参见，例如，ishida等,wo2002/43478)，xeno小鼠(参见，例如，us5939598,us6075181,us6114598,us6150584和us6162963)或tc小鼠(参见，例如，tomizuka等,proc.natl.acad.sci.usa(2000),pp.722-727)。人抗体也可以使用scid小鼠制备，所述scid小鼠中已经重建有人免疫细胞，使得在免疫后产生人抗体应答(参见，例如，wilson等的us5476996和us5698767)。此外，本发明中使用的人抗体也可以通过上述噬菌体展示方法来产生。

在本说明书中，pd-1/cd3双特异性抗体的术语“抗体片段”是全长抗体的一部分，并且是具有与pd-1的抗原结合部分和与cd3的抗原结合部分的抗体。其实例包括f(ab′)2等。本文中，抗原结合部分意指可以与其抗原结合的抗体的最小单位，并且例如，其由vh和vl的每一个中的三个cdr和用于排列cdr使得可以通过那些cdr的组合识别靶抗原的框架区组成。

在本说明书中，术语“共同轻链”意指可以与两条或更多条不同的重链缔合并且可以表现出与每种抗原的结合能力的轻链(dewildtrm,j.mol.biol.(1999),vol.285,pp.895-901,dekruif等,j.mol.biol.(2009),vol.387,pp.548-58,wo2004/009618,wo2009/157771和wo2014/051433)。此类共同轻链的优选实例包括由人κ轻链igvκ1-39*01/igjκ1*01(imgt数据库的命名法)种系基因(以下，缩写为“igvk1-39/jk1共同轻链”)编码的轻链。更优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3，并且进一步优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl包含seqidno.25中所示的氨基酸序列。此外，共同轻链的恒定区的优选实例包括包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区。本发明中使用的共同轻链的vl和恒定区的每个氨基酸序列均显示于图1中，并且可变区的每个cdr氨基酸序列显示于图2中。

在本说明书中，术语“同种型”意指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，igm或igg)。本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的同种型的优选实例包括igg，且更优选igg1或igg4。本文中使用的igg1优选是消除或减少了其与fc受体的结合。具体地，可以通过取代、缺失或插入其重链恒定区的任意氨基酸来获得消除或减少与fc受体的结合的igg1抗体。其实例包括以下抗体，其中在两个重链恒定区的每一个或其铰链区上，根据eu编号系统的位置235处的亮氨酸被甘氨酸取代，和/或根据eu编号系统的位置236处的甘氨酸被精氨酸取代。此外，为了降低抗体的异质性，优选其中已缺失c端处的氨基酸，例如根据eu编号系统的位置447处的赖氨酸的抗体。此外，当双特异性抗体是igg4时，为了抑制抗体分子中的交换，优选其中其重链恒定区中的任意氨基酸被取代、缺失或插入的变体。例如，优选其中位于铰链区中和根据eu编号系统的位置228处的丝氨酸被脯氨酸取代的抗体。这里注意，在本说明书中，根据kabat编号指定分配给抗体可变区中cdr和框架的氨基酸位置(参见sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstituteofhealth,bethesda,md.,1987和1991))。此外，恒定区中的氨基酸是根据基于kabat氨基酸位置的eu编号系统表示的(参见sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nihpublicationno.91-3242)。

在本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的fc区中，其中的任意氨基酸可以被取代，使得两条不同的重链容易彼此缔合。优选实施方案的实例包括pd-1/cd3双特异性抗体，其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被赖氨酸取代并且根据eu编号系统的位置366处的苏氨酸被赖氨酸取代；并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且根据eu编号系统的位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代。实例还包括pd-1/cd3双特异性抗体，其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链中的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代；并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链中的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被赖氨酸取代并且根据eu编号系统的位置366处的苏氨酸被赖氨酸取代。

与pd-1特异性结合的第一臂

在本说明书中，“与pd-1特异性结合的第一臂”(以下，其可以缩写为“第一臂”)意指含有至少与pd-1特异性结合的抗体的vh的抗体的一部分(以下，其可以缩写为“抗pd-1抗体”)，而不管其是否包含在抗体或其抗体片段的一部分中，或者不是作为一部分而是作为单一体存在。例如，此类第一臂由抗pd-1抗体的vh和构成相同抗pd-1抗体的共同轻链的vl组成。此外，第一臂的实例还包括包含vh和vl的抗体的fab部分。在本文中，术语“与pd-1特异性结合”用作以下特征：其可以以至少1×10^-5m，优选1×10^-7m，并且更优选地超出1x10^-9m亲和力(解离常数(kd值))的结合活性直接与pd-1结合，并且基本上不与属于所谓cd28家族受体的其他受体成员(例如至少cd28、ctla-4和icos)结合。此外，“与pd-1特异性结合的抗体”或“抗pd-1抗体”中的“抗体”意指由通过二硫键连接的两条重链和两条轻链组成的全长抗体，并优选其单克隆抗体。

本文中，“与pd-1特异性结合的第一臂”的实例包括：

(a)vh-cdr1，其包含由hyj¹lh表示的氨基酸序列[其中j¹表示g(甘氨酸)或a(丙氨酸)，并且在本文中，由j¹或其他表示的字母分别表示一字母氨基酸缩写]；

(b)vh-cdr2，其包含由wj²ntntu²nptx²aqgftg表示的氨基酸序列[其中j²表示l(亮氨酸)或i(异亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)或g(甘氨酸)，x²表示f(苯丙氨酸)或y(酪氨酸)，并且在本文中，由j²、u²或x²或其他表示的字母分别如上进行表示]；和

(c)vh-cdr3，其包含由gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v表示的氨基酸序列[其中j³表示m(甲硫氨酸)或l(亮氨酸)，u³表示h(组氨酸)或y(酪氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)或y(酪氨酸)，z³表示d(天冬氨酸)或e(谷氨酸)，并且在本文中，由j³、u³、x³或z³表示的字母或其他字母分别如上进行表示]。

本文中，“与pd-1特异性结合的第一臂”的优选实施方案包括含有以下的那些：

(1a)具有每个vh-cdr的vh，其中在作为vh-cdr1的hyj¹lh序列中的j¹表示g(甘氨酸)；在作为vh-cdr2的wj²ntntu²nptx²aqgftg序列中，分别地，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)并且x²表示f(苯丙氨酸)；在作为vh-cdr3的gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v序列中，分别地，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)并且z³表示d(天冬氨酸)；

(2a)具有每个vh-cdr的vh，其中在作为vh-cdr1的hyj¹lh序列中的j¹表示g(甘氨酸)；在作为vh-cdr2的wj²ntntu²nptx²aqgftg序列中，分别地，j²表示i(异亮氨酸)，u²表示g(甘氨酸)并且x²表示y(酪氨酸)；在作为vh-cdr3的gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v序列中，分别地，j³表示l(亮氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示y(酪氨酸)并且z³表示e(谷氨酸)；

(3a)具有每个vh-cdr的vh，其中在作为vh-cdr1的hyj¹lh序列中的j¹表示a(丙氨酸)；在作为vh-cdr2的wj²ntntu²nptx²aqgftg序列中，分别地，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)并且x²表示y(酪氨酸)；在作为vh-cdr3的gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v序列中，分别地，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示y(酪氨酸)，x³表示y(酪氨酸)并且z³表示d(天冬氨酸)；和

(4a)具有每个vh-cdr的vh，其中在作为vh-cdr1的hyj¹lh序列中的j¹表示a(丙氨酸)；在作为vh-cdr2的wj²ntntu²nptx²aqgftg序列中，分别地，j²表示l(亮氨酸)，u²表示e(谷氨酸)并且x²表示f(苯丙氨酸)；在作为vh-cdr3的gdj³vvpttiwnyyu³x³mz³v序列中，分别地，j³表示m(甲硫氨酸)，u³表示h(组氨酸)，x³表示f(苯丙氨酸)并且z³表示d(天冬氨酸)。

此外，作为另一个实施方案的优选实例，“与pd-1特异性结合的第一臂”包括选自以下的任一种vh：

(1b)vh，其具有包含seqidno.6中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.7中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.8中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

(2b)vh，其具有包含seqidno.9中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.10中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.11中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

(3b)vh，其具有包含seqidno.12中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.13中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.14中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；

(4b)vh，其具有包含seqidno.15中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.16中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.17中所示的氨基酸序列的vh-cdr3；和

(5b)vh，其具有包含seqidno.18中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.19中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.20中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

此外，本发明的“与pd-1特异性结合的第一臂”包括其中在选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一种vh的每个vh-cdr中，1至5个任意氨基酸残基被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代，并且其与不具有任何氨基酸取代的原始第一臂具有基本上相同的与pd-1的结合活性的那些。例如，对于vh-cdr1，一个氨基酸残基被其保守氨基酸取代。对于vh-cdr2或vh-cdr3，一个或两个氨基酸残基分别被其保守氨基酸取代。在本文中，用保守氨基酸取代意指与具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸包括丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸包括天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸包括半胱氨酸和甲硫氨酸。用保守氨基酸取代的优选实例包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的取代，苯丙氨酸和酪氨酸之间的取代，赖氨酸和精氨酸之间的取代，丙氨酸和缬氨酸之间的取代以及天冬酰胺和谷氨酰胺之间的取代。此外，在本文中，上述句子“与不具有任何氨基酸取代的原始第一臂具有基本上相同的与pd-1的结合活性”意指与不具有任何相同氨基酸取代的原始第一臂的与pd-1的结合活性相比，被相同氨基酸取代的第一臂的与pd-1的结合活性为95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高。

此外，本发明中的“与pd-1特异性结合的第一臂”包括含有具有每个vh-cdr的vh的那些，其具有上述特定氨基酸序列并且其中vh的框架由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码。例如，选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任何一个所示的vh可以由其中种系v基因是ighv7-4-1且种系j基因是jh6c或其具有体细胞突变的基因的vdj重组基因编码。本文中，由种系v基因ighv7-4-1编码的氨基酸序列对应于seqidno.21中所示的氨基酸序列(图3)。

本发明的与pd-1特异性结合的第一臂的vh的框架可以由具有体细胞突变的种系vdj重组基因编码。例如，由于由其中种系v基因为ighv7-4-1的选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任何一个表示的vh的fr1、fr2和fr3在图4中所示的氨基酸的位置处与由ighv7-4-1基因编码的氨基酸序列不同，它们在每个位置处经历了体细胞突变。例如，关于fr1区，在seqidno.21中所示的氨基酸序列中，分别地，位置13处的赖氨酸可以被谷氨酰胺取代，位置16处的丙氨酸可以被缬氨酸取代，或位置19处的赖氨酸可以被甲硫氨酸取代，或者其可以以其多种的任意组合取代。关于fr2区，在seqidno.21中所示的氨基酸序列中位置37处的缬氨酸被亮氨酸取代。关于fr3区，在seqidno.21中所示的氨基酸序列中，分别地，位置77处的丝氨酸可以被苏氨酸取代，或位置84处的半胱氨酸可以被丝氨酸或天冬酰胺取代，或者其可以以其多种的任意组合取代。此外，关于选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任一个所示的vh的fr4区，在衍生自j基因jh6c的fr4区的氨基酸序列(trp-gly-lys-gly-thr-thr*-val-thr-val-ser-ser)(seqidno.41)中，赖氨酸(lys)可以被谷氨酰胺或天冬酰胺取代，和/或标有星号的苏氨酸(thr)可以被亮氨酸取代。包括上述任何氨基酸取代的组合的fr1、fr2、fr3和fr4中的每一个对与pd-1特异性结合的第一臂的功能没有实质性影响，并且可以用作框架。

此外，本发明的“与pd-1特异性结合的第一臂”包括如下那些，其具有含有上述氨基酸序列的cdr，并且其中vh中的fr氨基酸序列由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码。此类第一臂的实例包括具有vh的那些，所述vh包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列。

此外，此类“与pd-1特异性结合的第一臂”的实例包括具有vh的那些，所述vh包含与选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，进一步优选地至少98％同一性，并且进一步更优选至少99％的同一性的氨基酸序列，并且其中与原始第一臂中vh的氨基酸序列的差异对与pd-1的结合活性没有实质性影响(以下，可以缩写为“同源第一臂”)。在本文中，用于比较氨基酸序列的同一性的术语“％同一性”被定义为当两个序列比对时，与参考氨基酸序列(在本文中，最大化序列同一性而需要时已引入有缺口的参考氨基酸序列)相同的氨基酸序列的百分比。此外，在本文中，句子“与原始第一臂中vh的氨基酸序列的差异对与pd-1的结合活性没有实质性影响”意指与原始第一臂的结合活性相比，同源第一臂与pd-1的结合活性为95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高。

在又一个实施方案中，本发明的“与pd-1特异性结合的第一臂”还包括具有抗pd-1抗体的可变区(本文中，可变区包含构成其的vh和vl)的那些，其(1)与具有由选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任一个表示的vh或包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh以及共同轻链的vl的第一臂交叉竞争与pd-1的结合，或(2)与具有相同vh和vl的与pd-1特异性结合的单克隆抗体的可变区交叉竞争与pd-1的结合，并且进一步包括具有抗pd-1抗体的可变区的那些，所述抗pd-1抗体与以下项交叉竞争与pd-1的结合：(3)具有由选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任一个表示的vh或包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh以及共同轻链的vl的第一臂，或(4)具有相同vh和vl的与pd-1特异性结合的单克隆抗体的可变区。在本文中，句子“交叉竞争与pd-1的结合”意指其通过结合与本说明书中示例的第一臂的表位相同或部分重叠的表位，抑制第一臂与pd-1的结合，无论其程度如何，或者意指通过示例的第一臂抑制与表位结合的抗体与pd-1的结合，无论其程度如何，所述表位与示例的第一臂的表位相同或部分重叠。交叉竞争可以通过竞争性结合测定法来评估。例如，可以使用biacore分析、elisa测定法、流式细胞术、酶联免疫吸附测定法(elisa)、荧光能量转移法(fret)和荧光微体积测定技术(fmat(注册商标))对其进行测定。

与具有由上述(5b)所示的vh和共同轻链的vl的第一臂交叉竞争与pd-1的结合的第一臂的实例包括具有由选自上述(1b)至(4b)的任何一个所示的vh和共同轻链的vl(优选地，具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的vl-cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的vl-cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的vl-cdr3的vl)的第一臂，以及进一步地具有包含选自seqidno.1至4的任何一个中所示的氨基酸序列的vh和共同轻链的vl(优选地，包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl)的第一臂。

此外，与具有由选自上述(1b)至(4b)的任何一个所示的vh或包含选自seqidno.1至4的任何一个中所示的氨基酸序列的vh和共同轻链的vl的第一臂交叉竞争与pd-1结合的第一臂的实例包括具有由上述(5b)所示的vh和共同轻链的vl(优选地，具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的vl-cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的vl-cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的vl-cdr3的vl)的第一臂，以及进一步地具有包含选自seqidno.5中所示的氨基酸序列的vh和共同轻链的vl(优选地，包含seqidno.25中所示的氨基酸序列的vl)的第一臂。

在本文中，本发明的“与pd-1特异性结合的第一臂”的优选实例包括具有选自上述(1b)至(5b)中任一个所示的vh的第一臂。此外，如上所述，优选的第一臂还包括如下那些，其中在vh的每个cdr中1至5个任意氨基酸残基被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代，并且用氨基酸取代基本上不影响与pd-1的结合活性。此外，如上所述，优选的第一臂包括如下那些，其具有其中框架的氨基酸序列由种系v基因ighv7-4-1或j基因jh6c或其具有体细胞突变的基因编码的vh。然后，第一臂的更优选的实例包括具有包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh的那些。

此外，本发明的与pd-1特异性结合的第一臂优选共同轻链，并且此类共同轻链的优选实例包括由igvk1-39/jk1共同轻链编码的轻链。更优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3，并且进一步优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl包含seqidno.25中所示的氨基酸序列。此外，共同轻链的恒定区的优选实例包括包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

此外，“与pd-1特异性结合的第一臂”的优选实例包括允许pd-1与pd-l1之间的相互作用，pd-1与pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用。在本文中，句子“允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用”意指即使当存在有可溶形式pd-l1或pd-l2的浓度的20倍过量的本发明的pd-1/cd3双特异性抗体时，与不存在本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的情况相比，将pd-l1和pd-1之间的相互作用，pd-l2和pd-1之间的相互作用或那两种相互作用维持在50％或更多，优选70％或更多，更优选80％或更多。此外，“允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用”的定义可以与“基本上不抑制pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用”的含义相同。

为构建本发明的pd-1/cd3双特异性抗体而获得的抗pd-1单克隆抗体的每个克隆和其vh氨基酸序列与其seqid编号之间的对应关系显示于图5中。每个抗pd-1单克隆抗体克隆的vh中的每个cdr氨基酸序列与其seqid编号之间的对应关系显示于图6中。

与cd3特异性结合的第二臂

在本说明书中，“与cd3特异性结合的第二臂”(以下，其可以缩写为“第二臂”)意指至少具有与cd3特异性结合的抗体(以下，其可以缩写为“抗cd3抗体”)的vh的抗体部分，而不管其是否包含在抗体或抗体片段的一部分中，或者不是作为一部分而是作为单一体存在。例如，此类第二臂由抗cd3抗体的vh和构成相同抗cd3抗体的共同轻链的vl组成，并且进一步包括包含vh和vl的抗体的fab部分。在本文中，句子“与cd3特异性结合”用作以下特征：抗体可以以至少1×10^-5m，优选1×10^-7m，并且更优选地超出1x10^-9m亲和力(解离常数(kd值))的结合活性直接与cd3结合，并且基本上不与其他蛋白质结合。此外，“与cd3特异性结合的抗体”或“抗cd3抗体”中的“抗体”意指由通过二硫键连接的两条重链和两条轻链组成的全长抗体，并优选其单克隆抗体。

在本文中，“与cd3特异性结合的第二臂”的实例包括含有vh的那些，所述vh具有：(1c)包含seqidno.37中所示的氨基酸序列的vh-cdr1、包含seqidno.38中所示的氨基酸序列的vh-cdr2和包含seqidno.39中所示的氨基酸序列的vh-cdr3。

此外，本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”包括如下那些，其中在上述(1c)中的vh的每个vh-cdr中，1至5个任意氨基酸残基被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代，并且其与不具有任何相同氨基酸取代的原始第二臂具有基本上相同的与cd3的结合活性。例如，对于cdr1，一个氨基酸残基被其保守氨基酸取代。对于cdr2或cdr3，一个或两个氨基酸残基分别被其保守氨基酸取代。在本文中，上述句子“其与不具有任何相同氨基酸取代的原始第二臂具有基本上相同的与cd3的结合活性”意指与不具有任何相同氨基酸取代的原始第二臂的与cd3的结合活性相比，被氨基酸取代的第二臂的与cd3的结合活性为95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高。这里注意，第二臂的每个vh-cdr中的“用保守氨基酸取代”的实例包括上述第一臂中的氨基酸取代的那些。

此外，本发明中的“与cd3特异性结合的第二臂”包括如下那些，其含有具有包含上述特定氨基酸序列的每个cdr的vh，并且其中vh的fr氨基酸序列由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码。例如，上述(1c)中的vh由其中种系v基因是ighv3-33或其具有体细胞突变的基因的vdj重组基因编码。本文中，由种系的v基因ighv3-33编码的氨基酸序列(seqidno.22)显示于图3中。

此外，本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”还包括如下那些，其含有具有上述特定氨基酸序列的每个cdr，并且其中vh中的fr的氨基酸序列由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码。此类第二臂的实例包括具有vh的那些，所述vh包含seqidno.36中所示的氨基酸序列。

此外，此类“与cd3特异性结合的第二臂”的实例包括如下那些，其具有包含与seqidno.36中所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步更优选地至少98％，并且仍进一步优选至少99％的同一性的氨基酸序列的vh，并且其中与原始第二臂的vh氨基酸序列的差异对与cd3的结合活性没有实质性影响(以下，可以缩写为“同源第二臂”)。在本文中，句子“与原始第二臂的vh氨基酸序列的差异对与cd3的结合活性没有实质性影响”意指与原始第二臂的结合活性相比，同源第二臂与cd3的结合活性为95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高。

在又一个实施方案中，本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”包括含有抗cd3抗体的可变区(本文中，可变区包括构成其的vh和vl)的那些，所述抗cd3抗体(1)与具有由上述(1c)表示的vh或包含seqidno.36中所示的氨基酸序列的vh以及共同轻链的vl的第二臂交叉竞争与cd3的结合，或(2)与具有相同vh和vl的与cd3特异性结合的单克隆抗体的可变区交叉竞争与cd3的结合。在本文中，“交叉竞争与cd3的结合”意指其通过与本说明书中示例的第二臂结合相同或部分重叠的表位来抑制第二臂与cd3的结合，无论其程度如何。在本文中，可以通过与如关于“与pd-1特异性结合的第一臂”所述相同的方法类似地评估交叉竞争。

在本文中，本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”的优选实例包括具有由上述(1c)所示的vh的第二臂。此外，如上所述，第二臂的优选实例还包括如下那些，其中在vh的每个cdr中1至5个任意氨基酸残基被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代，并且用氨基酸取代基本上不影响与cd3的结合活性。此外，如上所述，第二臂的优选实例包括如下那些，其具有其中框架的氨基酸序列由种系v基因ighv3-33或其具有体细胞突变的基因编码的vh。然后，第二臂的更优选的实例包括具有包含seqidno.36中所示的氨基酸序列的vh的那些。

以下，为构建本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的抗cd3抗体克隆、其vh氨基酸序列与其seqid编号之间的对应关系分别显示于图7中。抗cd3抗体克隆的vh中的cdr氨基酸序列与其seqid编号之间的对应关系分别显示于图8中。

本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”优选含有共同轻链，并且此类共同轻链的优选实例包括igvk1-39/jk1共同轻链。更优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3，并且进一步优选的实例包括含有vl的轻链，所述vl包含seqidno.25中所示的氨基酸序列。此外，共同轻链的恒定区的优选实例包括包含seqidno.29中所示的氨基酸序列的轻链恒定区。

本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”的优选实例包括与cd3ε特异性结合的第二臂。

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的优选同种型的实例包括igg抗体，进一步优选igg1抗体或igg4抗体，并且更优选igg1抗体。

在另一方面，本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的优选实施方案为例如pd-1/cd3双特异性抗体，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有：

(a)vh，其中在选自由选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一个表示的vh中的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的任一个或多个cdr中，1至5个任意氨基酸残基可以被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代；和

(b)共同轻链的vl，其具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3；并且

其中与cd3特异性结合的第二臂含有：

(c)vh，其中在选自由上述(1c)表示的vh中的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3的任一个或多个cdr中，1至5个任意氨基酸残基可以被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代；和

(d)共同轻链的vl，其具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3。

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的更优选的实施方案为例如pd-1/cd3双特异性抗体，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有：

(a)vh，其由选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一个表示；和

(b)共同轻链的vl，其具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3；并且

其中与cd3特异性结合的第二臂含有：

(c)vh，其由上述(1c)表示；和

(d)共同轻链的vl，其具有包含seqidno.26中所示的氨基酸序列的cdr1，包含seqidno.27中所示的氨基酸序列的cdr2和包含氨基酸seqidno.28中所示的氨基酸序列的cdr3。

此外，本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的另一个优选的实施方案为例如pd-1/cd3双特异性抗体，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有：

(a)vh，其包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列，或vh，其包含与相同vh的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；和

(b)共同轻链的vl，其包含seqidno.25中所示的氨基酸序列；并且其中与cd3特异性结合的第二臂含有：

(c)vh，其包含seqidno.36中所示的氨基酸序列，或vh，其包含与相同vh的氨基酸序列具有至少80％的同一性的氨基酸序列；和

(d)共同轻链的vl，其包含seqidno.25中所示的氨基酸序列。

其他实施方案更优选包括例如pd-1/cd3双特异性抗体，

其中与pd-1特异性结合的第一臂含有：

(a)vh，其包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列；

和

(b)共同轻链的vl，其包含seqidno.25中所示的氨基酸序列；并且其中与cd3特异性结合的第二臂含有：

(c)vh，其包含seqidno.36中所示的氨基酸序列；和

(d)共同轻链的vl，其包含seqidno.25中所示的氨基酸序列。

在本发明的pd-1/cd3双特异性抗体中，在抗体是igg1抗体的情况下，以下igg1抗体是优选的：其中在两个重链恒定区或铰链区上，根据eu编号系统的位置235处的亮氨酸被甘氨酸取代，和/或根据eu编号系统的位置236处的甘氨酸被精氨酸取代。此外，优选其中已缺失重链的c端氨基酸，例如根据eu编号系统的位置447处的赖氨酸的双特异性抗体。此外，在pd-1/cd3双特异性抗体是igg4抗体的情况下，优选其中位于铰链区中且根据eu编号系统位置228处的丝氨酸被脯氨酸取代的抗体。

此外，在pd-1/cd3双特异性抗体是igg1抗体的情况下，优选的实施方案包括以下那些：其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被赖氨酸取代并且位置366处的苏氨酸被赖氨酸取代；并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的恒定区中，位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代。此外，还优选以下igg1抗体：其中在具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的恒定区中，根据eu编号系统的位置351处的亮氨酸被天冬氨酸取代并且位置368处的亮氨酸被谷氨酸取代；并且在具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的恒定区中，位置351处的亮氨酸被赖氨酸取代并且位置366处的苏氨酸被赖氨酸取代。

其中重链恒定区中所有上述氨基酸取代均被采用的pd-1/cd3双特异性igg1抗体的优选实施方案的实例包括以下那些：其中具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链含有包含seqidno.23中所示的氨基酸序列的重链恒定区，并且具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链含有包含seqidno.24中所示的氨基酸序列的重链恒定区。那些氨基酸序列显示于图9中。

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的最优选实施方案是通过本说明书的实施例8中所述的方法生成的pd1-1(bi)克隆、pd1-2(bi)克隆、pd1-3(bi)克隆、pd1-4(bi)克隆和pd1-5(bi)克隆。

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的优选特征包括：(1)允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用；和/或(2)充分降低细胞因子生成。本文中，句子“允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或那两种相互作用”与关于“与pd-1特异性结合的第一臂”描述的含义相同。另一方面，句子“充分降低细胞因子生成”意指例如在静脉内施用期间或在该施用后24小时内，通过滴注本发明的pd-1/cd3双特异性抗体，例如，血液或组织中含有il-2、ifn-γ和/或tnf-α的细胞因子的浓度不增加，或仅在可以通过类固醇施用抑制它的程度上增加。

用于产生和纯化pd-1/cd3双特异性抗体的方法

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体及其抗体片段也可以通过wo2014/051433、wo2013/157953或wo2013/157954中公开的方法来制造。

具体地，可以通过将已经分别插入以下项的表达载体基因转移到哺乳动物动物细胞中以对其进行转化，并且然后通过让它们表达和分泌重链和共同轻链两者来制备本发明的pd-1/cd3双特异性抗体及其抗体片段：(1)编码含有与pd特异性结合的第一臂的vh的重链的多核苷酸，(2)编码含有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的多核苷酸和(3)编码共同轻链的多核苷酸。

在本文中，可以使用表达本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的任何宿主细胞，只要它们可以使用表达载体进行基因转移并允许转移的表达载体表达。宿主细胞优选是昆虫细胞，如sf-9和sf-21，更优选地哺乳动物细胞，如小鼠细胞，如cho细胞、bhk细胞、sp2/0细胞和ns-0骨髓瘤细胞，灵长类细胞，如cos和vero细胞，mdck细胞，brl3a细胞，杂交瘤，肿瘤细胞，永生化原代细胞，w138，hepg2，hela，hek293，ht1080或胚胎视网膜细胞如per.c6。这里注意，在选择表达系统时，用于哺乳动物宿主细胞的表达载体和用作哺乳动物宿主细胞的宿主可以用于确保抗体得以适当糖基化。有利地，人细胞系(优选per.c6)用于获得其糖基化模式对应于人的糖基化模式的抗体。

可以参考例如currentprotocolsinproteinscience(1995),coliganje,dunnbm,ploeghhl,speicherdw,wingfieldpt,isbn0-471-11184-8,bendig,1988进行通过表达载体的基因转移转化的宿主细胞中的蛋白质生成。此外，可以参考mammaliancellbiotechnology:apracticalapproach(m.butler编,irlpress,1991)进行使宿主细胞培养的生产力最大化的一般指南、规程和实用方法。抗体在宿主细胞中的表达描述于例如公开内容，如ep0120694、ep0314161、ep0481790、ep0523949、us4816567、wo2000/63403等。

本文中，可以通过熟知的方法优化宿主细胞的培养条件，从而可以优化蛋白质生成。培养的实例包括在培养皿、滚瓶或反应室中的分批培养、进料培养、连续培养和中空纤维培养。为了通过细胞培养大规模且连续地产生重组蛋白，优选在悬浮液中增殖细胞。此外，更优选在无动物或人源性血清或动物或人源性血清中一些组分的条件下培养细胞。

可以使用熟知的方法对在宿主细胞中表达，然后通过熟知的方法从细胞或细胞培养物中回收的抗体进行纯化。纯化方法的实例包括免疫沉淀法、离心法、过滤、尺寸排阻色谱、亲和色谱、阳离子和/或阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱等。此外，可以优选使用蛋白a或蛋白g亲和色谱(参见例如us4801687和us5151504)。

抗pd-1单克隆抗体

本发明包括“与pd-1特异性结合的单克隆抗体”(以下，可以缩写为“抗pd-1单克隆抗体”)，以构建本发明的pd-1/cd3双特异性抗体和其抗体片段。

本发明的抗pd-1单克隆抗体的一个实施方案是能够通过缔合本发明的vh和共同轻链的vl而特异性结合pd-1的单克隆抗体。在本文中，句子“与pd-1特异性结合”用作以下特征：其可以以至少1×10^-5m，优选1×10^-7m，并且更优选地超出1x10^-9m亲和力的结合活性(解离常数(kd值))直接与pd-1结合，并且基本上不与属于所谓cd28家族受体的受体成员(例如至少cd28、ctla-4和icos)结合。本文中，“与pd-1特异性结合的单克隆抗体”或“抗pd-1抗体”中的“抗体”意指由通过二硫键连接的两条重链和两条轻链组成的全长抗体。此外，“与pd-1特异性结合的单克隆抗体的片段”是全长抗体的一部分，并且是至少包括抗原结合部分的抗体，其实例包括fab、fab′、fv、scfv、f(ab′)2等。

本发明的抗pd-1单克隆抗体的实例包括如下那些，其具有构成“与pd-1特异性结合的第一臂”的vh的选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一个vh或包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh以及本说明书的共同轻链的vl。

此外，本发明的抗pd-1单克隆抗体包括以下那些：其中在选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一种vh的每个cdr中，1至5个任意氨基酸残基被其他氨基酸(优选其保守氨基酸)取代，并且其与具有无任何相同氨基酸取代的原始vh的抗pd-1单克隆抗体具有基本上相同的与pd-1的结合活性。例如，对于cdr1，一个氨基酸残基被其保守氨基酸取代。对于cdr2或cdr3，一个或两个氨基酸残基分别被其保守氨基酸取代。在本文中，句子“与具有无任何相同氨基酸取代的原始vh的抗pd-1单克隆抗体具有基本上相同的与pd-1的结合活性”意指与具有无任何相同氨基酸取代的原始vh的抗pd-1单克隆抗体与pd-1的结合活性相比，被氨基酸取代的抗pd-1单克隆抗体的与pd-1的结合活性为95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高。

此外，本发明的抗pd-1单克隆抗体的实例包括以下那些：其含有具有包含上述特定氨基酸序列的每个cdr的vh，并且其中vh的框架氨基酸序列由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码，并且其实例包括由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码的特定vh，如关于上述“与pd-1特异性结合的第一臂”所述。

此外，在本发明的抗pd-1单克隆抗体中，具有含有选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)的任何一种vh中的每个cdr的vh且其中fr氨基酸序列由特定种系基因或其具有体细胞突变的基因编码的那些抗体的实例包括具有包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh的那些。此外，此类抗pd-1单克隆抗体的实例包括如下那些，其具有与选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，进一步优选地至少98％，进一步更优选至少99％的同一性的vh氨基酸序列，并且具有与具有原始vh的抗pd-1单克隆抗体基本上相同的与pd-1的结合活性。在本文中，句子“具有与具有原始vh的抗pd-1单克隆抗体基本上相同的与pd-1的结合活性”意指与具有原始vh的抗pd-1单克隆抗体相比，其具有95％或更高，优选98％或更高，且更优选99％或更高的与pd-1的结合活性。

此外，本发明的抗pd-1单克隆抗体的其他实施方案还包括与具有选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任何一个vh或选自seqidno.1至5的任何一个中所示的vh氨基酸序列的抗pd-1单克隆抗体交叉竞争与pd-1的结合的抗pd-1单克隆抗体，以及由具有选自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中的任何一个vh或包含选自seqidno.1至5的任何一个中所示的氨基酸序列的vh的抗pd-1单克隆抗体交叉竞争与pd-1的结合的抗pd-1单克隆抗体。

本发明的抗pd-1单克隆抗体的优选特征包括允许pd-1和pd-l1之间的相互作用，pd-1和pd-l2之间的相互作用或这两种相互作用，以及本发明的pd-1/cd3双特异性抗体。

编码pd-1/cd3双特异性抗体的多核苷酸

编码pd-1/cd3双特异性抗体的多核苷酸包含：(1)编码具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的多核苷酸，(2)编码具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的多核苷酸，以及(3)编码共同轻链的多核苷酸。在本文中，编码具有与pd-1特异性结合的第一臂的vh的重链的多核苷酸包含编码与pd-1特异性结合的第一臂的vh的多核苷酸和编码具有vh的重链的恒定区的多核苷酸。类似地，编码具有与cd3特异性结合的第二臂的vh的重链的多核苷酸包含编码与cd3特异性结合的第二臂的vh的多核苷酸和编码具有vh的重链的恒定区的多核苷酸。

编码pd-1/cd3双特异性抗体的多核苷酸可以是任何多核苷酸，只要它们编码构成pd-1/cd3双特异性抗体的每个部分，并且可以是基因组dna、cdna、合成dna、rna和dna-rna杂交体中的任何一种。作为编码一种氨基酸的密码子，已知一种至六种类型的密码子。例如，分别地，phe对应于ttt或ttc，leu对应于tta、ttg、ctt、ctc、cta或ctg，ile对应于att、atc或ata，met对应于atg，val对应于gtt、gtc、gta或gtg，ser对应于tct、tcc、tca或tcg，pro对应于cct、ccc、cca或ccg，thr对应于act、acc、aca或acg，ala对应于gct、gcc、gca或gcg，tyr对应于tat或tac，his对应于cat或cac，gln对应于caa或cag，asn对应于aat或aac，lys对应于aaa或aag，asp对应于gat或gac，glu对应于gaa或gag，cys对应于tgt或tgc，trp对应于tgg，arg对应于cgt、cgc、cga或cgg，ser对应于agt或agc，arg对应于aga或agg并且gly对应于ggt、ggc、gga或ggg。因此，编码pd-1/cd3双特异性抗体的多核苷酸包括其中对应于每个氨基酸的密码子任意组合的多核苷酸。编码与pd-1特异性结合的第一臂的vh的多核苷酸的优选实例包括具有选自分别编码pd1-1至pd1-5克隆的vh的seqidno.30至34中任一个中所示的碱基序列的多核苷酸。编码与cd3特异性结合的第二臂的vh的多核苷酸的优选实例包括具有seqidno.40中所示的碱基序列的多核苷酸。此外，编码共同轻链的可变区的多核苷酸的优选实例包括具有seqidno.35中所示的碱基序列的多肽。

药物用途

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体可用于预防自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)、抑制自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)。

通过本发明的pd-1/cd3双特异性抗体可以预防、可以抑制其症状进展或复发和/或可以治疗的疾病的实例包括贝赫切特氏病、系统性红斑狼疮、慢性盘状红斑狼疮、多发性硬化(系统性硬皮病和进行性系统性硬化)、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、结节性动脉周围炎(结节性多动脉炎和显微镜下多血管炎)、主动脉炎综合征(高安动脉炎)、恶性类风湿关节炎、类风湿关节炎、幼年型特发性关节炎、脊椎关节炎、混合性结缔组织病、舍格伦氏综合征、成人斯蒂尔氏病、血管炎、变应性肉芽肿性血管炎、超敏感性血管炎、类风湿性血管炎、大血管血管炎、anca相关血管炎(例如，肉芽肿病伴多血管炎和嗜酸性肉芽肿病伴多血管炎)、寇甘氏综合征、rs3pe、颞动脉炎、风湿性多肌痛、纤维肌痛、抗磷脂抗体综合征、嗜酸性筋膜炎、igg4相关疾病(例如，原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰岛炎)、格-巴二氏综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肺出血肾炎综合征、快速进行性肾小球肾炎、巨幼细胞贫血、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、自身免疫性中性粒细胞减少、特发性血小板减少性紫癜、巴塞多病(格雷夫斯病(甲状腺功能亢进))、桥本病、自身免疫性肾上腺皮质功能不全、原发性甲状腺功能减退症、艾迪生氏病(慢性肾上腺皮质功能减退)、特发性艾迪生氏病、i型糖尿病、缓慢进行性i型糖尿病(成人潜伏性自身免疫性糖尿病)、局灶性硬皮病、银屑病、银屑病关节炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线性iga大疱性皮肤病、获得性大疱性表皮松解、斑秃、白癜风、寻常性白癜风、视神经脊髓炎、慢性炎性脱髓鞘多神经病、多灶性运行神经病、结节病、巨细胞性动脉炎、肌萎缩侧索硬化、原田病、自身免疫性视神经病变、特发性无精子症、习惯性流产、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、乳糜泻、强直性脊柱炎、严重哮喘、慢性荨麻疹、移植免疫、家族性地中海热、嗜酸性慢性鼻鼻窦炎、扩张型心肌病、系统性肥大细胞增多症或包涵体肌炎。

在本发明中，术语“治疗”意指治愈或改善疾病或其症状。术语“预防”意指在一定时段内防止或延迟疾病或其症状的发作。术语“抑制症状进展”意指抑制症状的进展或恶化以停止疾病状况的进展。“预防”的含义包括抑制复发。术语“抑制复发”意指防止某些疾病或综合征的复发或者减少复发的可能性。

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体通常通过肠胃外施用系统地或局部地施用。此类施用方法的具体实例包括注射施用、鼻内施用、经肺施用、经皮施用等。注射施用的实例包括静脉内注射、肌肉内注射和腹膜内注射。对于静脉内注射，优选静脉内滴注。其剂量根据年龄、体重、症状、治疗效果、施用方法、治疗时段等而变化。对于一名成年患者，其单剂量通常为通过肠胃外施用每天一次至几次，在0.1μg/kg至300mg/kg的范围内且特别优选在0.1mg/kg至10mg/kg的范围内，或者通过静脉内维持施用每天一小时至24小时的范围内。不用说，如上所述，由于剂量根据各种条件而变化，因此足够的剂量可以低于上述剂量，或者可能需要超出上述的施用。

配制剂

当将本发明的pd-1/cd3双特异性抗体配制成用作滴注的注射或输注溶液时，该注射或输注溶液可以为水溶液、悬浮液或乳液的任何形式，或者可以与药学上可接受的载体一起配制为固体试剂，使得该试剂在使用时将在溶剂中溶解、悬浮或乳化。用于滴注的注射或输注溶液中的溶剂的实例包括注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液和等渗溶液(例如，其中氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等是可溶的)。

本文中，药学上可接受的载体的实例包括稳定剂、增溶剂、悬浮剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、防腐剂、消毒剂、ph调节剂和抗氧化剂。作为稳定剂，可以使用各种氨基酸、白蛋白、球蛋白、明胶、甘露醇、葡萄糖、右旋糖酐、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、依地酸钠、柠檬酸钠、二丁基羟基甲苯等。作为增溶剂，可以使用醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(例如polysorbate20(注册商标)、polysorbate80(注册商标)、hco-50等)等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为舒缓剂，可以使用苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、碳酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、谷氨酸缓冲剂、epsilon氨基己酸缓冲剂等。作为防腐剂，可以使用对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等。作为消毒剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。作为ph调节剂，可以使用盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等。作为抗氧化剂，可以使用(1)水性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和亚硫酸钠，(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂，没食子酸丙酯和α-生育酚，以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸和磷酸等。

用于滴注的注射或输注溶液可以通过在最终过程中进行灭菌或进行无菌操作，例如通过用过滤器等进行过滤进行灭菌，随后填充无菌容器来生产。用于滴注的注射或输注溶液可以通过在使用时将真空干燥或冻干的无菌粉末(其可以包括药学上可接受的载体粉末)溶解在适当的溶剂中来使用。

组合使用或组合配制剂

此外，本发明的pd-1/cd3双特异性抗体可以与用于预防自身免疫性疾病、抑制自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病的其他试剂组合使用。在本发明中，与其他试剂组合使用的施用形式的实例(组合使用)可以包括在一种配制剂中含有两种成分的组合配制剂的形式，或在单独的配制剂中施用的形式。此类组合使用可以补充另一种试剂的预防、症状进展抑制、复发抑制和/或治疗效果，或者可以维持或减少另一种试剂的施用剂量或频率。在本发明中，在分别施用pd-1/cd3双特异性抗体和另一种试剂的情况下，可以在一定时间段内同时施用两种试剂，然后可以仅施用pd-1/cd3双特异性抗体或另一种试剂。或者，可以首先施用本发明的pd-1/cd3双特异性抗体，并且在完成施用之后，可以施用另一种试剂。可以首先施用另一种试剂，然后可以施用本发明的pd-1/cd3双特异性抗体。施用方法可以彼此相同或不同。本发明还可以提供一种试剂盒，其包含含有本发明的pd-1/cd3双特异性抗体的配制剂和含有另一种试剂的配制剂。另一种试剂的剂量可以基于临床用途的剂量适当选择。另一种试剂可以是处于适当比率的两种或更多种任意试剂的组合。另一种试剂的实例不仅包括已知的试剂，而且还包括将来新发现的试剂。

例如，当本发明的pd-1/cd3双特异性抗体应用于预防i型糖尿病、抑制i型糖尿病的症状进展或复发和/或治疗i型糖尿病时，其可以例如与选自以下的任一种或多种试剂组合使用：胰岛素制剂(例如，人胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素等)、磺酰脲剂(例如，格列本脲(glibenclamide)、格列齐特(gliclazide)或格列美脲(glimepiride))、速效胰岛素分泌促进剂(例如，那格列奈(nateglinide))、双胍制剂(例如，二甲双胍)、胰岛素抵抗改善剂(例如，吡格列酮(pioglitazone))、α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)等)、糖尿病神经病变治疗剂(例如，依帕司他(epalrestat)、美西律(mexiletine)、咪达普利(imidapril)等)、glp-1类似物制剂(例如，利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利西那肽(lixisenatide)等)和dpp-4抑制剂(西格列汀(sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、阿格列汀(alogliptin)等)等。

此外，例如，当本发明的pd-1/cd3双特异性抗体应用于预防多发性硬化、抑制多发性硬化的症状进展或复发和/或治疗多发性硬化时，其可以与选自以下的任一种或多种试剂组合使用：类固醇剂(例如，醋酸可的松、氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、醋酸氟可的松、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙乙酸丁酯、泼尼松龙磷酸钠、醋酸卤泼尼松、甲泼尼龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠、曲安西龙、醋酸曲安西龙、曲安奈德、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松棕榈酸酯、醋酸帕拉米松或倍他米松)、干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、克拉屈滨、促肾上腺皮质激素(acth)、促皮质素、咪唑立宾、他克莫司、芬戈莫德或阿仑珠单抗等。

此外，例如，当本发明的pd-1/cd3双特异性抗体应用于预防系统性红斑狼疮、抑制系统性红斑狼疮的症状进展或复发和/或治疗系统性红斑狼疮时，其可以与选自以下的任一种或多种试剂组合使用：类固醇剂(例如，上述类固醇剂)、免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司或芬戈莫德)和贝利木单抗(belimumab)。

例如，当本发明的pd-1/cd3双特异性抗体应用于预防类风湿关节炎、抑制类风湿关节炎的症状进展或复发和/或治疗类风湿关节炎时，其可以与选自以下的任一种或多种试剂组合使用：类固醇剂(例如，上述类固醇剂)、抗风湿剂(例如，甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、布西拉明(bucillamine)、来氟米特(leflunomide)、咪唑立宾、他克莫司等)、抗细胞因子剂(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、托珠单抗(tocilizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、赛妥珠单抗(sertolizumab)等)和阿巴西普(abatacept)等。

在将本发明的pd-1/cd3双特异性抗体应用于预防其他自身免疫性疾病、抑制其他自身免疫性疾病的症状进展或复发和/或治疗其他自身免疫性疾病的情况下，本发明的pd-1/cd3双特异性抗体可以与上述其他试剂的任何一种或多种组合使用。

现在将通过以下实施例更详细地描述本发明，但是本发明的范围不限于此。基于本发明的描述，本领域技术人员可以做出各种改变和修改，并且此类改变和修改也包括在本发明中。

实施例

实施例1：使用重组人pd-1-fc融合蛋白对memo小鼠进行免疫

作为用于获得本发明的与pd-1特异性结合的第一臂的方法，选择了用重组人pd-1蛋白免疫memo小鼠的方法(参见wo2009/157771)。memo小鼠是经遗传修饰而使得包括非重组人重链v基因区、d基因区和j基因区，以及重组人κ轻链igvκ1-39*01/igjκ1*01种系基因的基因片段与小鼠恒定区基因连接的小鼠。通过用抗体的靶蛋白直接免疫memo小鼠，可以生产出具有多样性的由重链和共同轻链组成的抗体。

以14天间隔用重组人pd-1-fc融合蛋白(r&dsystems，序列号1086-pd)对十二只12周至16周龄的memoms5b/ms9小鼠进行免疫，所述融合蛋白已使用gerbu佐剂mm(gerbubiotechnik，序列号#3001)进行了乳化。免疫后第0、14和28天，皮下施用重组人pd-1-fc融合蛋白。在此之后的时机，皮下施用溶解于pbs的重组人pd-1-fc融合蛋白。在免疫后第21、35、56、77和98天，使用人pd-1强制表达性hek293t细胞系通过流式细胞术评估血清中的抗体滴度。当将人pd-1强制表达性hek293t细胞系在稀释1000倍的血清中染色时，mfi值比作为对照的不表达人pd-1的hek293t细胞系的mfi值高不小于三倍的小鼠淋巴组织用于构建噬菌体展示文库。从抗体滴度的评估日起，用重组pd-1-fc融合蛋白再对满足构建文库构建体的标准的小鼠进行免疫三天，并收集其脾脏和腹股沟淋巴结。对人pd-1和食蟹猴pd-1的血清中的抗体滴度为1/100或更高，并且通过另外的免疫未增加抗体滴度的小鼠也进行同样的方法，然后收集其脾脏和腹股沟淋巴结。从那些淋巴组织中提取rna，然后进行cdna合成。

实施例2：构建噬菌体展示文库，以获得具有与pd-1特异性结合的第一臂的抗pd-1抗体(蛋白质免疫)

使用实施例1中制备的dna和对免疫球蛋白重链可变区家族特异的引物进行pcr反应。将获得的pcr产物用限制酶sfiii和xhoi消化，并将其插入到用相同限制酶消化的mv1473噬菌粒载体[具有编码共同轻链的基因(人κ轻链igvκ1-39*01/igjκ1*01种系基因)]中以构建文库。

实施例3：筛选具有与pd-1特异性结合的第一臂的抗pd-1抗体

使用以人pd-1-fc融合蛋白、人pd-1-his标签融合蛋白、食蟹猴pd-1-his标签融合蛋白或小鼠pd-1-his标签融合蛋白包被的板进行基于与pd-1的结合特性的噬菌体选择。当使用人pd-1-fc融合蛋白时，在与噬菌体温育期间，添加人igg(sigma，序列号i4506)以吸收fc反应性克隆。可以结合人pd-1、食蟹猴pd-1和小鼠pd-1的结合噬菌体得以富集。通过在表达食蟹猴pd-1的hek293t细胞系上进行选择来富集可以与食蟹猴pd-1结合的噬菌体。获得用通过选择获得的噬菌体转化的大肠杆菌菌株tg1克隆来产生母板。

此外，基于在用人pd-1-fc融合蛋白包被的板上与pd-1的结合特性，使用通过上述选择获得的克隆的周质空间提取物进行噬菌体选择。这里注意，作为选择标准，将具有比从阴性对照孔(pbs)获得的信号(od450值)高三倍的信号的克隆定义为阳性克隆。

实施例4：具有与pd-1特异性结合的第一臂的抗pd-1抗体候选克隆的dna序列

进行通过实施例3中的筛选获得的阳性克隆的重链可变区基因的dna序列。将分析的dna序列分为超级簇(具有相同长度cdr3的组，并且cdr3的氨基酸序列为70％或更高同源)和簇(其中重链cdr3的氨基酸序列相同的组)。获得924个克隆，其分为146种类型的超级簇和194种类型的簇。

实施例5：基于对表达pd-1的细胞的结合特性评估进行筛选

从每个分类的超级簇中，筛选满足以下条件的抗pd-1单克隆抗体克隆以分离它们：

(1)以高频率将体细胞突变引入到cdr区中；

(2)包括使用频率高的vh的种系基因，并且

(3)在对人pd-1-fc融合蛋白的结合特性筛选中获得高信号。

使用这些周质空间提取物中含有的fab片段，通过用抗小鼠igg多克隆抗体检测与表达人pd-1的cho-s细胞系和表达食蟹猴pd-1的cho-s细胞系的结合来进行评估。在评估的117个克隆(105个簇类型)中，认识到包括抗pd-1单克隆抗体pd1-1、pd1-2、pd1-3和pd1-4克隆在内的22个克隆可以与表达人pd-1的cho-s细胞系结合。

实施例6：产生具有与pd-1特异性结合的第一臂的抗pd-1单克隆抗体的氨基酸取代的产物

pd1-1和pd1-4克隆分别在重链可变区的框架4中包括脱酰胺基序(asn-gly)。为了获得具有降低的脱酰胺风险的第一臂，产生了其中脱酰胺基序已经被转化的变体。产生pd1-5克隆，使得通过熟知的位点特异性突变方法将pd1-4克隆的根据eu编号系统的位置119处的天冬酰胺(asn)改变为谷氨酰胺，并将其分离。该克隆与表达人pd-1的cho-s细胞的结合特性与pd1-4克隆相同。

实施例7：筛选具有与cd3特异性结合的第二臂的抗cd3单克隆抗体

为了获得具有更高的稳定性和进一步降低的电荷异质性的与cd3结合的fab，使用具有wo2005/118635中所述的抗cd3抗体15c3克隆的vh和igvk1-39/jk1共同轻链的抗cd3抗体克隆通过以下方法获得了具有本发明的“与cd3特异性结合的第二臂”的抗cd3抗体。

通过将图10中所示的15c3的vh氨基酸序列中带有下划线的第55位甘氨酸转化为丙氨酸，获得了具有与该克隆相同的与人cd3的结合特性并具有改善的电荷异质性的抗cd3抗体cd3-1克隆。

此外，为了获得多个与cd3结合的fab以改善基于cd3-1克隆的vh与共同轻链(igvκ1-39*01/igjκ1*01)的vh/vl相互作用，构建了表达多个fab的噬菌体展示文库，所述fab包括其中氨基酸残基已被取代的cd3-1克隆的vh变体。使用hbp-all细胞或重组人cd3ε-fc蛋白对该噬菌体文库进行筛选。结合重组人cd3ε-fc蛋白的噬菌体经化学洗脱，并用于细菌的再感染。提取多个存活的细菌菌落，然后从中提取噬菌体，然后基于与细胞表面上表达的cd3的结合，通过流式细胞术进行筛选。对所有与cd3结合的噬菌体进行菌落pcr以扩增编码其vh的cdna，并确定其dna序列。

结果，获得的具有包含seqidno.36中所示的氨基酸序列的vh的抗cd3抗体cd3-2克隆显示出与cd3-1克隆相同的与cd3的结合特性和电荷均质性。实施例8：pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的制备

通过分别将编码在实施例5中分别选择的抗pd-1单克隆抗体pd1-1至pd1-5和pd1-6克隆的重链可变区的dna与编码igg1重链恒定区的dna连接，产生表达与pd-1特异性结合的第一臂的每条重链的表达载体。另一方面，通过将编码在实施例7中选择的抗cd3单克隆抗体cd3-2克隆的重链可变区的dna与编码igg1重链恒定区的dna连接，产生表达与cd3特异性结合的第二臂的重链的表达载体。本文中，作为表达此类重链恒定区的基因，对于与pd-1特异性结合的第一臂，使用表达具有l351d/l368e变异(de变异)的fc区的基因。对于与cd3特异性结合的第二臂，使用表达具有l351k/t366k变异(kk变异)的fc区的基因。这些表达载体被构建为进一步包括编码igvk1-39/jk1共同轻链的基因，以使其一起表达。此外，表达这些重链恒定区的基因已经经修饰以表达以下基因：其中为了清除fc效应器活性，在重链恒定区中位置235处的亮氨酸被甘氨酸取代并且进一步地位置236处的甘氨酸被精氨酸取代，并且为了避免翻译后的加工，进一步地重链恒定区的c端处位置447处的赖氨酸是缺失的。将这两种表达载体均基因转移到freestyle293f细胞中，以在培养上清液中产生抗体。收集培养上清液，然后通过蛋白a亲和色谱进行处理，以分别纯化本发明的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的pd1-1(bi)克隆、pd1-2(bi)克隆、pd1-3(bi)克隆、pd1-4(bi)克隆和pd1-5(bi)克隆。此外，pd1-6(bi)克隆也通过相同的方法产生。这里注意，因为这些pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆具有用于其生产的衍生自抗pd-1单克隆抗体：pd1-1、pd1-2、pd1-3、pd1-4和pd1-5克隆，以及pd1-6克隆的与pd-1特异性结合的第一臂，所以它们分别对应于那些抗pd-1单克隆抗体克隆。

实施例9：评估pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的结合特性

通过使用人igg1-fc融合的人pd-1细胞外重组蛋白或6×his标签融合的食蟹猴pd-1细胞外重组蛋白的biacore测定法，对实施例8中获得的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的第一臂与每个pd-1重组蛋白的结合亲和力进行了评估。这里注意，为了固定化重组蛋白，使用了s系列传感器芯片cm5传感器芯片(gehealthcare，序列号29-1049-88)。类似地，通过使用人igg1-fc融合的cd3δ/cd3ε细胞外重组蛋白的biacore测定法，对抗体的第二臂与cd3的结合亲和力进行了评估。图11显示了对于每个克隆，第一臂与pd-1的结合亲和力(kd值)和第二臂与cd3δ/cd3ε的结合亲和力。

实施例10：验证pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的结合特性

验证了实施例8中获得的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体可以同时特异性地结合pd-1和cd3。

首先，将pd1-1(bi)至pd1-6(bi)克隆分别添加至表达人cd3的人pd-1缺陷型jurkat细胞系(人t细胞系)中，并将其在冰上温育15分钟。洗涤那些细胞后，添加用3倍量生物素标记的可溶性pd-1重组蛋白(r&dsystems，序列号1086-pd-050)，并将其在冰上温育15分钟。洗涤那些细胞后，向其中添加100μl的1.25μg/mlalexafluor488标记的链霉抗生物素蛋白(biolegend，序列号405235)，并将其在冰上温育15分钟。洗涤那些细胞后，通过流式细胞术评估可溶性pd-1重组蛋白的结合量。图12显示了测定法的结果。

所有克隆均同时与pd-1和cd3结合。这里注意，在该结合系统中未检测到非特异性结合。

实施例11：评估pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的第一臂的结合特性

为了评估对实施例8中获得的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的第一臂的pd-1/pd-l1结合的影响，进行了关于双特异性单克隆抗体克隆和可溶性pd-l1重组蛋白与pd-1的结合的竞争性结合测定法。首先，将pd1-1(bi)至pd1-6(bi)克隆分别添加至表达人pd-1的cho-s细胞系，并将其在冰上温育30分钟。向其中添加以1/20量的生物素标记的可溶性pd-l1重组蛋白(r&dsystems，序列号156-b7-100)，并将其在冰上温育30分钟。洗涤那些细胞后，向其中添加pe标记的链霉抗生物素蛋白(bdpharmingen，序列号554061)，并将其在冰上温育30分钟。洗涤这些细胞后，通过流式细胞术评估可溶性pd-l1重组蛋白的结合量。图13显示了其测定法的结果。

尽管存在比可溶性pd-l1重组蛋白的量多20倍的量的克隆pd1-1(bi)至pd1-5(bi)，但是它们允许可溶性pd-l1重组蛋白与pd-1结合。另一方面，在相同条件下，pd1-6(bi)完全抑制了可溶性pd-l1重组蛋白与pd-1的结合。

实施例12：pd-1/cd3双特异性单克隆抗体对活化的cd4t细胞的体外抑制作用

使用衍生自健康人外周血的cd4阳性t细胞(lonza，序列号2w-200)(人t细胞)评估了活化t细胞对ifn-γ产生的抑制作用。将人t细胞接种在已经固相定相有抗人tcrvβ8抗体(thermoscientific，序列号tcr1750)的细胞培养板上，向其中添加抗人cd28抗体(biolegend，序列号302923)，并进行活化处理72小时。接下来，将已进行活化处理的人t细胞在含有100单位/ml人il-2(r&dsystems，序列号202-il)的新鲜培养基中培养过夜。此外，将收集的人t细胞接种在已经固相定相有抗人tcrvβ8抗体的另一细胞培养板上，并且也向其中添加抗人cd28抗体，然后再次进行活化处理。此时，分别向其添加pd1-1(bi)至pd1-6(bi)克隆，然后通过elisa对活化处理后96小时的培养上清液中所含的ifn-γ进行定量(pg/ml)。图14显示了其结果。证实了pd1-1(bi)至pd1-5(bi)克隆对ifn-γ生成的抑制活性。pd1-6(bi)克隆对ifn-γ生成的抑制活性趋于比其他克隆降低更多。通过与获得第一臂的技术相同的技术通过破伤风类毒素免疫获得的抗体(其是非特异性抗体)用作对照抗体。

实施例13：pd-1/cd3双特异性单克隆抗体对实验性变应性脑脊髓炎小鼠模型(eae模型)的体内作用

在eae模型中，使用人cd3ε/人pd-1敲入c57bl/6小鼠对本发明的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的体内作用进行了评估，所述小鼠中cd3ε基因和pd-1基因已经分别被人cd3ε基因和人pd-1基因取代。将杀死的结核分枝杆菌h37ra(bdbiosciences，序列号231141)和不完全的弗氏佐剂(bdbiosciences，序列号263910)相互混合，以制备含有4mg/ml杀死的结核分枝杆菌h37ra的完全弗氏佐剂(cfa)。将1mg/mlmog肽(anaspec，序列号as-60130)和等量的cfa相互混合，以制备作为eae模型的引发剂的乳液。将200μl引发剂皮下施用于c57bl/6小鼠的尾头部。在免疫处理日和第2天，分别在尾静脉中施用200μl的1μg/ml百日咳毒素(sigma-aldrich，序列号p7208)。接下来，在免疫的第6天和第7天，每天一次分别将2mg/kg的pd1-1(bi)至pd1-6(bi)克隆腹膜内施用于c57bl/6小鼠。根据onuki等人的方法(onukim,etal.,microscrestech2001；52:731-9)评估免疫后的神经系统症状。对神经系统症状的程度进行评分(正常：0分，尾巴松弛：1分，后肢部分麻痹：2分，后肢麻痹：3分，前肢麻痹：4分，以及垂死或死亡：5分)。如果观察到多种神经系统症状，则在评估日采用较高的分数作为神经系统症状。将死亡小鼠的神经系统症状评分为5，直至观察完成。图15至17显示了其评估结果。这里注意，通过熟知的方法，通过将(根据genesis.2009jun；47(6):414-22中描述的方法)产生的人cd3ε敲入小鼠与人pd-1敲入小鼠交配来产生人cd3ε/人pd-1敲入c57bl/6小鼠。

在eae模型中，对于pd1-1至pd1-5(bi)克隆中的任何一个，神经系统症状的发作均得到了显著抑制，但是对于pd1-6(bi)克隆，未观察到明显的抑制作用。

实施例14：评估pd-1/cd3双特异性单克隆抗体对从人外周血单核细胞释放细胞因子的体外作用

为了分析pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的细胞因子释放活性的目的，进行了以下实验：其中将本发明的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体克隆或专利文献2中公开的pd-1/cd3双特异性scdb(j110×ucht1)添加到人外周血单个核细胞(以下，称为“人pbmc”)。将pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的每个克隆和j110×ucht1分别添加至人pbmc(lonza，序列号cc-2702)，使其浓度分别为30μg/ml和10μg/ml，然后将其培养24小时。培养24小时后，通过多重免疫测定法(bio-rad，序列号m50000007a)对其培养上清液中包含的每种il-2进行定量。图18显示了其结果。这里注意，图中的il-2产生的量(pg/ml)由平均值±标准误差(n＝3)表示。

j110×ucht1显著诱导il-2产生。但是，对于pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的任何克隆，il-2产生都是低的。

实施例15：评估pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的每个克隆与pd1-5(bi)对与pd-1结合的交叉竞争活性

进行交叉竞争测定法以评估实施例8中获得的pd-1/cd3双特异性单克隆抗体的每个pd1-1(bi)至pd1-5(bi)克隆与pd1-5(bi)对与pd-1结合的交叉竞争活性。

首先，将pd1-5(bi)克隆添加到表达人pd-1的cho-s系细胞中，然后将其在冰上温育20分钟。进一步地，分别将与已经添加的pd1-5(bi)克隆的量相比，百分之一量的生物素标记的克隆pd1-1(bi)至pd1-5(bi)添加到那些细胞中，然后将其在冰上温育20分钟。洗涤那些细胞，向其中添加pe标记的链霉抗生物素蛋白(bdpharmingen，型号554061)，然后将其在冰上温育20分钟。洗涤那些细胞后，使用流式细胞术测量生物素标记的克隆pd1-1(bi)与pd1-5(bi)的结合量。图19显示了该结果。

其表明，pd1-5(bi)克隆可以抑制pd1-1(bi)至pd1-5(bi)克隆的每一个与pd-1的结合，因此pd1-5(bi)克隆可以交叉竞争它们与pd-1的结合。

工业适用性

本发明的pd-1/cd3双特异性抗体或其抗体片段可用于预防自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)、抑制自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)的症状进展或复发和/或治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病(gvhd)。

序列表

<110>小野药品工业株式会社

<120>双特异性抗体

<130>p18-199wo

<150>jp2018-021498

<151>2018-02-09

<150>jp2018-153149

<151>2018-08-16

<160>41

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>127

<212>prt

<213>人

<400>1

glnvalglnleuvalglnserglysergluleulysglnproglyala

151015

servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrhistyr

202530

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354045

glytrpleuasnthrasnthrgluasnprothrphealaglnglyphe

505560

thrglyargphevalpheserleuaspthrservalthrthralatyr

65707580

leuglnileserserleulysalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

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100105110

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gly

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gly

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