一种EB病毒的检测引物及其试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，尤其是涉及数字pcr检测人类eb病毒的引物及其试剂盒。
背景技术：
：eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)是一种嗜淋巴上皮性γ-1疱疹病毒，全世界有超过90％的人感染这种病毒。在大部分个体中，eb病毒可导致终生无症状感染，然而在少数具免疫力的个体中，该病毒与包括传染性单核细胞增多症在内的几种良性和恶性增殖性疾病有关，如霍奇金淋巴瘤，b细胞和t细胞非霍奇金淋巴瘤，鼻咽癌及胃癌。在免疫缺陷患者中，eb病毒激活感染是移植后淋巴增殖性疾病(ptld)、艾滋病相关淋巴瘤和x-连锁增殖性综合症发生的重要危险因素。在获得性免疫缺陷综合症患者中，约30％的成球细胞和高达90％的免疫细胞性淋巴瘤中发现了eb病毒感染。除了其公认的致瘤作用外，eb病毒也一直是疾病监测的目标。在移植受者中，对外周血eb病毒载量的纵向监测日益被认为是预测、诊断和治疗ptld的有价值的诊断工具。目前，荧光定量pcr(quantitativerealtimepolymerasechainreaction，qpcr)是检测定量eb病毒使用的比较多的技术手段，该技术通过在pcr反应体系中加入荧光标记的探针(如taqman)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，以此来评估pcr的扩增效果。荧光定量pcr主要依赖于校准物制备的标准曲线，进而确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。该技术存在众多不足：1.校准品和样品间背景的差异易影响pcr的效率和测量响应；2.低拷贝数的目标dna分子不能通过扩增检测到；3.样品的pcr扩增效率可能与校准物的扩增效率不同；4.dna提取时引入dna溶液的杂质或者dna降解影响了pcr动态扩增过程。因此，荧光定量pcr很难达到对低拷贝值eb病毒的检测与绝对定量。数字pcr(digitalpolymerasechainreaction，dpcr)是一项针对单分子靶标dna的绝对定量技术。该技术是将含有dna模板的pcr溶液稀释后分布到大量的独立反应室(如芯片)，液体分子遵从泊松分布，单分子间通过稀释分离，并且独自进行pcr扩增，这种样品的分配可以极大降低本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，最后分析每个扩增产物，通过泊松概率分布公式计算出dna模板的原始拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。准确的定量依赖于40～45个循环的扩增，假阴性检出水平(单dna模板出现在反应室而未被检出)非常低。其具有操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点。数字pcr作为dna定量的新技术，克服了实时荧光定量pcr的一系列缺点，实现了单分子dna绝对定量。避免了荧光定量pcr使用标准曲线对测量结果产生影响等问题。此技术可代替荧光定量pcr应用于eb病毒的定量检测。技术实现要素：基于上述技术问题，本发明提供了一组特异性强，扩增效率高的pcr引物及mgb探针，再结合高灵敏度的数字pcr技术，以达到检测和绝对定量低拷贝值eb病毒的目的。mgb探针是在普通探针的基础上设计了非荧光淬灭基团，降低了本底信号强度。同时mgb基团对dna双链小沟具有高亲和性，提高了检测的特异性和信噪比，又降低了检测成本。在本发明中，mgb探针的tm值特异地统一设计为70℃，而pcr扩增引物特异地统一设计为60℃，使得mgb探针能够特异地结合到pcr扩增产物序列中。在pcr扩增过程中，利用taq酶5’-3’外切酶特点，水解mgb探针，产生荧光信号。即本发明提供了一种eb病毒的检测引物，所述检测引物包括eb病毒的正向引物、反向引物以及mgb探针引物。优选地，所述正向引物及反向引物对应于eb病毒基因14612-14631和14691-14707处碱基，序列来源于pubmedeb基因组。优选地其序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示，eb病毒基因组编号ncbi编码为genbank:aj507799.2。优选地，所述mgb探针引物对应于eb病毒基因14649-14672处碱基，其序列如seqidno.：3所示。eb病毒基因组编号ncbi编码为genbank:aj507799.2。所述引物扩增基因序列对应于eb病毒基因14612-14707碱基，扩增片段大小为96个碱基，如seqidno.：4所示。在上述的eb病毒检测引物中，所述eb病毒引物序列选自pubmed数据库中eb病毒基因14612-14631和14691-14707碱基，其序列如seqidno.：1和seqidno.：2所示。其引物3’端无连续的g或c碱基聚集，3’端不存在自身互补重叠序列，可避免发夹结构和引物二聚体的产生。在上述的eb病毒检测引物中，所述正向引物和反向引物分别如seqidno.：1和seqidno.：2所示。eb-正向：ggtatcgggccagaggtaag(seqidno.001)eb-反向：ctgagacgggtgggtgtg(seqidno.002)所述mgb探针引物序列如seqidno.：3所示。eb探针：fam-ctaagcccaacactcc-mgb(seqidno.003)所述扩增区域序列如seqidno.：4所示。引物扩增序列：ggtatcgggccagaggtaagtggactttaattttttctgctaagcccaacactccaccacacccaggcacacactacacacacccacccgtctcag(seqidno.004)设计的mgb探针引物利用fam荧光染料进行5’端修饰如seqidno.：003所示，荧光信号强，检测效率最高。在上述的eb病毒检测引物中，所述检测引物的使用方法：1)提取样品dna；2)利用seqidno.：001-003所示的正、反向扩增引物及mgb探针引物，对步骤1)所述dna样品利用芯片pcr扩增仪进行扩增，获得eb病毒的扩增产物；3)利用生物芯片阅读仪对步骤2)所述扩增产物进行扫描和分析，获得所述扩增产物的拷贝值。本发明还提供了一种检测人类eb病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测引物。进一步地，所述检测试剂盒包括样品dna抽提试剂、70％乙醇、异丙醇、检测体系pcr反应液、阳性对照品、阴性对照品；其中检测体系pcr反应液包括：1对扩增引物和1条mgb探针引物，序列如seqidno.：001-003所示。优选地，所述检测体系pcr反应液还包括：pcr扩增缓冲液和pcr聚合酶，例如商用试剂盒中，2xmultiplexpcrplusbuffer；dntpmix；hotstartaqplusdnapolymerase。本发明设计了检测eb病毒的正、反向引物及mgb探针引物，可同时用于荧光定量pcr及数字pcr扩增反应。通过荧光定量pcr扩增对比发现其扩增效率高于其它引物。对质粒标准品及送检样本进行数字pcr检测，均可以精确地检测eb病毒的绝对拷贝值。通过调整正反向引物及mgb探针的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明取得的有益效果：设计的eb病毒正反向扩增引物，可以高效的扩增出目的基因，具有很高的特异性及精确性，其扩增效率优于其它扩增引物；采用数字pcr方法扩增目的基因，具有灵敏度高，能够绝对定量等优点。将极大地提高eb病毒的检出效率，为临床检测eb病毒提供一种可靠方法。附图说明：图1为本发明实施例与文献报道引物的扩增对比；图2为本发明实施例与其它引物的扩增对比。具体实施方式以下优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过下述优选实施例已对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。实施例1检测eb病毒扩增的引物序列包括seqidno.1-3所示的序列，为扩增eb病毒的正、反向引物及mgb探针引物。本发明设计的正、反向引物碱基分布随机，引物3’端无连续的g或c碱基聚集，3’端不存在自身互补重叠序列，可避免发夹结构和引物二聚体的产生。相关文献(pmid:25787276，palser,annel.,etal.genomediversityofepstein-barrvirusfrommultipletumortypesandnormalinfection.journalofvirology89(10)，222-5237(2015)报道引物如seqidno.：005-007所示，其反向引物gc含量过高，超过70％，且首尾均有连续g碱基聚集，不利于pcr扩增。文献报道正向引物：ggccagaggtaagtggactttaat(seqidno.5)文献报道反向引物：ggggaccctgagacggg(seqidno.6)文献报道探针：cccaacactccaccacacccaggc(seqidno.7)本发明中同时设计了其它引物和探针，引物探针序列如seqidno.8-10所示其它正向引物：gcagccgcccagtctct(seqidno.8)其它反向引物：acagacagtgcacaggagact(seqidno.9)其它探针：caggcaagggcgccagctttt(seqidno.10)在检测中，利用上述权力要求书中所述的正、反向引物及探针引物与相关文献的引物探针和其它引物探针进行对比，以人工合成eb病毒基因(上海生物工程股份有限公司)作为模板，同时进行荧光定量pcr扩增，获得扩增曲线图(图1，2)，上述权力要求书中所述引物的扩增效率明显优于文献和其它引物。本实验中使用gapdh基因作为内参基因，扩增效果良好，引物序列详见参考文献(pmid:17229868)。实施例2测试基于数字pcr技术的eb病毒检测试剂盒包括：组织dna抽提试剂盒(凯捷公司的提取试剂盒，货号158467)；70％乙醇；异丙醇；芯片试剂盒(杭州领航基因公司提供的芯片试剂盒，货号v1)；检测体系pcr反应液、阳性对照品、阴性对照品。其中检测体系pcr反应液包括：2xmultiplexpcrplusbuffer；dntpmix；hotstartaqplusdnapolymerase；seqidno.：001-003所示的扩增eb病毒的正、反向引物及mgb探针引物。本文中2xmultiplexpcrplusbuffer、dntpmix；hotstartaqplusdnapolymerase、roxdye均为商用常规的试剂，可直接检索到相应品牌，实验人员可根据自我需求进行相应的商用调整或根据处方进行自配调整成分。实施例3基于数字pcr技术检测eb病毒的方法(1)抽提全血液样品中的基因组dna：1)抽取600μl血液加900μl红细胞裂解液，颠倒混匀10次，室温放置1min，期间再颠倒混匀几次，16000xg离心1min，吸去上请，留下白细胞沉淀，加600μl细胞裂解液，振荡10s使白细胞彻底悬浮混匀。2)加入18μl蛋白酶k溶液，混匀，58孵育2h。3)加入200μl蛋白沉淀液，高速振荡混匀20s。4)16000xg离心1min，留下上清液，丢弃沉淀。5)将上一步上清液加入到提前装有600μl异丙醇的1.5ml离心管中，上下轻柔颠倒混匀50次，此时可观察到絮状dna析出。6)16000xg离心1min，此时dna全部沉淀至管底形成一个小白点。7)用干净的吸水纸将管中残留液体吸干，注意不能将dna沉淀吸走。8)加入70％乙醇并上下颠倒几次清洗dna沉淀。9)16000xg离心1min，弃上清液，用干净的吸水纸将管中残留液体吸干，注意不能将dna沉淀吸走。10)于超净工作台内静置5min吹干。11)加入10μldna溶解液，高速振荡5s。12)65孵育5min后室温静置过夜使dna充分溶解。(2)试剂配置：检测体系pcr反应液配制如下：试剂名称用量2xmultiplexpcrmastermix12.5μl正向引物(6μm)2.5μl反向引物(6μm)2.5μlmgb探针引物(3μm)2.5μlroxdye(12.5μm)1.0μl样品dna模板4.0μl总计25.0μl其中，正反向扩增引物及mgb探针引物碱基序列如seqidno.：1-3所示。按检测人份数总共配置pcr反应液xμl，每人份21μl分装：x＝21μl反应液x(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照)n为检测标本数。(3)加样：将4μl步骤(1)中获得的血液基因组dna溶液加入到检测体系pcr反应液中；对阳性对照实验而言，直接加4μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加4μlddh2o。(4)芯片上样：用移液枪吸取15μl步骤(3)中配置好的pcr反应液通过上样刷均匀涂刷到芯片中，加入甘油，盖好盖板，密封芯片。(5)数字pcr扩增：扩增在芯片专用pcr仪上进行，可用仪器包括ithermal1.0pcr仪(杭州领航基因科技有限公司)等。反应条件如下：95预变性5分钟30秒；9530秒，5590秒，7230秒，共40个循环；4保存。(6)荧光扫描及图像分析：将(5)中扩增完成的芯片放置于生物芯片阅读仪中进行荧光扫描拍照并进行数据分析，分析完成后即可计算出样本中eb病毒分子的绝对数值。实施例4采用本发明中基于数字pcr技术的eb病毒检测试剂盒检测临床标本。取送检抗凝血标本12例，其中临床确诊阳性8例，阴性4例。该12例样本按实施例3所述方法提取样本基因组dna，配制试剂并检测。每份标本加入检测体系pcr反应液中4μl，同时做阳性，阴性对照。每个样本重复2次。数字pcr引物检测结果显示8例阳性，检测拷贝值范围为28-50026拷贝/ml，4例阴性，且与确诊结果一致，准确率为100％。文献报道引物检测结果显示阳性3例，阴性9例，准确率为58.3％。其它引物检测结果显示阳性2例，阴性10例，准确率为50％。数字pcr引物检测结果显著高于文献报道引物和其它引物。检测结果如下表1：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>上海润达榕嘉生物科技有限公司<120>一种eb病毒的检测引物及其试剂盒<141>2020-01-10<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>1ggtatcgggccagaggtaag20<210>2<211>18<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>2ctgagacgggtgggtgtg18<210>3<211>16<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>3ctaagcccaacactcc16<210>4<211>96<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>4ggtatcgggccagaggtaagtggactttaattttttctgctaagcccaacactccaccac60acccaggcacacactacacacacccacccgtctcag96<210>5<211>24<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>5ggccagaggtaagtggactttaat24<210>6<211>17<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>6ggggaccctgagacggg17<210>7<211>24<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>7cccaacactccaccacacccaggc24<210>8<211>17<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>8gcagccgcccagtctct17<210>9<211>21<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>9acagacagtgcacaggagact21<210>10<211>21<212>dna/rna<213>artificialsequence<400>10caggcaagggcgccagctttt21当前第1页12