本发明涉及医药技术领域，具体涉及去氢枞酸嘧啶衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症作为全球主要死亡原因之一，已严重威胁人类健康，近年来死亡率呈显著上升趋势。化疗是肿瘤治疗的重要环节之一；然而，化疗药物通常会对正常增殖组织产生细胞毒性，并表现出明显的毒副作用和耐药性。因此，寻找新的更有效、细胞毒性更低的抗肿瘤药物仍然是必要的。
在过去的几十年里，研究人员一直在寻找新的抗肿瘤药物。其中，天然产物发挥了主导作用。尤其是目前已批准临床使用的抗肿瘤药物约60％来自天然产物。去氢枞酸(dhaa)是一种天然存在的三环二萜树脂酸，可以很容易地从松香或歧化松香中分离出来。在早期的研究中，去氢枞酸及其衍生物已被证明具有广泛的生理或药理活性，如抗菌、抗真菌、抗病毒、抗衰老、抗炎、bk通道开放和除草活性(wangx,pangfh,huangl.intjmolsci,2018,19(10),3116)。特别是，据报道，大量的去氢枞酸衍生物在许多人类癌症中具有不同的抗癌活性，包括宫颈癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。因此，去氢枞酸(dhaa)是一种很有前途的筛选新型抗肿瘤药物的起始原料。
嘧啶作为药物化学中最重要的杂环支架和天然产物的结构单元之一，被认为是存在于众多化合物中的重要药效团。嘧啶类化合物具有广泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗真菌、抗炎、cox-2抑制剂、抗结核、除草和杀虫(yaod,zhouy,zhul.eurjmedchem,2017,140,155-171)等。此外，先前的研究发现许多嘧啶衍生物具有良好的抗癌活性。
上述发现表明，嘧啶药效团与去氢枞酸骨架的融合可能产生具有更好抗癌性能的新型衍生物。因此，本发明合理设计合成了去氢枞酸嘧啶衍生物作为潜在的抗癌药物。最后，评价了目标化合物对人肺癌细胞(a549)、人肝癌细胞(hepg2)、人乳腺癌细胞(mcf-7)、人结肠癌细胞(hct-116)和人正常肝细胞(lo2)的细胞毒作用。
虽然现有文献中报道了许多在去氢枞酸母核上进行结构改造，得到一系列去氢枞酸衍生物，但并未见有去氢枞酸与嘧啶拼合得到去氢枞酸嘧啶衍生物的公开报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一类通过在去氢枞酸羧基结构上引入嘧啶药效基团，得到的去氢枞酸嘧啶衍生物及其制备方法和应用。
实现本发明目的的技术方案是：
一种去氢枞酸嘧啶衍生物，具有下述式(i)所示结构：
其中，
r1具体为氢、甲基、丙基、邻氟苯基、对氟苯基、对溴苯基、邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基、对甲氧基苯基、邻羟基苯基、间羟基苯基、对羟基苯基、间硝基苯基以及对甲基苯基等；
r2具体为氢、氰基等；
r3具体为羟基、甲基等。
上述式(i)所示结构的去氢枞酸嘧啶衍生物的合成反应式如下：
上述合成反应式中，3a-3o的结构式如下：
式(i)所示结构的去氢枞酸嘧啶衍生物的制备方法，包括如下步骤：
a.先将去氢枞酸(1)与1,2-二溴乙烷通过取代反应，制备去氢枞酸溴乙酯(2)；
b.将步骤a制备好的去氢枞酸溴乙酯(2)分次加入反应体系，室温下与不同取代基的嘧啶类化合物(3)反应，得到去氢枞酸嘧啶衍生物(4)。
步骤a所述取代反应在催化剂和有机溶剂下进行；
所述催化剂为碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、无水碳酸钾，三乙胺中的一种，优选无水碳酸钾；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜中的一种，优选丙酮或n,n-二甲基甲酰胺(dmf)；
取代反应温度为：40-80℃；
取代反应中，所述去氢枞酸(1)与1,2-二溴乙烷的摩尔比为1:1-3；
所述去氢枞酸(1)与催化剂的摩尔比为1:2-3；
所述去氢枞酸(1)与有机溶剂的比例为1g:10-20ml。
步骤b所述反应体系中的催化剂和有机溶剂与步骤a相同；
所述去氢枞酸溴乙酯(2)与不同取代基的嘧啶类化合物(3)的摩尔比为1:1-2；嘧啶类化合物的用量超过该摩尔比，也可以生成目标产物，但后序的分离难度增加；
所述去氢枞酸溴乙酯(2)与催化剂的摩尔比为1:1；
所述去氢枞酸溴乙酯(2)与有机溶剂的比例为1g：10-20ml；
所述不同取代基的嘧啶类化合物(3)为3a-3o结构式的化合物。
本发明还包括式(i)所示结构的去氢枞酸嘧啶衍生物作为制备抗肿瘤药物的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一类新的去氢枞酸嘧啶衍生物，其制备周期短，操作简单，成本低，且得到的衍生物纯度高，质量稳定；实验还发现，通过在去氢枞酸骨架上引入抗肿瘤药效基团嘧啶可以改善衍生物的抗肿瘤活性，可作为制备抗肿瘤的药物。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明内容作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例范围。
在以下各实施例中，去氢枞酸用1表示，去氢枞酸溴乙酯用2表示，不同取代基的嘧啶类化合物用3表示，去氢枞酸嘧啶衍生物用4表示。
实施例1：
去氢枞酸溴乙酯2的制备：
将6.00g(20mmol)去氢枞酸溶于100ml丙酮中，水浴加热，再加入5.52g(40mmol)无水碳酸钾，并缓慢滴加5.2ml(60mmol)二溴乙烷，60℃恒温反应，tlc跟踪反应进程。待反应完全后过滤，50℃蒸馏浓缩后得黄色油状液体，用柱层析纯化，蒸馏浓缩，真空干燥后得透明油状液体，降温冷却凝结成6.2g白色固体，产率为78.6％；m.p.46.2-49.4℃；
因此，上述化合物2为去氢枞酸溴乙酯，其结构式如下式所示：
实施例2：
2’-(4-羟基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯4a的制备：
将3mmol嘧啶化合物3a(4-羟基-2-巯基嘧啶)、3mmol(1.22g)去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得淡黄色固体，产率56.1％，m.p.82.2～84.7℃；
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因此，可确定上述化合物4a为2’-(4-羟基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯产物，其结构式如下式所示：
实施例3：
2’-(4-羟基-6-丙基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯(化合物4b)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3b(4-羟基-2-巯基-6-丙基嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得白色固体，产率70.5％，m.p.69.8～71.3℃；
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因此，可确定上述化合物4b为2’-(4-羟基-6-丙基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例4：
2’-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯(化合物4c)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3c(2-巯基-4,6-二甲基嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色油状固体4c，产率81.8％，m.p.103.1-104.3℃；
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因此，可确定上述化合物4c为2’-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例5：
2’-(4-羟基-6-甲基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯(化合物4d)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3d(4-羟基-2-巯基-6-甲基嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得粉色固体4d，产率54.8％，m.p.119.4～121.1℃；
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因此，可确定上述化合物4d为2’-(4-羟基-6-甲基嘧啶-2-基)巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例6：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-氟苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4e)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3e(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(2-氟苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4e，产率59.7％，m.p.137.5～138.8℃；
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因此，可确定上述化合物4e为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-氟苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例7：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-氟苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4f)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3f(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(4-氟苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得橙黄色固体4f，产率72.8％，m.p.83.5～84.9℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.76(s,1h),7.75(s,1h),7.14(d,j＝8.2hz,1h,h-11),6.99(d,j＝8.0hz,1h,h-12),6.87(t,j＝8.5hz,2h),6.83(s,1h),4.20(d,j＝40.8hz,3h),3.87(s,7h),3.16(s,2h),2.79(s,3h),2.17(d,j＝12.6hz,1h),1.21(d,j＝6.9hz,6h,h-16andh-17),1.19(s,3h),1.15(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.74,171.34,166.41,165.10,163.56,146.81,145.91,134.56,131.97,130.99,130.93,127.04,124.27,124.10,119.29,115.46,115.32,89.76,63.17,47.77,44.90,38.04,37.00,36.69,33.56,30.19,29.08,25.24,24.08,24.07,21.89,18.63,16.52.ir(kbr),v/cm-1:3414,2954,2218,1722,1616,1548,1469,1305,1246,1172,1105,1004,802,761.esi-msm/z:calcdforc33h36fn3o3s[m-h]-:572.25；found:572.10；
因此，可确定上述化合物4f为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-氟苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例8：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-溴苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4g)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3g(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(4-溴苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4g，产率78.9％，m.p.81.2～83.9℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.56(s,1h),7.28(s,1h),7.18(s,1h),7.16(d,j＝8.2hz,1h,h-11),7.02(s,1h,h-12),6.91(s,1h,h-14),6.86(s,1h),4.26(s,1h),4.21(s,1h),3.83(s,1h),3.33(s,1h),2.90(s,1h),2.86(s,1h),2.84(d,j＝6.9hz,1h),2.82(s,1h),2.32(s,1h),2.28(d,j＝10.6hz,1h),1.80(s,1h),1.74(s,2h),1.61(s,1h),1.31(s,1h),1.25(s,3h),1.23(d,j＝3.9hz,6h,h-16andh-17),1.22(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ179.28,173.51,173.44,164.94,158.76,146.87,145.81,134.69,131.00,127.04,125.09,124.26,124.02,119.19,116.01,92.33,63.58,47.78,44.84,38.03,36.99,36.52,33.57,30.15,28.74,25.23,24.10,21.79,18.62,16.41.ir(kbr),v/cm-1:3412,2594,2216,1724,1616,1537,1463,1244,1172,1124,1035,823.esi-msm/z:calcdforc33h36brn3o3s[m-h]-:634.23；found:634.00；
因此，可确定上述化合物4g为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-溴苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例9：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4h)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3h(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(2-甲氧基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4h，产率77.4％，m.p:144.2-145.1℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.04(s,1h),7.46(s,1h),7.17(d,j＝8.2hz,1h,h-11),7.04(d,j＝8.4hz,1h,h-12),7.02(s,1h),7.00(s,1h),6.88(s,1h),4.35(d,j＝23.2hz,2h),3.89(s,3h),3.43(s,2h),2.98(s,3h),2.91(s,3h),2.31(s,1h),2.22(d,j＝10.8hz,1h),1.75(d,j＝9.7hz,2h),1.63(s,1h),1.48(s,1h),1.26(s,3h),1.23(s,6h),1.20(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.48,167.77,165.98,162.90,157.12,146.89,145.86,134.72,132.62,130.51,127.07,125.18,124.26,124.05,120.75,115.47,111.66,97.10,62.53,55.46,47.84,44.88,38.03,37.05,36.75,36.70,33.57,31.66,25.28,24.10,21.92,18.64,16.59.ir(kbr),v/cm-1:3419,2929,2222,1724,1674,1533,1465,1381,1247,1172,1105,1045,756.esi-msm/z:calcdforc34h39n3o4s[m-h]-:584.27；found:584.10；
因此，可确定上述化合物4h为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例10：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4i)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3i(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4i，产率65.5％，m.p.101.8-102.7℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.02(s,1h),7.30(d,j＝7.7hz,1h),7.24(s,1h),7.14(s,1h),7.10(s,1h),6.97(s,1h),6.82(s,1h),4.18(s,2h),3.63(s,3h),3.27(s,3h),3.13(s,2h),2.79(s,3h),2.25(s,1h),2.14(s,1h),1.68(s,2h),1.54(s,1h),1.30(s,1h),1.20(d,j＝6.9hz,6h,h-16andh-17),1.17(s,3h),1.14(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.81,173.21,172.35,167.42,162.74,159.26,146.86,145.81,137.68,134.67,129.22,127.04,124.23,124.01,120.99,116.86,113.42,89.59,63.58,55.24,47.71,44.87,38.04,36.99,36.61,33.56,31.56,30.16,25.23,24.10,21.85,18.64,16.51.ir(kbr),v/cm-1:3464,2954,2204,1722,1645,1550,1465,1301,1242,1174,1126,1008,785.esi-msm/z:calcdforc34h39n3o4s[m-h]-:584.27；found:584.10；
因此，可确定上述化合物4i为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例11：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4j)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3j(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(4-甲氧基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4j，产率52.9％，m.p.133.8～134.5℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.72(d,j＝8.7hz,2h),7.12(d,j＝8.3hz,1h,h-11),6.97(d,j＝8.2hz,1h,h-12),6.82(s,1h,h-14),6.67(d,j＝8.5hz,2h),4.22(s,1h),4.15(s,1h),3.66(s,3h),3.10(s,1h),3.06(s,1h),2.94(s,1h),2.87(s,1h),2.79(d,j＝6.9hz,1h),2.77(s,1h),2.23(d,j＝12.1hz,1h),2.15(d,j＝13.7hz,1h),1.66(s,1h),1.65(s,1h),1.59(s,1h),1.52(d,j＝7.9hz,1h),1.41(s,1h),1.25(s,1h),1.21(s,3h),1.19(s,3h),1.15(s,3h),1.12(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.94,174.75,166.92,162.77,161.51,146.86,145.78,134.69,130.30,128.79,127.05,124.23,123.97,113.51,88.02,63.66,55.20,47.71,44.89,38.06,36.99,36.61,33.55,31.56,30.20,28.81,25.23,24.08,21.83,18.64,16.45.ir(kbr),v/cm-1:3414,2931,2204,1722,1612,1539,1471,1313,1253,1178,1122,804.esi-msm/z:calcdforc34h39n3o4s[m-h]-:584.27；found:584.10；
因此，可确定上述化合物4j为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-甲氧基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例12：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4k)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3k(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(2-羟基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4k，产率82.6％，m.p.92.6～93.8℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.06(s,1h),7.94(s,1h),7.77(s,1h),7.34(s,1h),7.18(s,1h),7.01(s,1h),6.88(s,1h),4.55(s,1h),4.43(s,1h),3.49(s,1h),3.43(s,1h),2.99(s,2h),2.92(s,2h),2.88(s,1h),2.87(d,j＝4.4hz,1h),2.83(s,1h),2.32(d,j＝12.3hz,1h),2.24(d,j＝12.6hz,1h),1.87(dd,j＝15.3,5.8hz,1h),1.79(s,2h),1.68(s,1h),1.31(s,3h),1.23(s,3h),1.22(s,6h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ179.48,167.26,163.16,157.05,146.72,145.98,135.46,134.52,130.14,127.07,124.27,124.17,120.80,120.18,116.79,93.31,62.45,48.06,45.01,37.99,37.06,36.85,36.69,33.57,31.79,30.11,29.35,25.27,24.09,21.94,18.62,16.64.ir(kbr),v/cm-1:3441,2954,1761,1606,1539,1328,1224,1166,1033,817,767；esi-msm/z:calcdforc33h37n3o4s[m-h]-:570.25；found:570.10；
因此，可确定上述化合物4k为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(2-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例13：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4l)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3l(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(3-羟基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4l，产率51％，m.p.88.4-89.3℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.38(s,1h),8.06(s,1h),7.65(s,1h),7.33(s,1h),7.16(s,1h),7.02(s,1h),6.88(s,1h),4.46(d,j＝26.5hz,3h),3.57(s,3h),2.98(s,2h),2.28(dd,j＝21.1,12.5hz,3h),1.78(s,3h),1.69(d,j＝16.3hz,3h),1.29(s,3h),1.23(s,3h),1.22(s,3h),1.21(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.40,162.95,160.10,154.46,146.85,145.88,134.93,134.65,127.06,126.21,125.19,124.25,124.11,117.3662.49,61.46,47.88,44.93,38.02,37.05,36.79,36.72,33.54,31.67,30.24,30.08,25.31,24.09,24.07,21.99,18.68,16.62.ir(kbr),v/cm-1:3441,2929,2368,1724,1606,1539,1463,1323,1269,1126,1008,819,765.esi-msm/z:calcdforc33h37n3o4s[m-h]-:570.25；found:571.25；
因此，可确定上述化合物4l为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例14：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4m)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3m(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(4-羟基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得棕色油状固体4m，产率67.8％，m.p.71.8-72.7℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.16(s,1h),7.98(d,j＝8.9hz,2h),7.16(d,j＝8.2hz,2h),7.00(s,1h),6.86(s,1h),4.39(d,j＝7.1hz,3h),2.97(s,1h),2.90(s,2h),2.28(dd,j＝29.3,13.1hz,3h),1.41(t,j＝7.1hz,4h),1.31(s,1h),1.29(s,3h),1.24(s,3h),1.23(s,6h),1.21(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.55,163.18,162.77,154.39,146.91,145.91,134.69,133.73,127.02,124.86,124.31,124.09,116.25,115.38,99.84,66.39,66.31,47.88,44.85,38.03,37.04,36.65,33.57,30.17,25.26,24.10,21.89,18.67,16.61.ir(kbr),v/cm-1:3446,2931,2220,1724,1645,1591,1510,1458,1263,1174,831.esi-msm/z:calcdforc33h37n3o4s[m-h]-:570.25；found:569.20；
因此，可确定上述化合物4m为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-羟基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例15：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-硝基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4n)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3n(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(3-硝基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4n，产率85.3％，m.p.90.7～91.5℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.71(s,1h),7.52(s,1h),7.18(s,1h),7.15(d,j＝8.3hz,1h,h-11),7.03(d,j＝8.1hz,1h,h-12),7.01(s,1h),6.84(s,1h),4.34(s,1h),4.28(s,1h),3.83(s,1h),3.38(s,1h),2.91(s,1h),2.83(s,1h),2.82(s,1h),2.81(s,1h),2.28(d,j＝12.5hz,1h),2.19(d,j＝13.1hz,1h),1.72(s,1h),1.70(s,1h),1.60(d,j＝8.6hz,1h),1.31(s,1h),1.25(s,2h),1.24(s,6h),1.22(s,3h),1.21(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.58,165.23,148.16,146.93,146.80,145.91,136.85,134.72,134.54129.83,127.07,127.03,125.98,124.30,124.12,123.80,66.39,62.54,61.63,47.84,44.88,38.08,38.00,37.01,33.58,33.55,29.73,25.24,24.10,21.9,18.69,16.55.ir(kbr),v/cm-1:3412,2954,2218,1724,1616,1533,1465,1348,1244,1172,1120,823.esi-msm/z:calcdforc33h36n4o5s[m-h]-:599.24；found:599.10；
因此，可确定上述化合物4n为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(3-硝基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
实施例16：
2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-甲基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯(化合物4o)的制备：
将3mmol嘧啶化合物3o(4-羟基-5-甲腈-2-巯基-6-(4-甲基苯基)嘧啶)、3mmol去氢枞酸溴乙酯溶于20mldmf中，再加入3mmol无水碳酸钾，室温搅拌下反应8-10小时，反应进程由tlc监控。待反应完全，将反应物倒入100ml冰水中，用冰醋酸酸化至无沉淀产生；将沉淀物过滤，水洗，干燥后将其纯化，得黄色固体4o，产率78.6％，m.p.106.3～108.7℃；
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.74(s,2h),7.14(s,1h),7.07(s,2h),7.00(s,1h),6.84(s,1h),4.60(s,1h),4.26(d,j＝36.2hz,2h),3.25(s,2h),2.96(s,1h),2.89(s,1h),2.80(s,3h),2.43(s,1h),2.31(s,3h),2.18(s,1h),1.70(s,2h),1.21(s,3h),1.20(s,6h),1.16(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ178.75,167.78,159.28,146.88,145.81,143.17,141.57,134.70,133.12(c-9),129.51(c-34,c-36),128.80(c-11),127.05(c-33,c-37),124.25,124.02,115.42,63.18,49.39,47.77,44.90,38.04,37.02,36.67,33.56,31.63,29.22,25.27,24.10,24.08,21.60,18.65,16.52.ir(kbr),v/cm-1:3441,2927,2208,1722,1653,1544,1462,1371,1296,1244,1178,1002,800,727.esi-msm/z:calcdforc33h36n4o5s[m-h]-:568.27；found:568.10.
因此，可确定上述化合物4o为2’-[4-羟基-5-甲腈-6-(4-甲基苯基)嘧啶-2-基]巯基去氢枞酸乙酯，其结构式如下式所示：
为说明本发明所述化合物的抗肿瘤作用，申请人对上述实施例2～16制得的化合物均进行了的抗肿瘤活性实验(以常用抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶为阳性对照)，并对上述实施例所制得的化合开展对正常细胞的毒性实验。
一、化合物的体外抗肿瘤活性测试
1.细胞的接种与培养
所选细胞株均置于37℃、5％co2的培养箱中，接种于含10％胎牛血清的dmem培养液中培养。用倒置显微镜观察细胞生长情况，细胞复苏后，通常传2-3代后，取处于对数生长期细胞用于实验。
2.化合物细胞水平的活性初筛
所用化合物纯度高，将所有化合物溶于1mldmso中配制成母液浓度10mm，依次稀释成所需的浓度进行细胞毒性实验，dmso终浓度不超过1‰。
3.细胞生长抑制实验(mtt法)
表1.化合物对不同肿瘤细胞株的半抑制率浓度(ic50,μm)
从表1可知，大部分化合物对hepg2、mcf-7、hct-116和a549四种癌细胞株具有较强的抗癌活性，说明在去氢枞酸骨架上引入嘧啶药效团后，抗肿瘤活性明显增强。化合物4b对四种癌细胞的抑制活性优于阳性对照5-氟尿嘧啶，对hepg-2、mcf-7、hct-116和a549癌细胞的ic50值分别为10.42±1.20、7.00±0.96、9.53±1.03和11.93±1.76μm。同时，大多数化合物对人肝细胞(lo2)表现出较低的细胞毒性，ic50>100μm。可见，在去氢枞酸骨架中引入嘧啶杂环，有利于去氢枞酸抗肿瘤活性的提高，可作为先导化合物，对其进一步研究。