一种高度多孔明胶微球的制作方法

本发明涉及一种高度多孔微球的合成，属于生物组织工程领域。

背景技术：

近几十年中，随着生物材料在疾病的诊断、治疗以及生物体组织器官的修复或替换等领域表现出广泛的应用前景，其研究也越来越来受到人们的重视。如今由于明胶具有良好的生物相容性，生物可降解性及亲细胞性被认为是最有潜力的组织工程支架材料之一，但是由于传统微球的明胶支架表面比值较低,密度高,弹性低,防止细胞增殖和扩散，明胶微球内部降解较慢影响了其在组织工程方面的应用。

技术实现要素：

本发明制备了一种具有良好生物相容性的高度多孔明胶微球。本发明高度多孔明胶微球合成方法的技术方案是：edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)与明胶微球冷冻交联形成具有优良生物相容性的高度多孔明胶微球，具体步骤如下：

1.3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。

2.将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌(磁子选用中号)700r/min，55℃，30min。

3.30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。

4.静置5min。

5.这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，我们将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球用小铁勺转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮(可重复利用)30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)

6.用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，在无水乙醇中储存备用。

7.随后置入含有50mmedc0.49g和25mmnhs0.15g50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

有益效果：本发明明胶是胶原蛋白通过水解而制成的，含有多种氨基酸，来源广泛，价格低廉，理化性能可塑性强，具有生物相容性，生物可降解性及亲细胞性等优点，采用冷冻交联的方法合成的高度多孔微球，具有良好的生物相容性，其内部含有多孔，允许细胞长入且由于微球吸水可以将外部营养吸收到微球内部，多孔微球内部细胞可以利用其营养不易死亡，同时利用细胞外基质将各个微球黏附在一起，可以作为组织工程/修复支架材料等，具有有益的技术效果和广泛应用前景。

附图说明

图1和图2为实施例1所得的高度多孔明胶微球的图；

图3为实施例1所得的多孔微球的内部结构图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例2：2g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干(重复2次)得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例3：同实施例1，转数改为600r/min、800r/min、900r/min制备出不同粒径的明胶微球。

实施例4：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(此步骤在常温中进行)。

实施例5：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例6：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例7：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例8：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。加入0.5g羟基磷灰石，使混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中3min，拿出，放到-20℃，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例9：3g明胶a型和20ml的双蒸水在250ml的烧杯中混匀，放入55℃烘箱溶解30min。混合液充分混匀。将混合液缓慢倒入250ml的含有60ml石蜡油和20ml的食用油的烧杯中，在搅拌器上磁子搅拌700r/min，55℃，30min。30min后，暂停搅拌，将250ml烧杯快速直接放在2000ml的烧杯正中央，继续在搅拌器上搅拌，同时周边放上冰，降温，使微球冷却，700r/min，30min。静置5min。这时微球与油出现分层，将油倒掉，由于微球周围还有大量油，然后将其倒入150目的筛子中，用20ml二氧六环冲洗掉微球周围大量的油，然后将筛子中的微球转移到含有10ml二氧六环的250ml的烧杯中浸泡30min，倒掉二氧六环，加入10ml丙酮30min，重复3次。(注意二氧六环和丙酮最好放入4℃遇冷，二氧六环不要重复使用，丙酮可重复使用，此步骤一定要在通风橱里操作)用20ml无水乙醇洗三次，每次1h，每隔10min，手打摇晃几次，准备两个250ml的烧杯，将微球倒入50目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的的微球会自动过滤下来，大的微球弃之，同理，将微球倒入150目筛子中，然后放入烧杯中，在摇晃的过程中，我们所需要的微球会保留在筛子中，小的微球会过滤出来，用50目和150目的筛子分选出目的微球，随后置入含有50mmedc和25mmnhs50mlpbs溶液中(4-0℃，最好0℃)，置入液氮中，冷冻交联12h解冻(重复冷冻交联一次)，用0℃无菌双蒸水冲洗一遍，沉淀5分钟，倒掉水，剩余的水刚好摸过微球，-20℃冷冻，冻干得多孔微球(重复2次，每次浸透微球，注意此步骤一定要在冰上进行)。

实施例10：同实施例9，分别在液氮、-80℃、-20℃中冷冻交联。

实施例11：精确称取一定量的冻干多孔明胶微球，用75％的乙醇杀菌，随后用ph＝7.4无菌pbs冲洗5遍，每次1h，最后高度多孔微球与细胞进行共培养。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。