3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用的制作方法

本发明涉及生化领域，具体地，涉及3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用。

背景技术：

当甾体类化合物导入双键后，如在抗炎甾体激素药物母核的c1,2位导入双键后，能成倍地增加其抗炎作用，如醋酸可的松c1,2位上导入双键后行成的醋酸脱氢可的松，其抗炎作用提高了3-4倍，并且减少了由钠滞留而带来的副作用；还有许多临床上常用的重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及到微生物c1,2位的脱氢反应，包括氢化泼尼松(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、帕拉米松(paramethasone)、倍他米松(batemethasone)、氟可龙(fluocortolone)、氟轻松(fluocinolone)、曲安西龙(triamcinolone)、甲基强的松龙(medrol)等。

3-甾酮-1,2-脱氢酶(ksdd)是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)为辅因子，可以催化3-甾酮类固醇母核a环1,2位的碳碳单键(c-c)脱氢变成碳碳双键(c＝c)。如下反应过程所示，ksdd催化雄烯二酮(4-ad)的c1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(add)。

ksdd酶已经在很多降解甾醇的细菌中被发现，如简单节杆菌，紫红红球菌、睾丸酮假单胞菌、珊瑚诺卡氏菌、耻垢分支杆菌。由于不同来源ksdd酶，他们它们的氨基酸序列不同，蛋白酶构象存在差异性，导致底物的专一性也不同。

从4-ad转化而来的add是合成类固醇药物的重要前体，例如避孕药，雌激素和孕激素。尽管化学方法已用于δ1-脱氢将不饱和度引入醋酸氢化可的松(ha)的1,2-位时，醋酸泼尼松龙(pa)的抗炎活性提高了三到四倍。然而，由于类固醇结构的复杂性，传统的化学方法难以专门修饰类固醇中间体，化学方法存在转化率低，副产物多，环境污染等缺陷。高效酶法工艺制备类固醇中间体，与激素药物的多步化学合成相比，效率高，产物纯度高。因此，酶促转化由于其温和的反应条件，高效率和特异性(区域选择性和立体选择性)而引起了广泛关注。

国内国外对ksdd酶的研究角度不同。国内主要是筛选菌种、基因的异源表达和酶催化反应体系的优化。国外主要集中于对分子机理的探讨，主要表现为酶的分子特性、催化特性、光谱特性分析等。国外学者完成了不同菌属来源的ksdd的分子特性、催化特性和光谱特性的研究。并通过对ksdd氨基酸序列比对，进行了fad结合域、酶的活性中心等位点的推定。pseudomonastestosterone的ksdd基因通过质粒prg1在大肠杆菌中的表达，表达的蛋白仅有3.3％是可溶的，其余的都是以包涵体的形式存在。arthrobactersimplex的ksdd基因通过大肠杆菌-链霉菌的穿梭质粒，在streptomyceslividans中表达，在添加和不添加底物4-ad的情况下，酶活力提高了100倍。通过pdex-3质粒将rhodococcusrhodochrous的基因ksdd在大肠杆菌中表达，转化细胞表达出可溶性的ksdd，且表达量是出发菌株的30倍。将rhodococcuserythropolis的基因ksdd通过psdh305质粒和pet3b质粒实现了该基因在大肠杆菌中的表达，酶活分别为1.38u/mg和6.0u/mg。将arthrobactersimplex的ksdd基因通过载体pwb980在枯草芽孢杆菌wb600中表达，胞内外酶活分别为110mu/mg和15mu/mg，约为出发菌的30倍，以4-ad为底物，转化40h达到最大转化率为45.5％。将arthrobactersimplex的ksdd基因克隆到质粒pet22b和pet32a在e.colibl21中的异源表达，酶活分别为35.29mu/mg和25.67mu/mg。将分枝杆菌nwib-01的ksdd通过puc18在e.colidh5α中表达，酶活达21.34mu/mg。但这些酶活力较低。

3-甾酮-1,2-脱氢酶(ksdd211)是来自于分枝杆菌属mycobacteriumsp.hgms2，目前还未相关克隆、氨基酸序列和酶活力及应用报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种3-甾酮-1,2-脱氢酶，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的氨基酸序列为seqid.2。

在上述3-甾酮-1,2-脱氢酶中，其中，所述3-甾酮-1,2-脱氢酶的n端带有his6标签。

本发明还提供了一种表达上述3-甾酮-1,2-脱氢酶的基因序列，所述基因序列为seqid.1。

本发明还提供了一种表达载体，其中，所述表达载体用于表达上述3-甾酮-1,2-脱氢酶。

本发明还提供了上述3-甾酮-1,2-脱氢酶在制备1,4-雄烯二酮中的应用。

本发明的ksdd211能够催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-ad)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add，1,4-雄烯二酮)，tlc分析验证了其高酶学活性。hplc分析ksdd211催化反应表明，ksdd211在18h内完全转化4-ad生成add。

附图说明

图1示出了琼脂糖胶分析pcr扩增ksdd211基因产物，从右到左依次为温度梯度50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。

图2示出了琼脂糖凝胶图分析prsv-ksdd211/dh5a菌落pcr，其中1#、3#、5#、7#、8#有目的条带，从中选取3#、7#摇菌测序。

图3示出了his-ksdd211蛋白表达条件优化，其中，图3中的(a)、(b)、(c)、(d)为不同表达条件下的sd-page图。

图4示出了his-ksdd211akta图，其中6#-22#为目的蛋白洗脱峰。

图5示出了ksdd211蛋白的纯化。其中，(a)：tev酶切his-ksdd211蛋白his标签后反挂ni-ntaakta图；(b)：tev酶切his-ksdd211蛋白前后sds-page分析，泳道tev切：30℃条件下tev酶切his-ksdd2113h后样；泳道tev未切：未加tev酶的his-ksdd211样；泳道2-5：tev酶切完反挂ni-nta纯化得到的蛋白样2#、3#、4#、5#。

图6示出了阳离子纯化ksdd211sds-page图。(a)：反挂ni-nta收集的蛋白样用阳离子交换柱纯化后akta图；(b)：阳离子纯化sds-page胶图，泳道f-t：阳离子柱上样流穿液；其他泳道对应akta纯化图谱中的收集管编号。

图7示出了his-ksdd211酶活测定曲线。横坐标为时间(s)，纵坐标为吸光度(abs)。

图8示出了ph对酶活影响。横坐标为ph值，纵坐标为酶活相对量。

图9示出了his-ksdd211催化4-ad生成add。(a)：0h和12h反应情况；泳道1：标样底物4-ad；泳道2：0h反应情况；泳道3：12h反应情况；泳道4：标样产物add；(b)：16h和19h反应情况；泳道1和4：标样底物ad和标样产物add；泳道2和3：分别是16h和19h反应情况。

图10示出了标样底物4-ad与标样产物add摩尔比为1:1的混合物hplc图。

图11示出了his-kstd211催化4-ad生成add。(a)、(b)、(c)、(d)：催化反应进行0h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、36h反应情况以及反应液中4-ad与add的含量。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明对分枝杆菌hgms2的的基因进行了扩增和测序，提供一种新型3-甾酮-1,2-脱氢酶基因序列(seqidno.1)。

本发明的3-甾酮-1,2-脱氢酶(ksdd211)基因序列是来自分枝杆菌hgms2。通过对分枝杆菌hgms2的全基因组测序，从基因组中以pcr的方法提取3-甾酮-1,2-脱氢酶基因(seqidno.1)。

一种上述基因的编码蛋白质，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

由于遗传密码子的简并性，本发明的3-甾酮-1,2-脱氢酶基因还可以是编码由seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他核苷酸序列。

本发明构建了大肠杆菌的表达载体，把克隆出的3-甾酮-δ¹-脱氢酶(ksdd211)的基因通过prsv表达载体后导入大肠杆菌,进行诱导表达。成功实现了对3-甾酮-δ1-脱氢酶的高表达，探索了其酶特性，酶比活为51mu/mg。

大肠杆菌异源表达得到的ksdd211酶的n-端带有his6标签，有利于亲和纯化，his-标签经tev蛋白酶切除后，再经二次ni-nta亲和层析和阳离子交换柱层析制得高纯度ksdd211酶液。ksdd211能够催化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-ad)反应生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)，tlc分析验证了其高酶学活性。hplc分析ksdd211催化反应表明，ksdd211在18h内完全转化ad生成add。

下面结合具体的实施例进行说明。

实施例1：pcr扩增ksdd211基因

从分支杆菌(mycobacteriumstrainhgms2gl)基因组中，利用pcr扩增ksdd211目的基因片段大小为1692bp，pcr引物为：前引物ksdd211-f:5’-gtaggatccatgactgaacaggactac-3’和后引物ksdd211-r:5’-gcagaattctcaggcctttccagcgag-3’，做温度梯度pcr分别为：50℃、52℃、54℃、56℃、60℃。跑琼脂糖胶分析结果如图1所示。

选取56℃和60℃条件下的pcr产物用于酶切连接。酶切反应体系为50μl：pcr产物：1ug；bamhⅰ2u；ecorⅰ2u；10×kbuffer5ul；h2o1ul；37℃，时间：3h。反应产物用pcr纯化试剂盒(天根生物科技是，北京)纯化，用于同prsv载体纯化。prsv载体采用上述同样方法和体系进行酶切和纯化。酶切后载体prsv和目的片段ksdd211通过t4连接酶反应连接，20μl反应体系在4℃，过夜连接。表1示出了prsv-ksdd211连接体系。

表1

连接反应液转化到大肠杆菌dh5a，冰上放置30min后，42℃水浴锅中热击90s，冰上再放置2min；均匀涂布到平板上，室温放置10min，将涂布好的平板放到37℃培养箱中，倒置过夜培养。第二天进行阳性重组子的挑选。

在平板上观察生长的菌体，选择个头大的菌体编号，选取10个单菌落；在超净台中取出10支1.5mlep管，各加入100μl的lb培养基，对应10个菌落给ep管编号。用白色小枪头挑取单菌落先到对应的pcr液中涮3～5下，再将枪头打到对应的ep管中，依次挑取10个单菌落。将ep管放到37℃、200rpm摇床中培养1h取出；将pcr液(25μl反应体系)放到pcr仪中扩增，完成后跑1％的琼脂糖凝胶，判断克隆结果。用前引物seq-f:5’-taatacgactcactataggg-3’和后引物t7-r:5’-gctagttattgctcagcgg-3’，做pcr，pcr片段大小将近2200bp，电泳结果如图2所示。

实施例2：ksdd211基因测序

在武汉铂尚测序公司测序，测序结果分析正确，ksdd211基因见seqidno.1。kstd211氨基酸序列见seqidno.2。

实施例3：his-ksdd211蛋白表达优化

将prsv-ksdd211转化到大肠杆菌bl21感受态细胞，培养100mlprsv-ksdd211-bl21到od600＝0.8-10,分装到15支试管中，每管5ml，分成三组，每组5支试管，分别对应三个温度梯度：18℃、25℃、37℃，每个温度对应5个异丙基硫代半乳糖苷(iptg)浓度分别为：0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm；在不同的时间段：5h、9h、24h分别对每支试管取样1ml，矫正od600＝1.0，4000rpm、10min、4℃收集菌体。离心去掉上清，加100μl50mmtris-hcl(10％甘油、ph8.0)，超声细胞破碎仪破碎细胞，13000rpm，10min，4℃离心，取40μl上清于1.5mlep管中，加入10μl5×loadingbuffer，vortex混匀；向沉淀中加入50μl1×loadingbuffer，用枪头吹吸vortex混匀，置于95℃加热10min，13000rpm、10min离心，跑sds-page胶(蛋白marker单位为：kd，以下所有sds-page中都适用)，如图3所示，目的蛋白大小：63.2kd。结果分析：蛋白表达量较少，重新优化蛋白表达条件，增加表达量。跑sds0-page胶分析，结果如图3所示。由图可知，在25℃、0.6mmiptg、24h时，菌种上清蛋白表达量最多，为此蛋白最优表达条件。

实施例4：his-ksdd211蛋白纯化

由于目的蛋白带有6个his标签，选择用ni-nta纯化。his-ksdd211蛋白大小为：63.2kd，培养4l的菌体破胞进行纯化。结果分析如图4所示。收集6#-22#用tev酶切掉目的蛋白上的his标签，进行后续纯化。

收集上述ni-nta纯化的目的蛋白，用tev酶切掉目的蛋白上的his标签，过脱盐柱，收集洗脱峰，反挂ni-nta，流穿中即为切掉his标签的目的蛋白。sds-page胶分析如图5所示，ksdd211蛋白大小为60.6kd。结果分析：反挂ni-nta后，ksdd211蛋白仍有少许杂蛋白，进一步通过阳离子交换柱进行纯化。

阳离子交换柱纯化ksdd211蛋白。收集上述2#-5#蛋白样进行阳离子交换柱纯化，纯化结果如图6所示。

结果分析：阳离子交换柱纯化后的24#-31#不纯；32#-42#收集混匀浓缩点晶体。

实施例5：his-ksdd211酶活性测定及反应条件优化

his-ksdd211酶活：1ml反应体系包括：1.5mm的pms，40μm的2,6-二氯酚靛酚(dcpip)，500μm的4-ad(母液为：100mm4-ad甲醇溶液)，50μl的酶液，加50mmtris-hcl(ph7.0、10％甘油)补充到1ml，做三组平行实验。用nanodrop2000测定反应体系的吸光度变化，程序为：30s-120s-600nm，酶活测定曲线如图7所示，蛋白的浓度为：0.42mg/ml。将各数据代入酶活计算公式：δa/δt×v/(ξ×l)(n：酶液稀释倍数；v：酶活反应体积；δa：吸光度增加值；ξ600：在600nm处，dcpip摩尔吸光系数(l/mol*cm)；δt：反应时间；l：比色皿直径)，得1.07×10^-3u。酶活单位定义：将在1分钟内还原1μmol2,6-二氯酚靛酚所需的酶量定义为一个酶活单位u。计算蛋白比活为：35mu/mg。

ph对his-ksdd211酶活的影响：设定ph梯度为：4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，用上述测定方法在不同ph条件下测定酶活，绘制ph对酶活变化影响曲线，如图8所示。由图8可知：ph＝7.5时为该酶的最适ph。

实施例6：his-ksdd211酶蛋白催化ad生成add反应

his-ksdd211催化反应：10ml酶液(缓冲液50mmtris-cl，ph8.0，10％甘油，50μl4-ad(甲醇溶液143mm)，反应条件：30℃、160rpm，反应一定时间后取1ml样加等体积乙酸乙酯萃取，挥干乙酸乙酯后加10μl乙酸乙酯溶解，点薄层色谱(tlc)板，如图9所示。结果分析：表达的目的蛋白his-ksdd有活性，随着反应的进行19h时4-ad转化率将近50％。

标样底物4-ad与标样产物add摩尔比为1:1的混合物hplc图如图10所示，流动相为：甲醇：水＝6:4，底物4-ad的保留时间为10.6min，产物add的保留时间为6.4min。将萃取反应液挥干乙酸乙酯后，加100μl甲醇：水＝6:4流动相溶液溶解反应物，进行hplc分析，流动相为：甲醇：水＝6:4。分析结果如图11所示：结果分析：反应12h时底物转化率达到97％，18h4-ad转化完全；在14h出现杂质2(保留时间为13min-14min)，随着反应时间的延长产物add减少，杂质2增加，而杂质1在整个反应体系中都存在。结果分析：反应12h后ad转化率达到93％，到16h时出现杂质2，24h4-ad转化完全。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110>湖北工业大学

<120>3-甾酮-1,2-脱氢酶及其应用

<130>hp190992lz

<141>2020-04-22

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1692

<212>dna

<213>分枝杆菌hgms2()

<400>1

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<210>2

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<213>分枝杆菌hgms2()

<400>2

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151015

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<213>人工序列()

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<213>人工序列()

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<213>人工序列()

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